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Assay and array technologies for G-protein coupled receptors.Bailey, Kelly January 2009 (has links)
The overall aim of this thesis is to investigate strategies to aid in the measurement of G-protein coupled receptor (GPCR) activity for high-throughput screening and sensing applications. GPCRs are cell surface receptors which have seven membrane spanning domains. They are the largest family of membrane proteins in the human genome and are involved in a number of physiological and pathophysiological pathways. They are the most widely targeted protein family for therapeutics being the target for over 30% of the currently available prescription drugs (Jacoby et al. 2006). For this reason commercial interest and investment into compound screening using these receptors as targets is of high importance in lead drug discovery. Additionally, the extensive ligand range of the GPCR superfamily, which includes light, odorants/ volatiles, neurotransmitters and hormones, make them an attractive biological recognition element in biosensor applications. This thesis demonstrates the functional expression of the H1-histamine, M2-muscarinic and α₂ₐ-adrenergic receptors of the G-protein coupled receptor family, along with their associated G-proteins (Gα, Gβ and Gγ). Expression was achieved using the Sf9/baculovirus expression system. The G-proteins were successfully incorporated into an assay system using time-resolved fluorescence resonance energy transfer (TRFRET). TR-FRET was used in order to create a homogeneous assay format capable of monitoring GPCR activation through the movement of the G-protein subunits. Fluorescence changes in the TR-FRET assay indicated a change in distance between the Gα subunit and Gβγ dimer. The separation of the Gα subunit and the Gβγ dimer after activation resulted in a significant decrease in TR-FRET measurement. The homogeneous set-up of the TR-FRET assay could potentially be adaptable to an array based format. This thesis describes the capture of vesicles containing functional GPCRs onto a solid substrate via the specific interaction between complementary oligonucleotides. GPCR presence and function within the immobilized vesicles, was demonstrated using fluorescent ligands. Further to this, alternative lipid hosts (to the vesicles), known as cubosomes, were introduced. When tagged with an oligonucleotide, these cubosome particles were also shown to immobilize site specifically onto a complementary oligonucleotide surface. / http://proxy.library.adelaide.edu.au/login?url= http://library.adelaide.edu.au/cgi-bin/Pwebrecon.cgi?BBID=1369537 / Thesis (Ph.D.) -- University of Adelaide, School of Molecular and Biomedical Science, 2009
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Assay and array technologies for G-protein coupled receptors.Bailey, Kelly January 2009 (has links)
The overall aim of this thesis is to investigate strategies to aid in the measurement of G-protein coupled receptor (GPCR) activity for high-throughput screening and sensing applications. GPCRs are cell surface receptors which have seven membrane spanning domains. They are the largest family of membrane proteins in the human genome and are involved in a number of physiological and pathophysiological pathways. They are the most widely targeted protein family for therapeutics being the target for over 30% of the currently available prescription drugs (Jacoby et al. 2006). For this reason commercial interest and investment into compound screening using these receptors as targets is of high importance in lead drug discovery. Additionally, the extensive ligand range of the GPCR superfamily, which includes light, odorants/ volatiles, neurotransmitters and hormones, make them an attractive biological recognition element in biosensor applications. This thesis demonstrates the functional expression of the H1-histamine, M2-muscarinic and α₂ₐ-adrenergic receptors of the G-protein coupled receptor family, along with their associated G-proteins (Gα, Gβ and Gγ). Expression was achieved using the Sf9/baculovirus expression system. The G-proteins were successfully incorporated into an assay system using time-resolved fluorescence resonance energy transfer (TRFRET). TR-FRET was used in order to create a homogeneous assay format capable of monitoring GPCR activation through the movement of the G-protein subunits. Fluorescence changes in the TR-FRET assay indicated a change in distance between the Gα subunit and Gβγ dimer. The separation of the Gα subunit and the Gβγ dimer after activation resulted in a significant decrease in TR-FRET measurement. The homogeneous set-up of the TR-FRET assay could potentially be adaptable to an array based format. This thesis describes the capture of vesicles containing functional GPCRs onto a solid substrate via the specific interaction between complementary oligonucleotides. GPCR presence and function within the immobilized vesicles, was demonstrated using fluorescent ligands. Further to this, alternative lipid hosts (to the vesicles), known as cubosomes, were introduced. When tagged with an oligonucleotide, these cubosome particles were also shown to immobilize site specifically onto a complementary oligonucleotide surface. / http://proxy.library.adelaide.edu.au/login?url= http://library.adelaide.edu.au/cgi-bin/Pwebrecon.cgi?BBID=1369537 / Thesis (Ph.D.) -- University of Adelaide, School of Molecular and Biomedical Science, 2009
