L’efficacité de certains agents anti-cancéreux, notamment les anthracyclines et l’oxaliplatine repose sur l'induction d’une mort cellulaire immunogène (MCI) pouvant conduire à une réponse immunitaire anti-tumorale spécifique. Les cellules succombant à ce type particulier d'apoptose vont subir certaines modifications définies par un modèle spatio-temporel précis. Celui-ci est caractérisé par la mise en place de signaux d’apparition séquentielle, dont le plus précoce est l’exposition membranaire d’une protéine du réticulum endoplasmique, la calréticuline (CRT) qui constitue un signal de danger essentiel à la phagocytose des cellules mourantes par les cellules dendritiques. Ensuite, à un stade apoptotique, la sécrétion d’adénosine triphosphate (ATP) dépendante de l'autophagie active l’inflammasome NLRP3 et induit la polarisation des cellules T CD8+ productrices d’IFN-. Enfin, au cours de la nécrose secondaire, le relargage d’un facteur pro-immunogène High-mobility group protein B1 (HMGB1) est indispensable à une présentation antigénique optimale aux cellules T CD4+ et CD8+, contribuant ainsi à l’activité tumoricide de la chimiothérapie et protégeant l’hôte d’une éventuelle rechute. De manière à identifier de nouvelles molécules capables d’induire une réponse immunitaire anti-tumorale spécifique, un criblage à haut débit de bibliothèques de composés approuvés par la FDA (Food and Drug Administration) a été réalisé grâce à l’utilisation de microscopie automatisée et de biosenseurs permettant la détection de l'exposition de la CRT, de la sécrétion d'ATP et du relargage d'HMGB1. Ce criblage multiparamétrique à haut débit a permis d’identifier les glucosides cardiotoniques (GCs), déjà bien connus pour leur activité cytotoxique préférentielle des cellules cancéreuses, comme étant des inducteurs efficaces de la MCI. Cette découverte a été validée par des méthodes alternatives in vitro, suivis d’une étude de la mécanistique d’induction de la MCI par les GCs. Les résultats ont mis en évidence une inhibition spécifique de la sous-unité α1 de la pompe Na + / K + ATPase, qui à son tour modifie l'homéostasie calcique de la cellule cible, un effet reproduit par les ionophores du Ca2 +. Nous avons ensuite montré que les CGs, en combinaison avec des chimiothérapies non immunogènes (cisplatine ou mitomycine C) pouvaient vacciner des souris syngéniques contre une ré-injection de cellules cancéreuses vivantes et que les effets antinéoplastiques de ces agents endommageants l’ADN pouvaient être potentialisés par les GCs dans les hôtes immunocompétents mais pas dans les souris immunodéficientes. Enfin, une analyse rétrospective de patients atteints de carcinomes et traités par un GC couramment utilisé en clinique dans la prise en charge de l'insuffisance cardiaque, la digoxine (n=145) a révélé une amélioration significative de la survie globale par rapport à celle de patients non traités (n=290). Les patients ont été appariés en fonction de leur âge, sexe, type de cancer et principaux paramètres pronostiques. Des analyses plus approfondies ont ensuite révélées que la digoxine n’affectait pas la survie globale des patients déjà traités par des agents chimiothérapeutiques immunogènes mais celle des patients ayant reçu des agents autres que les anthracyclines ou l’oxaliplatine. / The efficacy of some anti-cancer agents, including anthracyclines and oxaliplatin is based on their capacity to induce immunogenic cell death (ICD) in tumor cells. This peculiar type of apoptosis is defined by a sequential emission of specific immunogenic signals from the dying tumor, which in their correct spatio-temporal appearance ignite a specific immune response against therapy resistant and dormant tumor (stem) cells. Thus the early membrane exposure of the ER-resident molecular chaperone calreticulin (CRT) constitutes a critical uptake signal for the engulfment of dying tumor cells by dendritic cells (DCs). Then, at later stages, the autophagy-dependent secretion of ATP and its binding to purinergic receptors on DCs activates the NLRP3 inflammasome. Subsequent release of IL-1 by DC triggers the polarization of IFN-γ producing CD8+ T cells. Finally, during secondary necrosis, the release of the pro-immunogenic high-mobility group box 1 (HMGB1) protein and its interaction with Toll like receptor 4 (TLR4) on DCs facilitates an optimal antigen presentation to T cells. Thus ICD contributes to the tumoricidal activity of chemotherapy and protecting the host from relapse. In order to identify thus far unknown inducers of ICD, a high content screening of compound libraries approved by the Food and Drug Administration (FDA) was conducted by means of robotized automated bioimaging combined with ICD biosensors allowing for the detection of CRT relocation, ATP secretion and HMGB1 release. This multiparametric approach led to the identification of cardiac glycosides (CGs), already well known for their preferential cytotoxic activity on cancer cells, as effective inducers of ICD. The hit compounds were validated by alternative methods in vitro, followed by a mechanistic study of GC induced ICD. Results indicated an on-target inhibition of the Na+/K+ ATPase subunit 1, which in turn interfered with the Ca2+-homeostasis of the target cell, an effect that could be mimicked by Ca2+ ionophores. We then showed in different mouse models that tumor cells killed with a combination of GC and non-immunogenic chemotherapy (cisplatin or mitomycin C) have the ability to immunize syngeneic mice against rechallenge with living cells. In addition the antineoplastic effects of these DNA damaging agents in vivo were increased by GCs in immunocompetent but not in immunodeficient mice. Finally, retrospective clinical analyses revealed that the administration of the GC digoxin during chemotherapy had a significant positive impact on overall survival in cohorts of breast, colorectal, head and neck, and hepatocellular carcinoma patients, especially when they were treated with agents other than anthracyclines and oxaliplatin.

En réponse aux inducteurs de la mort cellulaire immunogénique, la calréticuline (CRT) est transportée depuis sa localisation orthotopique dans la lumière du réticulum endoplasmique (RE) vers la surface cellulaire où elle va jouer un rôle de signal puissant d’endocytose à l’endroit des cellules présentatrices d’antigène. Ici nous rapportons qu’une autre protéine, la lysyl-ARNt-synthétase (KRS), est exposée à la surface des cellules stressées où elle colocalise avec la CRT au niveau des radeaux lipidiques. La déplétionde KRS à l’aide d’ARNs interférents annihile l’exposition de la CRT induit par les anthracyclines ou les rayonnements UVC. A l’inverse de la CRT, KRS est aussi retrouvée dans le surnageant des cellules stressées. De plus, la protéine KRS recombinante (KRSr) est ici incapable d’influencer la liaison de laCRT recombinante à la surface cellulaire. Et KRSr ne possède pas la capacité de stimuler des macrophages in vitro. Enfin nous révélons que le statut de phosphorylation d’eIF2α constitue un critère différentiel entre l’oxaliplatine et la cisplatine, capable de rendre compte de l’incapacité de cette dernière à entrainer l’exposition de la CRT, et ce malgré une très grande ressemblance chimique entre ces deux composés. Ces résultats mettent donc en exergue la contribution respective de KRS et du stress du RE dans l’émission du signal prototypique de la mort immunogénique. / In response to immunogenic cell death inducers, calreticulin (CRT) translocates from its orthotopiclocalization in the lumen of the endoplasmic reticulum (ER) to the surface of the plasma membrane where it serves as a potent engulfment signal for antigen-presenting cells. Here, we report that another protein, the lysyl-tRNA-synthetase (KRS), was exposed on the surface of stressed cells, on which KRS co-localized with CRT in lipid rafts. Depletion of KRS with small interfering RNAs suppressed CRT exposure induced by anthracyclines or UVC light. In contrast to CRT, KRS was also found in the supernatant of stressed cells. Recombinant KRS (rKRS) protein was unable to influence the binding of recombinant CRT to the cell surface. Moreover, rKRS protein was unable to stimulate macrophages invitro. Finally, we reveal that the phosphorylation status of eIF2α constitute a differential criteria between oxaliplatin and cisplatin (CDDP), accounting for the incapacity of CDDP to trigger the exposure ofCRT, despite their structural and chemical similarities. These results underscore the respective contribution of KRS and ER stress to the emission of the prototypic signal of immunogenic cell death.