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Use of a purple non-sulphur bacterium, Rhodopseudomonas palustris, as a biocatalyst for hydrogen production from glycerolXiao, Ning January 2017 (has links)
This project was aimed to use a purple non-sulphur bacterium, Rhodopseudomonas palustris, as a biocatalyst for hydrogen production, from the waste of biodiesel manufacturing, crude glycerol. The goal of this project was to understand the fundamentals relevant to scaling up the process and developing an off the shelf product. The first objective was to determine the ability of R. palustris to generate hydrogen by non-growing cells in comparison to that by growing cells. Similar average hydrogen production rates and energy conversion were found for both processes but a significant difference in the hydrogen yield was observed. Hydrogen production reached ~ 80 % of the theoretical maximum hydrogen yield by non-growing R. palustris, about eight-fold of that reached by growing R. palustris. The high yield suggested that it is economically appealing to use non-growing R. palustris as the biocatalyst for continuous hydrogen production. To accomplish the proposed scale-up systems, understanding its product formation kinetics is the key. It was found that the hydrogen production rate is not growth-associated and depends solely on the dry cell mass with a non-growth associated coefficient of 2.52 (Leudeking–Piret model dP/dt=2.52 X). Light is vital for hydrogen production by non-growing R. palustris, in terms of light intensity and wavelength range. It was found that excessive or insufficient light intensity may constrain the performance. Only photons of light with appropriate wavelengths can excite cytochrome bacteriochlorophyll complexes II in R. palustris to generate hydrogen. Among white LEDs, infrared LEDs, and incandescent light bulbs, at the same light intensity, infrared LEDs gave the best results in the H2 production rate and energy conversion by non-growing cells, 22.0 % ± 1.5 % higher than that with white LEDs and around 25-30 times of that by incandescent light bulbs. It was found that non-growing R. palustris can be immobilised in alginate beads to give similar H2 production rates as that by cells suspended in media. This preliminary result pointed the direction of developing an off the shelf product of immobilised non-growing R. palustris as a biocatalyst for continuous hydrogen production.
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Production de bioéthanol à partir de biomasse lignocellulosique en utilisant des enzymes cellulolytiques immobilisées / Bioethanol Production from Lignocellulosic Biomass using Immobilized Cellulolytic EnzymesPeriyasamy, Karthik 19 March 2018 (has links)
L'objectif global de cette étude était de produire du bioéthanol à partir de biomasse lignocellulosique en utilisant des enzymes libres ou immobilisées de type xylanase, cellulase et β-1,3-glucanase. L'isolement de la souche AUKAR04 de Trichoderma citrinoviride a permis de produire par fermentation solide ces trois enzymes à un taux de 55 000, 385 et 695 UI / gd, respectivement. L’activité biochimique des enzymes libres a été caractérisée en faisant varier différents paramètres : pH, température et concentration en cations métalliques, et les paramètres cinétiques correspondants ont été identifiés. Par la suite, les enzymes ont été immobilisées en phase solide, soit sous forme d’agrégats sans support de type (combi-CLEA), soit par association avec des nanoparticules magnétiques bifonctionnalisées (ISN-CLEA). Ces dernières ont fourni de meilleures performances en termes de stabilité thermique, d’activité et d’aptitude à réutilisation après un temps de conservation prolongé. Le substrat végétal utilisé (SCB : bagasse de canne à sucre) a été prétraité chimiquement par cuisson à l'ammoniac, permettant d’éliminer 40% de la lignine initiale tout en préservant 95% de glucane, 65% de xylane et 41% d'arabinane. L’hydrolyse enzymatique du substrat prétraité a permis une conversion de la cellulose en 87% de glucose, et une conversion des hémicelluloses (arabinoxylanes) en 74% de xylose et 64% d'arabinose, chiffres notoirement supérieurs à l'activité des enzymes libres. L'analyse chimique et structurale du substrat a été faite par spectrométrie ATR-FTIR et DRX, et par analyse TGA. L’étude FTIR a prouvé l’efficacité du traitement enzymatique en montrant que les hémicelluloses et la cellulose