Le développement d’un cancer chez un individu immunocompétent témoigne, en partie, d’un échappement tumoral au système d’immunosurveillance. Par conséquent, la restauration ou l’induction de ces mécanismes de défense anti-tumorale est une des stratégies thérapeutiques actuelles. Un des principes de l’immunothérapie est basé sur l’injection d’anticorps ayant pour cible la cellule tumorale ou les cellules effectrices de l’immunité. L’efficacité anti-tumorale de ces anticorps a été considérablement améliorée par une meilleure compréhension des modes d’action et des effets modulateurs de ces anticorps. Ainsi, afin d’optimiser l’action des effecteurs immunitaires sur les cellules tumorales, un anticorps bispécifique, trifonctionnel, le catumaxomab, capable de se lier à la molécule d'adhérence des cellules épithéliales (EpCAM) exprimée par les cellules tumorales et à l'antigène CD3 des lymphocytes T, a été développé, essentiellement en traitement intra-péritonéal des ascites néoplasiques réfractaires.L’objectif de cette étude était de déterminer les effets immunomodulateurs du catumaxomab sur des cellules néoplasiques exprimant EpCAM, à partir de deux modèles expérimentaux (allogénique et autologue), de rechercher une cytotoxicité induite par la catumaxomab, et de la caractériser, notamment en analysant la présence ou non de signaux de stress inducteurs d’une mort immunogène tels que l’exposition membranaire de la calréticuline par les cellules tumorales pré-apoptotiques, la libération d’HMGB1 et d’adénosine triphosphate (ATP) dans le milieu extra-cellulaire, responsables d’une activation des lymphocytes T.En présence de cellules EpCAM+, le catumaxomab entrainait une activation majeure des lymphocytes T (expression de CD69, CD107a, HLA-DR et PD1), stimulait une réponse inflammatoire de type Thelper 1(Th1), et provoquait la synthèse d’interféron-gamma par les lymphocytes T CD8. Le catumaxomab engageait le CD16 (FcR) des cellules monocytaires et NK. De plus, sur des modèles allogéniques, le catumaxomab, provoquait une mort cellulaire associée à la libération d’ATP et induisait une mort immunogène après pré-incubation dans de l’oxaliplatine.Par conséquent, le catumaxomab permet de moduler l’environnement immunitaire dans les ascites néoplasiques, et de convertir une inflammation chronique et immunosuppressive (Th2) en une inflammation aigüe et immunogène (Th1). En revanche, dans ces conditions, l’administration seule de catumaxomab ne semble pas déclencher de mort immunogène.Différents moyens pourraient permettre d’améliorer la cytotoxicité de cet anticorps bispécifique : (1) le combiner avec un agent anti-néoplasique tel que l’oxaliplatine afin de promouvoir une mort immunogène, (2) affiner son action sur le CD3 des lymphocytes en modifiant sa configuration spatiale (anticorps BiTE), (3) amplifier son affinité pour le récepteur Fcdes cellules accessoires (Fc défucosylé), (4) augmenter sa cytotoxicité en modifiant la cible dirigée contre la molécule du système immunitaire (anti-PD-1…). Enfin, l’utilisation clinique pourrait être facilitée en humanisant cet anticorps chimérique murin afin d’éviter la formation d’anticorps anti-murins, dirigés contre le catumaxomab.Un essai thérapeutique de phase II dont le but est d’évaluer l’efficacité du catumaxomab intrapéritonéal après chirurgie de cytoréduction complète d’une carcinose gastrique, chez des patients ayant reçu en préopératoire une chimiothérapie systémique à base d’oxaliplatine vient de débuter. Au cours de cette étude, nous allons valider la capacité du catumaxomab 1) à induire un stress cellulaire immunogène et la mort des cellules cancéreuses, 2) à modifier la polarisation des cellules effectrices vers une maladie inflammatoire Th1, 3) à promouvoir l'expression des molécules de costimulation et TRAIL sur les cellules NK et monocytes, et corréler ces biomarqueurs immunitaires à l’efficacité du traitement. / The development of cancer in an immunocompetent individual reflects, in part, a tumor escape from the immunosurveillance. The tumor escape is a complex, multifactorial, in which tumor cells will evade the defense mechanisms of the host by changing their microenvironment. Therefore, restoration or induction of these defense mechanisms is one of the therapeutic strategies against cancer. One of the principles of immunotherapy is based on the injection of antibodies that target tumor cells or effector cells of immunity. The anti-tumor efficacy of these antibodies has been greatly improved by a better understanding of modes of action and modulatory effects of these antibodies.Thus, to optimize the action of immune effectors to tumor cells, a bispecific antibody, trifunctional: catumaxomab, capable of binding to the adhesion molecule of the epithelial cells (EpCAM), expressed by tumor cells and the CD3 antigen of T cells, has been developed mainly in intraperitoneal treatment of refractory malignant ascites.The objective of this study was to determine the immunomodulatory effects of catumaxomab on tumoral cells expressing EpCAM, from two experimental models (allogeneic and autologous), evaluate and characterize cytotoxicity induced by catumaxomab, and analyze the presence of stress signals inducing immunogenic cell death such as membrane exposure of calreticulin by pre-apoptotic tumor cells, release of HMGB1 and of adenosine triphosphate (ATP) in the extracellular medium, inducing a T cell activation.In the presence of EpCAM + cells, catumaxomab induced a major the activation of T cells (expression of CD69, CD107a, HLA-DR and PD1), stimulated an inflammatory response Thelper type 1 (Th1) and the synthesis of interferon-gamma by CD8 T cells. Catumaxomab committed CD16 NK cells and monocytes. More, in models allogeneic catumaxomab, caused cell death associated with ATP release and induced an immunogenic cell death after pre-incubation of oxaliplatin.Therefore, catumaxomab modulates the immune environment in malignant ascites, and convert chronic and immunosuppressive inflammation (Th2) in acute and immunogenic inflammation (Th1). However, in these conditions, catumaxomab alone does not seem to trigger immunogenic cell death.the cytotoxicity of this bispecific antibody could be enhance by different techniques: (1) combining with chemotherapy such as oxaliplatin to promote immunogenic cell death, (2) refining its action on CD3 lymphocytes by changing its spatial configuration (BiTE antibody), (3) increasing its affinity for the FcR of accessory cells (Fc aglycosylated), (4) increasing its cytotoxicity by changing the target directed against the immune molecule (anti-PD-1 ...). Finally, the clinical use could be facilitated by this humanizing murine chimeric antibody to prevent the formation of anti-murine antibodies directed against catumaxomab.A phase II clinical trial aimed to evaluate the efficacy of intraperitoneal catumaxomab after complete cytoreductive surgery of gastric carcinomatosis in patients who received preoperative systemic chemotherapy with oxaliplatin have just started. In this study, we will validate the ability of catumaxomab 1) to induce immunogenic cell stress and death of cancer cells, 2) to change the polarization of effector cells to Th1 inflammatory disease, 3) to promote the expression of costimulatory molecules and TRAIL on NK cells and monocytes, and we will correlate these immune biomarkers to treatment efficacy.