subissent une dépolymérisation partielle par l’action simultanée des trois enzymes immobilisées dans les ISN-CLEA. L’étude TGA a montré que la stabilité thermique des échantillons prétraités à l'ammoniac puis traités par des enzymes est notoirement améliorée. L’analyse DRX a montré que l'indice de cristallinité du substrat prétraité à l’ammoniac puis traité par l'ISN-CLEA a augmenté de 61,3 ± 1%, par rapport au substrat avant traitement enzymatique. La fermentation par la levure Saccharomyces cerevisiae LGP2Y1 utilisée en monoculture, à partir d’un hydrolysat enzymatique contenant 103,8 g / L de glucose, a produit 42 g / L d'éthanol en 36 h de fermentation. Le rendement métabolique global atteint ainsi environ 79% du rendement théorique. La fermentation en co-culture avec Saccharomyces cerevisiae LGP2Y1 et Candida utilis ATCC 22023 d’un hydrolysat à 107,6 g / L de glucose et 41,5 g / L de xylose a produit 65 g / L d'éthanol en 42 h de fermentation. Ainsi, en co-culture fermentaire, le rendement métabolique global atteint environ 88 % du rendement théorique. / The overall objective of the study was to produce bioethanol from lignocellulosic biomass by using free and immobilized xylanase, cellulase and β-1, 3-glucanase. Specifically, this study was focused on the isolation of Trichoderma citrinoviride strain AUKAR04 and it produces xylanase (55,000 IU/gds), Cellulase (385 IU/gds) and β-1, 3-glucanase (695 IU/gds) in solid state fermentation. Then the free enzymes were biochemically characterized such as effect of pH, temperature and metal ion concentration and kinetics parameters. Then the enzymes were subjected to two types of immobilization using carrier-free co-immobilization (combi-CLEAs) method and immobilized on bifunctionalized magnetic nanoparticles (ISN-CLEAs) with higher thermal stability, extended reusability and good storage stability. Liquid ammonia pretreatment removed 40% lignin from the biomass and retained 95% of glucan, 65% of xylan and 41% of arabinan in sugarcane bagasse (SCB). SCB was enzymatically hydrolyzed and converted to 87% glucose from cellulose and 74% of xylose, 64% of arabinose from the hemicelluloses which is remarkably higher than the activity of the free enzymes. Chemical and structural analysis of SCB was done by ATR-FTIR, TGA and XRD. FTIR result showed a successful pretreatment of the SCB raw material. It showed that hemicelluloses and cellulose are partially depolymerized by the action of xylanase, cellulase and β-1,3-glucanase in ISN-CLEAs. TGA studies showed that the thermal stability of the ammonia pretreated and enzymatically treated samples have improved remarkably. XRD results showed that the crystallinity index of the ISN-CLEAs treated SCB increased to 61.3±1% when compared to the ammonia-treated SCB. Mono-culture fermentation using Saccharomyces cerevisiae LGP2Y1 utilized SCB hydrolysate containing 103.8 g/L of glucose and produced 42 g/L ethanol in 36 h of fermentation. The overall metabolic yield achieved was about 79% of theoretical yield. Co-culture fermentation using Saccharomyces cerevisiae LGP2Y1 and Candida utilis ATCC 22023 utilized SCB hydrolysate containing 107.6 g/L of glucose and 41.5 g/L xylose and produced 65 g/L ethanol in 42 h of fermentation. The overall metabolic yield in co-culture fermentation achieved was about 88 % of the theoretical yield.
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Caracterización de levaduras nosaccharomyces para la producción de tequila con un perfil aromático específico / Caractérisation des levures non-saccharomyces pour la production de la tequila avec un profil de saveur spécifiqueSegura García, Luis Eduardo 29 June 2016 (has links)
Ce travail de thèse traite de l'étude de levures non-Saccharomyces (Kluyveromyces marxianus et Pichia kluyveri) du point de vue physiologique lors de la fermentation de moût à base de jus d’agave pour l’obtention de tequila. Il consiste à déterminer comment différents facteurs tels que la source de carbone, d'azote, les concentrations de minéraux (calcium et magnésium) présent dans le milieu, l'aération et la température affectent le métabolisme de la levure et provoque des changements dans la production de composés volatiles durant la fermentation qui peuvent contribuer positivement à la boisson alcoolisée. Les levures utilisées au cours de cette étude ont été obtenues à partir de la collection de microorganismes du CIATEJ, qui ont été isolées à partir de différents procédés de fermentation artisanale de mezcal des états de Oaxaca, Guerrero et San Luis Potosi au Mexique. Sur la base de connaissances préalables disponibles dans la littérature qui démontrent que ces levures non-Saccharomyces sont de bonnes productrices de composés volatiles ainsi que des résultats obtenus, une utilisation de ces levures dans le procédé de fermentation alcoolique pour la production de tequila est considérée. Les résultats montrent que les levures non- Saccharomyces étudiés