Certains agents chimiothérapeutiques tels que les anthracyclines ou l'oxaliplatine induisent une mort cellulaire immunogène, ce qui implique que les cellules mourrantes du patient servent de vaccin thérapeutique en stimulant une réponse immunitaire antitumorale. La mort cellulaire immunogène est caractérisée par la libération de signaux d'alarme par la cellule tumorale mourante qui permettent l’activation du système immunitaire. En premier lieu, l'exposition de la calréticuline à la surface de la cellule tumorale mourante va agir comme un signal de type «eat-me» pour les cellules dendritiques. Une fois relâchée, la protéine nucléaire HMGB1 se lie au récepteur TLR4 afin de faciliter la présentation antigénique. Les cellules mourantes vont également libérer de l'ATP qui agit sur les récepteurs P2X7 et active l’inflammasomme NLRP3, conduisant à la libération d'IL-1β et ainsi à l’activation des cellules T CD8+ productrices d’IFN-γ. L’autophagie est un mécanisme cellulaire qui est activé en réponse à la chimiothérapie. L'autophagie signifie «self-ating», il s'agit d'un processus cellulaire activé par diverses conditions de stress, par lequel les cellules peuvent dégrader les protéines et les organites. Il peut aussi être induit par un stress du réticulum endoplasmique. Ce dernier étant également impliqué dans l'exposition de la calréticuline pendant la mort cellulaire immunogène, nous avons au cours de cette étude cherché à déterminer le rôle de l'autophagie dans la mort cellulaire immunogène. Nous avons constaté que l'autophagie est nécessaire pour la libération de l'ATP après un traitement par des chimiothérapies immunogènes, en observant que le nockdown de gènes essentiels de l'autophagie limitait la sécrétion d'ATP. Nous avons également observé que des cellules déficientes pour l'autophagie traitées par une chimiothérapie immunogène sont incapables d’immuniser des souris contre une injection de cellules vivantes. En outre, les tumeurs déficientes pour l’autophagie ne répondent pas à un traitement systémique immunogène dans des souris immunocompétentes et continuent à proliférer en comparaison à des tumeurs “wild-type”. De plus, nous avons montré que les cellules déficientes pour l'autophagie ne sont pas en mesure de recruter des cellules dendritiques dans le lit tumoral ou d'induire l’activation des cellules T CD8+. A l'inverse, l'inhibition des enzymes de dégradation de l’ATP extracellulaire accroit les concentrations d'ATP dans les tumeurs déficientes pour l'autophagie, ce qui rétablit le recrutement des cellules immunitaires dans le lit tumoral et restaure la réponse chimiothérapeutique des cancers déficients pour l'autophagie. Ainsi, cette étude a montré l'importance de l'autophagie dans la réponse anti-tumorale spécifique, après traitement par des chimiothérapies immunogènes. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives dans le concept de la mort cellulaire immunogène. / In recent years it has been demonstrated that some chemotherapeutic agents such as anthracyclines or oxaliplatin can induce a type of tumor cell death that is immunogenic, implying that the patient’s dying cancer cells serve as a therapeuticvaccine that stimulates an antitumor immune response, which in turn can control or eradicate residual cancer cells. Immunogenic cell death is characterized by the emission of danger signals from the dying tumor cell, which activate the immune system. At first the exposure of calreticulin, acts as an «eat-me» signal for dendritic cells (DCs). Once released, the nuclear protein HMGB1 binds to TLR4 on DCs, facilitating antigen processing and presentation. The dying tumor cells also releases ATP, which acts on P2X7 receptors on DCs and activates the NLRP3 inflammasome, leading to IL-1β release, necessary for IFN-γ-producing CD8+ T cell activation. Autophagy literally ‘self-eating’ is a cellular process activated in response to various conditions of cellular stress, whereby cells can liberate energy resources via the degradation of proteins and organelles. Recently autophagy has been found activated in response to chemotherapy and in this project we aimed to determine the potential role of autophagy in immunogenic cell death. We found that autophagy isrequired for the release of ATP in response to immunochemotherapeutic treatment, as we observed that the knockdown of essential autophagy-related genes abolished its secretion. We observed that autophagy deficient cells treated with immunogenic cell death inducers failed to immunize mice against a re-challenge with living cells. Furthermore, autophagy deficient tumors growing on immunocompetent mice did not respond to systemic immunogenic treatment and continued proliferating in contrast to autophagy proficient tumors. We showed that autophagy deficient cells were neither able to recruit DCs into the tumor bed nor to activate CD8+ T cells. Conversely, the inhibition of extracellular ATP degrading enzymes increased extracellular ATP concentrations in autophagy deficient tumors, which reestablished the recruitment of immune cells into the tumor bed, and restored chemotherapeutic responses in autophagy-deficient cancers. Altogether, this study showed the importance of autophagy in tumor-specific immune response after treatment with chemotherapy, thus giving new insights into the concept of immunogenic cell death.

Glioblastoma is the most common primary brain tumor in humans and has a poor prognosis. Current therapies are not curative. Oncolytic viruses (OVs) are being investigated as tools to induce immunogenic cell death (ICD), cell death capable of activating the immune system. Semliki Forest Virus (SFV) strain 4 is an OV being investigated to treat glioblastoma. Previous studies in our lab have shown that SFV4 can induce ICD in human osteosarcoma (HOS) cells and ongoing in vivo studies show that SFV4 infected GL261 cell vaccination providesprotective immunity in mouse models. This study aimed to characterize the ICD induced by SFV4in glioblastoma cell lines, namely GL261, SB28 and CT2A, and to explain some of our in vivoobservations, namely why vaccination with SFV infected GL261 provides protective immunity but vaccination with infected CT2A and SB28 does not. Our in vitro studies found that GL261 is resistant to SFV4 while SB28 and CT2A are susceptible. We show that the virus can replicate in all three cell lines as seen by the presence of dsRNA, but that viral translation is delayed or inhibited in GL261 cells as not all cells positive for dsRNA were positive for SFV4 protein. Additionally, the type I interferon (IFN) pathway, responsible for antiviral defense, was highly upregulated in CT2A and SB28 but not as much in GL261 after infectionas seen by surveying IFIT1, IFITM3 and IFN-beta genes. Interferon stimulated genes (ISG) like CXCL10, a chemoattractant, was highly upregulated in GL261 after infection and might account for the protective immunity seen in vivo after vaccination. PDL1, an interferon stimulated gene responsible for self-tolerance, was highly upregulated in CT2A after infection. The IFN-beta ELISA revealed that both infected and uninfected GL261 cells produce IFN-beta suggesting a constitutively active pathway. Our DC phagocytosis assay showed that SFV4 infection of CT2A and SB28 cells induced a significant increase in DC phagocytosis and SFV4 infection of all three cell lines significantly increased DC maturation. We conclude that SFV4 infection of GL261 cells may induce ICD in vivo through a persistent viral infection and increased expression of CXCL10.