sont affectées par tous les facteurs étudiés, ils doivent donc être considérés et contrôlés durant le procédé de fermentation pour obtenir la production des composés volatiles recherchés. Les souches étudiées présentent un certain potentiel qui leur permet de se positionner comme possible candidat pour réaliser une fermentation de manière indépendante sans avoir besoin de la présence de Saccharomyces cerevisiae, ou en co-culture avec S. cerevisiae pour obtenir dans les deux cas une tequila plus aromatique par rapport aux produits qui sont actuellement disponibles sur le marché. La connaissance détaillée des besoins physiologiques de la levure, nous donne la possibilité de modifier les composés volatiles présents dans la boisson alcoolisée, en contrôlant les paramètres au cours du procédé de fermentation. / The present work aimed to study how factors such as carbon and nitrogen source, calcium and magnesium concentration (in the medium), aeration or temperature disturb the metabolism of non-Saccharomyces yeasts (Kluyveromyces marxianus and Pichia kluyveri), specifically their impact on the production of volatile compounds during alcoholic fermentation of agave must employed in Tequila elaboration process. The used yeasts were obtained from the collection of CIATEJ strains, which were isolated from artisanal mezcal fermentation processes from the states of Oaxaca, Guerrero and San Luis Potosi in Mexico. It is intended to use the information generated and then using these yeasts in alcoholic fermentation processes for the production of tequila. Based on prior knowledge that non-Saccharomyces yeasts are good producers of volatile compounds desired in alcoholic beverages requested by consumers and the results of this study, the use of these strains is considered for tequila production. The results obtained in the present study revealed that all tested factors disturbed volatile compound production in these non- Saccharomyces yeasts and therefore need to be considered to drive fermentation processes aiming the production of a more aromatic beverage. Some yeast strains showed good potential to perform fermentation without or in co-culture with S. cerevisiae obtaining in both cases a product with more desired flavors compared to products currently on the market. The knowledge about the physiological needs of these yeasts gives the opportunity to modify the composition of the alcoholic beverage, only by controlling the parameters during the fermentation process.
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Hierarchically Porous Silica Materials for the Encapsulation of Molecules of Interest / Matériaux silicatés à porosité hiérarchisée pour l'encapsulation de molécules d'intérêtsRiachy, Philippe 14 March 2016 (has links)
Ce travail porte sur la préparation de matériaux silicatés à porosité hiérarchisée pour l'encapsulation de molécules d'intérêt dans le domaine de la pharmacie et en tant que biocatalyseur. Afin d’atteindre cet objectif, les nano-émulsions sont choisies comme empreinte pour créer les macropores du matériau en raison de la taille homogène et réduite des gouttelettes de l’émulsion (inférieure à 100 nm). Pour cela le système Remcopal 4/décane/eau est investi en déterminant les conditions les plus optimales de formation de nano-émulsion, via les méthodes d'inversion de phases. L’ajout de micelles aux nano-émulsions ne déstabilise pas les émulsions et permet la formation d’un réseau de mésopores organisés selon une symétrie hexagonale. Les matériaux hybrides issus des matériaux poreux contenant encore la phase organique sont dopés par le ketoprofène en vue d’étudier la libération de ce dernier. Celle-ci se révèle sensible au pH. De plus, cette étude de la libération du kétoprofène à partir du matériau méso-macroporeux indique qu'elle est assistée par les micelles qui sont solubilisées dans la solution réceptrice. Le deuxième objectif de ce travail est d'utiliser ces matériaux poreux en tant que biocatalyseur pour la synthèse de biodiesel à partir d'huile de colza. Pour cette application, il est nécessaire que les matériaux résistent à l’immersion dans des milieux aqueux. L’étude de la stabilité hydrothermale a montré que le matériau calciné présente la meilleure stabilité dans l’eau bouillante. Par ailleurs, le matériau peut résister jusqu’à 550°C, la structure ne subissant que des dégradations mineures. Nous avons également utilisé un matériau silicaté à double mésoporosité préparé à partir de micelles fluorées et hydrogénées coexistant dans une même solution. L'évaluation thermique et hydrothermale indique que ces matériaux présentent deux cinétiques de déstructuration qui correspondent à chacune des deux matrices ayant deux tailles de pores différents. L’immobilisation de la lipase Mml est étudiée sur le matériau méso-macroporeux calciné et sur le matériau à double mésoporosité. Les isothermes d'adsorption ont permis de mettre en évidence que le matériau à double mésoporosité peut encapsuler plus d’enzymes que son homologue méso-macroporeux. L’activité enzymatique, au regard des réactions de transestérification, est de façon inverse plus importante avec le matériau méso-macroporeux calciné / This work concerns the preparation of silica materials with hierarchical porosity for the encapsulation of molecules of interest in the field of drug delivery and as biocatalysts. In order to reach this goal, the nano-emulsions were chosen as templates for the macropores of the material because of the homogeneous and small size of the emulsion droplets (less than 100 nm). The system Remcopal 4/decane/water was investigated and the optimal conditions for which nano-emulsion is formed via the phase inversion methods were determined. Adding micelles to the nano-emulsions does not affect its stability and can form a network of mesopores organized with a hexagonal symmetry. Hybrid materials which are hierarchically porous materials where the organic phase is still present, were doped with ketoprofen to study its release, which proved to be pH sensitive. Moreover, the study of the release of ketoprofen from the meso-macroporous material indicates that it is assisted by the micelles which are solubilized in the release medium. The second objective of this work was to use these porous materials as a biocatalyst for biodiesel synthesis from colza oil. For this application it was necessary that the materials are resistant to immersion in aqueous media. The study of the hydrothermal stability shows that the calcined material has the best stability in boiling water. Moreover, the material can withstand up to 550 ° C, the structure undergoes only minor damages. We also used a dual-mesoporous silica material prepared from hydrogenated and fluorinated micelles coexisting in the same solution. Thermal and hydrothermal evaluation indicates that these materials have two different decay kinetics corresponding to each of the two matrices having different pore sizes. The immobilization of lipase Mml was studied on the meso-macroporous calcined material and the dual-mesoporous material. The adsorption isotherms were used to demonstrate that the dual-mesoporous material can encapsulate more enzymes than its meso-macroporous counterpart. On the other hand, the enzyme activity, evaluated by the transesterification reactions, is more important for the calcined meso-macroporous material
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Biopolyester synthesis by enzymatic catalysis and development of nanohybrid systems / Synthèse enzymatique de biopolyesters et développement des systèmes nanohybridesDüskünkorur, Hale 07 December 2012 (has links)
L'objectif de ce travail est de développer des catalyseurs originaux et performants à base de lipases immobilisées sur argiles pour la synthèse de biopolyesters et d’obtenir des nanohybrides organique/inorganique par greffage de chaînes polyesters sur les nanoparticules d'argiles. Deux argiles (sépiolite et montmorillonite) ont été utilisées pour l'immobilisation de Candida antarctica lipase B (CALB) et les catalyseurs obtenus ont été testés en polymérisation de l'ε-caprolactone et des isomères de lactide. Les cinétiques de polymérisation et la caractérisation des polyesters ont montré que les lipases immobilisées sur montmorillonite sont plus performantes que celles immobilisées sur sepiolite. L’organo-modification de ces argiles améliore l’activité catalytique des systèmes obtenus. L'utilisation de CALB immobilisée sur montmorillonite a permis l’élaboration de nanohybrides organique/inorganique via le greffage et la croissance des chaînes polyesters à partir de la surface de l’argile. Finalement, des copolyesters statistiques PCL/PLA ont été obtenus avec succès par polymérisation enzymatique du D-lactide avec l'ε-caprolactone. / This thesis aims at presenting the use and development of original catalytic systems based on lipases immobilized on clays which are efficient for the synthesis of biopolyesters and allowing the preparation of organic/inorganic nanohybrids based on clay nanoparticles (sepiolite and montmorillonite) grafted with such polyesters. These nanoclays were used as lipase supports and the clay-immobilized forms of Candida antarctica lipase B (CALB) were tested for ε-caprolactone and lactide isomers polymerization. Polymerization kinetics and characterization of resulting materials have shown that lipases immobilized on montmorillonite show better performances compared to the ones immobilized on sepiolite. Clay surface organo-modification has proved to greatly enhance the catalytic activity of the corresponding systems. CALB immobilized on montmorillonite allowed the elaboration of organic/inorganic nanohybrids as evidenced by the effective grafting of polyester chains from the clay surface. Finally, random PCL/PLA copolyesters were successfully obtained by lipase-catalyzed copolymerization of D-lactide with ε-caprolactone.