Le peptide oncolytique LTX-315 a été développé comme un peptide cationique amphipathique qui tue les cellules cancéreuses et qui se révèle stimulant pour la réponse anti-cancer immune quand il est localement injecté dans des tumeurs présentent chez des souris immunocompétentes. La microscopie électronique par transmission révélées que LTX-315 a échoué à induire la condensation nucléaire apoptotique mais induit plutôt un phénotype nécrotique. Par conséquent, LTX-315 a échoué à stimuler l'activation de caspase-3, et l'inhibition des caspases par le biais de Z-VAD-fmk n'a pas été capable de réduire la mort cellulaire par LTX-315. En outre, deux inhibiteurs importants de la nécroptose, nommés necrostatin-1 et cycospotin-A, ont échoué à réduire la mort cellulaire par LTX-315. En conclusion, il semble que LTX-315 déclenche une nécrose non-régulée, qui peut contribuer à ses effets pro-inflammatoires et pro-immunitaires. Le fractionnement subcellulaire des cellules traitées par LTX-315, suivie par une quantification spectrométrique massive, a révélé que cet agent était enrichi en mitochondries. LTX-315 a causé un arrêt immédiat de la respiration mitochondriale sans aucun effet majeur de découplage. Par conséquent, LTX-315 a interrompu le réseau mitochondrial, a dissipé le potentiel mitochondrial de la membrane interne, et a causé la libération des protéines inter-membranaires mitochondriales dans le cytosol. LTX-315 était relativement inefficace dans la mitophagie stimulante. Les cellules dépourvues de deux pro-apoptotiques protéines à domaines multiples BAX et BAK, étaient moins susceptibles de mourir par LTX-315. De plus, les cellules conçues pour perdre leurs mitochondries étaient relativement résistantes à LTX-315, soulignant l'importance de cet organite pour la cytotoxicité induite par LTX-315. Au total, ces résultats soutiennent la notion que LTX-315 tue les cellules cancéreuses par sa vertue à perméabiliser les membranes mitochondriales. Nous avons observé que LTX-315 induit toutes les charactéristiques d'ICD connues. Cette conclusion a étévalidée par diverses méthodes indépendantes incluant la teinture par immunofluorence, dosage par bioluminescence, immunodosages, RT-PCRs. Quand il a été injecté dans des cancers créés, LTX-315 a causé une nécrose focale transitoirement hémorragique accompagnée d'une libération massive de HMGB1, aussi bien que l'activation de caspase-3 dans une partie des cellules. LTX-315 était au moins aussi efficace que le controle positif, l' anthracycline mitoxantrone en induisant une inflammation locale par infitration de cellules myéloïdes et de lymphocytes T. Collectivement, ces résultats appuient l'idée que LTX-315 peut induire l'ICD, expliquant sa capacité à induire des effets thérapeutiques immuno-dépendants.L'autre Lytix composé LTX-401 est un acide aminé oncolytique dérivé avec des propriétés immunogéniques potentielles. Nous démontrons que LTX-401 détruit sélectivement la strucutre du dispositif Golgi. Le fractionnement subcellulaire suivi par une détection spectométrique massive a révélé que LTX-401 a enrichi sélectivement dans le Golgi mieux que dans la mitochondrie ou dans le cytosol. Lagent Golgi-dissociant Brefeldin A a réduit la mort cellulaire par LTX-401 comme cela a partiellement inhibé la libération mitochondrial induite par LTX-401 de cytochrome C et l'activation de BAX. L'effet cytotoxique de LTX-401 a été atténué par la double suppression de BAX et BAK, comme la déplétion mitophagique forcée de la mitochondrie, déjà réfractaire à l'inhibition de caspase. LTX-401 induit toutes les caractéristiques majeures de la mort cellulaire immunogénique. En outre, les tumeurs traitées par LTX-401 ont manifesté une forte infiltration lymphoïde. Ensemble, ces résultats soutiennent l'idée que LTX-401 peut stimuler la mort immunogétique des cellules à travers un passage dans lequel LTX-401 localisé sur Golgi opère en amont de la perméabilisation de la membrane mitochondriale. / The oncolytic peptide LTX-315 has been developed as an amphipathic cationic peptide that kills cancer cells and turned out to stimulate anticancer immune responses when locally injected into tumors established in immunocompetent mice. We investigated whether LTX-315 induces apoptosis or necrosis. Transmission electron microscopy or morphometric analysis of chromatin-stained tumor cells revealed that LTX-315 failed to induce apoptotic nuclear condensation and rather induced a necrotic phenotype. Accordingly, LTX-315 failed to stimulate the activation of caspase-3. Moreover, inhibition of caspases by Z-VAD-fmk was unable to reduce cell killing by LTX-315. In addition, two prominent inhibitors of necroptosis, necrostatin-1 and cyclosporin A, failed to reduce LTX-315-induced cell death. In conclusion, it appears that LTX-315 triggers unregulated necrosis, which may contribute to its pro-inflammatory and pro-immune effects. Subsequently, we investigated the putative involvement of mitochondria in the cytotoxic action of LTX-315. Subcellular fractionation of LTX-315-treated cells, followed by mass spectrometric quantification, revealed that the agent was enriched in mitochondria. LTX-315 caused an immediate arrest of mitochondrial respiration without any major uncoupling effect. Accordingly, LTX-315 disrupted the mitochondrial network, dissipated the mitochondrial inner transmembrane potential, and caused the release of mitochondrial intermembrane proteins into the cytosol. LTX-315 was relatively inefficient in stimulating mitophagy. Cells lacking the two pro-apoptotic multidomain proteins BAX and BAK, were less susceptible to LTX-315-mediated killing. Moreover, cells engineered to lose their mitochondria were relatively resistant against LTX-315, underscoring the importance of this organelle for LTX-315-mediated cytotoxicity. Altogether, these results support the notion that LTX-315 kills cancer cells by virtue of its capacity to permeabilize mitochondrial membranes. Following, we investigated whether LTX-315 may elicit the hallmarks of immunogenic cell death (ICD). Overally, we observed that LTX-315 induces all known ICD characteristics. This conclusion was validated by several independent methods including immunofluorescence staining, bioluminescence assays, immunoassays, and RT-PCRs. The injection of LTX-315 into established cancers resulted in transiently hemorrhagic focal necrosis that was accompanied by massive release of HMGB1, as well as caspase-3 activation in a fraction of the cells. LTX-315 was equal or more efficient as the positive control, the anthracycline mitoxantrone (MTX), in inducing local inflammation with infiltration by myeloid cells and T lymphocytes. Collectively, these results support the idea that LTX-315 can induce ICD, explaining its capacity to mediate immune-dependent therapeutic effects. The second Lytix compound investigated, LTX-401, is an oncolytic amino acid derivative with potential immunogenic properties. We demonstrated that LTX-401 selectively destroys the structure of the Golgi apparatus. Subcellular fractionation followed by mass spectrometric detection revealed that LTX-401 was selectively enriched in the Golgi rather than in the mitochondria or in the cytosol. The Golgi-dissociating agent Brefeldin A (BFA) reduced cell killing by LTX-401 as it partially inhibited LTX-401-induced mitochondrial release of cytochrome c and the activation of BAX. The cytotoxic effect of LTX-401 was attenuated by the double knockout of BAX and BAK, as well as the mitophagy-enforced depletion of mitochondria, yet was refractory to caspase inhibition. LTX-401 induced all major hallmarks of immunogenic cell death. Moreover, LTX-401-treated tumors manifested a strong lymphoid infiltration. Altogether, these results support the contention that LTX-401 can stimulate immunogenic cell death through a pathway in which Golgi-localized LTX-401 operates upstream of mitochondrial membrane permeabilization.

L’amélioration constante du pronostic des pathologies cancéreuses est le fruit des progrès réalisés dans leur prévention, leur dépistage, leur diagnostic et leur traitement. Malgré l’avènement récent des thérapies ciblées, la chimiothérapie conventionnelle reste souvent le seul recours pour des patients atteints de cancer non opérable ou non éligibles pour ces thérapeutiques novatrices. Certaines chimiothérapies conventionnelles (anthracyclines et oxaliplatine notamment) ont la capacité d’entrainer une mort des cellules tumorales dont les caractéristiques permettent d’induire une réponse immunitaire antitumorale efficace. Cette réponse immunitaire antitumorale spécifique agirait en synergie avec l’effet cytotoxique direct de ces drogues, participant ainsi à leur efficacité. La réponse immunitaire antitumorale induite par la chimiothérapie dépend de plusieurs mécanismes moléculaires et cellulaires clefs identifiés récemment. L’induction d’un stress du réticulum endoplasmique (RE) est à l’origine de l’exposition d’une protéine chaperonne résidente du RE, la calréticuline (CRT), à la surface des cellules mourantes, servant alors de signal de phagocytose pour les cellules dendritiques. La libération dans le milieu extracellulaire de signaux de danger est également essentielle : la protéine nucléaire High Mobility Group Box 1 (HMGB1) sert ainsi de ligand pour le Toll-like récepteur 4 (TLR4), présent à la surface des cellules dendritiques et son activation favorise l’apprêtement et la présentation des antigènes tumoraux aux lymphocytes T cytotoxiques. L’adénosine-5'-triphosphate (ATP) est également libéré par les cellules tumorales, entrainant l’activation des récepteurs purinergiques P2RX7 présents à la surface des cellules dendritiques, activant l’inflammasome NLRP3 et entrainant la libération d’IL-1 par les cellules dendritiques, favorisant alors l’orientation de la réponse immunitaire vers une réponse de type TH1 et la production d’interféron  par les lymphocytes T cytotoxiques. Dans ce travail, nous avons cherché à comparer la capacité de deux drogues issues d’une même classe de chimiothérapie, les sels de platine, à induire une mort cellulaire immunogène des cellules tumorales. Grace à des expériences in vitro et in vivo (modèles murins de vaccination antitumorale et de chimiothérapie sur tumeurs établies), nous avons pu montrer que l’oxaliplatine (OXP), contrairement au cisplatine (CDDP), avait la capacité d’induire une mort immunogène des cellules de cancer colique et que cette différence intra-classe dépendait de la capacité respective de ces deux drogues à entrainer un des phénomènes clés de l’induction d’une mort cellulaire immunogène, l’exposition de la CRT à la surface des cellules tumorales mourantes. Nous avons également pu montrer que l’induction d’une mort cellulaire immunogène