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Mécanismes impliqués dans l'atrophie et la récupération musculaire après immobilisation chez le rat. : Rôle des altérations de la matrice extracellulaire. / Mechanisms involved in muscle atrophy and recovery after immobilization in rats : Role of alterations in the extracellular matrixSlimani, Lamia 26 November 2012 (has links)
Le muscle squelettique est le réservoir principal d’acides aminés libres de l’organisme. Ainsi, l’atrophie musculaire induite par l’immobilisation peut entraîner un affaiblissement et un allongement des périodes de récupération générant des coûts de santé publique élevés. Une aggravation de l’atrophie caractérise de façon surprenante le muscle tibialis anterior (TA) après le déplâtrage, retardant la récupération. Mon objectif a été de comprendre les mécanismes à l’origine de l’aggravation de l’atrophie du TA pendant les phases précoces de récupération en étudiant i) la structure et le phénotype des muscles, ii) la composition de la matrice extracellulaire (MEC), iii) la protéolyse et l’apoptose, et iv) les processus de signalisation via les intégrines. Des rats ont été soumis à une immobilisation par plâtrage pendant 8 jours d’une des deux pattes arrière, l’autre servant de témoin, et placés en récupération pendant 10 jours. L’aggravation de l’atrophie du TA apparaît dès déplâtrage, corrélée avec i) une baisse de l’aire des fibres associée à leur déformation, ii) une redistribution des isoformes des chaines lourdes de myosines, iii) une augmentation de l’apoptose localisée dans le tissu conjonctif, iv) un épaississement de l’endomysium pendant la remobilisation, v) des adaptations au niveau des processus de remodelage des collagènes, et vi) une activation prononcée et persistante du système protéolytique ubiquitine-protéasome (UPS) et de l’apoptosome. Nous montrons également une élévation des niveaux ARNm dans le TA remobilisé vii) de la ténascine-C et de Sparc dès le déplâtrage, et viii) de marqueurs de l’autophagie à partir du moment où l’atrophie se stabilise. Enfin, nous montrons également une élévation des ARNm dans le TA immobilisé ix) des facteurs myogéniques, et x) des intégrines membranaires et de leurs partenaires pendant l’immobilisation et après le déplâtrage. En conclusion, mon travail de thèse a permis de montrer que l'aggravation de l’atrophie du TA est précoce, associée à un remodelage important de la structure et de la composition de la MEC et du phénotype des fibres musculaires, et pourrait résulter de l’augmentation persistante et prononcée de la voie UPS et de l’apoptose. Ce travail suggère que des modifications au niveau des molécules matricielles pendant la remobilisation pourraient influencer la signalisation dépendante des intégrines et la régénération musculaire. / Skeletal muscle is the main reservoir of body amino acids. Thus, muscle atrophy induced by immobilization can lead to a weakening and to a lengthening of recovery periods, leading to elevated healthcare costs. Surprisingly, a worsening of tibialis anterior (TA) muscle atrophy prevailed after cast removal and thus delayed recovery. The aim of my Ph.D was to understand mechanisms underlying the worsening of TA atrophy during early recovery by studying i) the muscle structure and phenotype, ii) the composition of the extracellular matrix (ECM), iii) proteolysis and apoptosis, and iv) the signaling pathways via integrins. Rats were subjected to hindlimb casting for 8 days of one hindllimb, the other leg served as control, and then were allowed to recover for 10 days. The worsening of TA atrophy appeared immediately after cast removal and correlated with i) a decrease in fiber crosssection area associated to fiber deformation, ii) a redistribution of myosin heavy chain isoforms, iii) an increase in apoptosis localized in the connective tissue, iv) a thickening of the endomysium during remobilization, v) some adaptations in collagen remodeling processes, and vi) a pronounced and sustained activation of the ubiquitin-proteasome proteolytic system (UPS) and of the apoptosome. We also showed an increase in the remobilized TA of mRNA levels vii) of tenascin-C and Sparc immediately after cast removal, and viii) of some autophagy markers, when atrophy stabilized. Finally, we showed an elevation of mRNA levels encoding ix) myogenic factors, and x) transmembrane integrins and their partners during TA immobilization and after cast removal. In conclusion, my Ph.D project showed that the worsening of the TA atrophy occurred early after cast removal, was associated with a significant remodeling of the structure and composition of the ECM and of the phenotype of muscle fibers, and may result from pronounced and sustained increase in the UPS and apoptosis. This work suggests that changes in the matricellular matrix molecules during remobilization could influence integrin-dependent signaling and muscle regeneration.
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Atrophie et récupération musculaire chez le rat âgé immobilisé : rôle de la nutrition / Atrophy and muscle recovery in the immobilized rat : the role of nutritionMagne, Hugues 04 November 2011 (has links)
La perte de masse et de force musculaires liée à l’âge, ou sarcopénie, pourrait être partiellementexpliquée par un défaut de récupération de masse musculaire après des épisodes générateursd’atrophie musculaire. Ainsi, les périodes d’immobilisation qui augmentent avec l’âge (alitement,convalescence, fracture) pourraient être suivies d’une absence de récupération musculaire etcontribuer à la fonte musculaire au cours du vieillissement. Les causes de ce défaut de récupérationimpliquent notamment un déséquilibre du taux de renouvellement protéique et du taux derenouvellement cellulaire. L’objectif de cette thèse a donc été de mettre en évidence les mécanismesresponsables de l’atrophie musculaire chez le rat âgé au cours de l’immobilisation et ceux quiseraient défaillants afin de déceler les mécanismes à cibler pour favoriser la récupérationmusculaire.Des rats âgés ont été immobilisés pendant 8 jours par plâtrage unilatéral de la patte arrière, puislaissés en récupération pendant 40 jours après le déplâtrage. Nous avons montré que chez cesanimaux nourris avec un régime contenant 13% de caséine, l’immobilisation entraîne une atrophiedes muscles immobilisés mais, contrairement au rat adulte, le rat âgé ne récupère jamais la massemusculaire perdue. L’atrophie des muscles immobilisés peut être expliquée par 1/ une augmentationde l’apoptose et de la protéolyse ubiquitine-protéasome-dépendante musculaires, 2/ une diminutionde la régénération des cellules musculaires et 3/ une diminution de la protéosynthèse musculaire àl’état nourri. Tous ces phénomènes pourraient résulter de la présence d’un fort stress oxydant etd’une importante inflammation intramusculaire. Tous ces paramètres sont normalisés dès 10 jours derécupération, ce qui permet de stopper l’atrophie mais ne permet pas d’initier la phase derécupération musculaire. Nous avons donc testé l’effet de différentes supplémentationsnutritionnelles au cours de la période de récupération afin de favoriser un gain de masse musculairepost immobilisation. Des supplémentations en leucine (acide aminé bien connu pour stimuler laprotéosynthèse et inhiber la protéolyse) ont ainsi été réalisées. Chez les rats supplémentés, uneamélioration de la synthèse protéique et une normalisation plus précoce des activités protéolytiquesdu protéasome ont été observées. Cependant cette amélioration du métabolisme protéique ne s’estpas traduite par un gain de masse musculaire. Par contre, la modulation qualitative et quantitative desapports en protéines a pu permettre d’obtenir une récupération significative de masse musculaire :ainsi des régimes contenant 13% de lactosérum et des régimes hyper-protéinés ont permis de gagner50% de la masse perdue et ce, dès 20 jours de récupération.Nos résultats montrent que l’immobilisation chez le rat âgé aggrave la sarcopénie. Une fortealtération du métabolisme protéique permet d’expliquer la perte de muscle et la seule normalisationde la protéolyse et de la protéosynthèse permet d’expliquer l’absence de récupération musculaire.Nous avons montré que la modulation des apports en protéines au cours de la phase de récupérationpouvait permettre un gain de protéines. / Sarcopenia, the age-related muscle mass loss, might be partially explained by an impairedmuscle mass recovery of skeletal muscle mass after a catabolic state. Thus, immobilization periodswhich increase with aging could induce a muscle atrophy followed by a lack of muscle massrecovery. An imbalance of protein and cellular metabolisms are certainly involved in this absenceof recovery. The aim on this Ph.D thesis was to explore the mechanisms involved in muscle massatrophy during immobilization and their possible alteration during the recovery period in old rats.Old rats were immobilized for 8 days by unilateral hind limb casting and then allowed torecover for 40 days. Our results showed that animals fed a 13% casein diet wasted muscle mass inimmobilized muscles but, contrarily to adult animals, they never recovered the muscle mass loss.Muscle atrophy was due to 1/ an increase of apoptotic and ubiquitine-proteasome-dependentproteolytic pathways, 2/ a decrease of muscle regeneration processes and 3/ a decrease of muscleprotein synthesis at the fed state. These changes paralleled an increase of intracellular inflammationand oxidative stress. As these parameters were only normalized during the recovery period, theresultant nitrogen balance was then not enough positive as required for the muscle protein gain,hence contributing to the age-related incomplete muscle mass recovery. We tested free leucinesupplementation (an amino acid known for its stimulatory effect on protein metabolism) during therecovery period to improve muscle mass gain. This supplementation induced a greater muscleprotein synthesis in supplemented animals, but without any muscle mass gain. However, wedemonstrated here for the first time that muscle protein accretion after immobilization-inducedatrophy could be achieved with whey protein or high protein diets.In conclusion, we demonstrated that immobilization in old rats induced a muscle mass atrophyfollowed by an incomplete recovery, hence contributing to the development of sarcopenia. We alsodemonstrated that this lack of recovery cannot be overcome by a dietary free leucinesupplementation, despite a positive effect on protein metabolism, contrarily to high protein andwhey protein diets.
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Modulation des propriétés de surfaces par des liaisons réversiblesAl Ahmad, Abdel 12 1900 (has links)
Les azométhines contiennent des liaisons covalentes qui peuvent se former de façon réversible entre une amine et un aldéhyde. Cette réversibilité peut être exploitée pour échanger leurs composantes constitutionnelles. Les propriétés intrinsèques des azométhines peuvent être modulées en échangeant les composantes amines ou aldéhydes. L’échange des composantes constitutionnelles est possible en solution. Toutefois, les produits échangés doivent être purifiés pour éliminer les divers réactifs et produits échangés indésirables. Il est donc avantageux de simplifier l’étape de purification pour
isoler le produit échangé désiré. Un moyen possible pour atteindre cet objectif est d’immobiliser l’amine ou l’aldéhyde sur une surface. Dans ce cas, les produits échangés souhaités peuvent être facilement isolés en rinçant la surface à la suite de cet échange. À cette fin, un monomère d’aldéhyde électroactif dérivé de la triphénylamine a été préparé. Il a été polymérisé thermiquement sur une électrode transparente. La polymérisation a été confirmée par les spectroscopies FT-IR ATR et Raman. Une série d’amines (aminocoumarines et diaminobenzothiadiazole) présentant chacune une couleur unique, une longueur d’émission et un potentiel d’oxydation électrochimique ont été choisis. Leur formation en azométhine et leur échange dynamique sur film mince d’aldéhyde électroactif ont donc pu être suivis électrochimiquement, par des spectroscopies UV-visibles et Raman, et par la fluorescence. Des composés modèles de ces fluorophores azométhines ont
également été préparés pour l’analyse comparative de leurs propriétés électrochimiques et spectroscopiques, ainsi que pour la confirmation de l’échange des composantes. Il a été montré que les propriétés multiples (potentiel redox, couleur, longueur d’onde et rendement d’émission) du film électroactif pouvaient être simultanément modulées par la formation réversible d’azométhine. En immobilisant les azométhines sur une surface, leurs propriétés pourraient être modifiées de façon réversible par échange des composantes, soit en immergeant le substrat dans une solution d’amine, soit en enduisant la surface d’un jet d’amine suivi d’un rinçage. Ce processus direct permet de développer des surfaces dont les propriétés peuvent être constamment modifiées, tout en ouvrant la possibilité de réparer la surface et de restaurer les propriétés souhaitées par un échange dynamique de composantes. / Azomethines incorporate covalent bonds that can be reversibly formed between an
amine and aldehyde. This reversibility can be exploited to exchange their constitutional
components. The intrinsic properties of the azomethines can be modulated by exchanging
either the amine or the aldehyde components. Exchanging the constitutional components
is possible in solution. However, the exchanged products must be purified to remove the
various reagents and undesired exchanged products. It is therefore advantageous to
simplify the purification step for isolating the desired exchanged product. A possible means
towards this goal is by immobilizing either the amine or the aldehyde on a surface. In such
a case, the desired exchanged products can be readily isolated by rinsing the surface
following the dynamic component exchange. Towards this end, an electroactive aldehyde
monomer derived from triphenylamine was prepared. It was thermally polymerized on a
transparent electrode. Polymerization was confirmed by FT-IR ATR and Raman
spectroscopies. A series of amines (aminocoumarin and diaminobenzothiadiazole) each
with a unique color, emission wavelength and electrochemical oxidation potential were
chosen. Their azomethine formation and dynamic exchange with the electroactive aldehyde
thin film could therefore be tracked electrochemically, by UV-visible and Raman
spectroscopies, and by fluorescence. Model compounds of these azomethine fluorophores
were also prepared for benchmarking their electrochemical and spectroscopic properties
along with confirming component exchange. It was shown that multiple properties (redox
potentials, color, emission wavelength, and emission yield) of the electroactive film
could be simultaneously modulated by reversible azomethine formation. By immobilizing
the azomethines on a surface, their properties could be reversibly modified by component
exchange by either dipping the substrate in an amine solution or coating the surface with a
spray of amine followed by rinsing. This straight-forward process provides the means
for developing surfaces whose properties can be perpetually modified, while opening the
possibility of repairing the surface and restoring desired properties by dynamic component
exchange.
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