des cellules de cancer colique par l’oxaliplatine avait une relevance clinique chez l’homme, l’existence d’un polymorphisme perte-de-fonction du gène tlr4 affectant le pronostic (survie sans progression) de patients traités par chimiothérapie pour un cancer colique métastatique. Par la suite, nous avons mis au point des biosondes permettant d’étudier à grande échelle, à l’aide d’une plateforme de vidéo-microscopie automatisée, la capacité de différentes drogues à induire les différents phénomènes clefs de la mort cellulaire immunogène des cellules tumorales (exposition de la CRT, libération d’HMGB1 et d’ATP). Nous avons ainsi pu montrer que la correction pharmaceutique du défaut d’activation d’un stress du réticulum endoplasmique par le cisplatine permettait de restaurer l’immunogénicité de la mort cellulaire induite par cette chimiothérapie. Ces résultats ouvrent la voie à la découverte de nouvelles molécules susceptibles, à elles seules ou en association à d’autres thérapies connues, d’améliorer le pronostic des néoplasies. / The steady improvement of cancer prognosis is the result of progress in cancer prevention, screening, diagnosis and treatment. Despite the recent advent of targeted therapies, conventional chemotherapy often remains the only solution for patients with non-operable cancer or not eligible for these novel therapies.Some conventional chemotherapy (including anthracyclines and oxaliplatin) has the ability to cause tumor cells death with characteristics able to induce an effective antitumor immune response. This specific antitumor immune response would be synergistic with the direct cytotoxic effect of these drugs and contribute to their efficacy. The antitumor immune response induced by chemotherapy depends on several key cellular and molecular mechanisms recently identified. The induction of an endoplasmic reticulum (ER) stress is necessary for the exposure of calreticulin (CRT), an ER-resident chaperone protein, on the surface of dying cells, then acting as a phagocytosis signal for dendritic cells. Release of danger signals into the extracellular medium is also essential. The nuclear protein High Mobility Group Box 1 (HMGB1) is a ligand of the Toll-like receptor 4 (TLR4) on the surface of dendritic cells. TLR4 activation promotes the processing of tumor antigens and their presentation to cytotoxic T lymphocytes. Adenosine-5'-triphosphate (ATP) is also released by tumor cells, leading to the activation of the purinergic receptors P2RX7 expressed on the surface of dendritic cells, activating the NLRP3 inflammasome and causing the release of IL-1β by dendritic cells, while promoting the orientation of the immune response towards a TH1 response and the production of γ-interferon by cytotoxic T lymphocytes.In this work, we aimed to compare the ability of two drugs of a same class of chemotherapy, the platinum derivates oxaliplatin (OXP) and cisplatin (CDDP), to induce immunogenic death of tumor cells. Thanks to in vitro and in vivo experiments (models of tumor vaccination and chemotherapy on established tumors in mice), we showed that OXP, in contrast to CDDP, has the ability to induce immunogenic death of colon cancer cells. This intra-class difference depends on the ability of each drug to cause one of the key phenomena of immunogenic cell death: the induction of the exposure of the CRT to the surface of dying tumor cells. We could also show that the induction of immunogenic death of colon cancer cells by OXP had clinical relevance in humans. Indeed, the existence of a loss-of-function polymorphism of tlr4 affects the prognosis (PFS) of patients treated with OXP-based chemotherapy regimen for a metastatic colorectal cancer. Subsequently, we developed biosensors to study the ability of different drugs to induce key phenomena of cell death immunogen tumor cells (CRT exposure, HMGB1 and ATP release) using high-content screening by an automated video-microscopy platform. We showed that a pharmaceutical correction of the inability of cisplatin to induce an endoplasmic reticulum stress could restore the immunogenicity of cisplatin-induced tumor cell death. These results open the way to the discovery of new molecules that, alone or in combination with other known therapies, could improve the prognosis of cancer.

La chimiothérapie constitue encore le traitement de référence pour la majorité des cancers. Or certains agents chimiothérapeutiques sont capables de déclencher des signaux de stress pre-mortem permettant d’activer une réponse immunitaire antitumorale et confèrent ainsi une protection à long terme. A l'aide d'un modèle construit par intelligence artificielle, nous avons identifié, parmi une librairie comprenant 50 000 composés, des agents anti-cancéreux qui, d'après leurs propriétés physico-chimiques, pourraient induire une mort cellulaire immunogène (ICD, de l'anglais "immunogenic cell death"). Cet algorithme nous a permis d'identifier la dactinomycine, qui, en effet, active les mécanismes sous-jacents à l'activation des cellules dendritiques in vitro et a un effet anti-cancéreux dépendant du système immunitaire in vivo. La dactinomycine, utilisée en clinique pour le traitement de sarcomes pédiatriques, est connue pour sa capacité à inhiber la transcription. Nous nous sommes donc demandé si d'autres inducteurs de l'ICD partageaient cette propriété. Différentes chimiothérapies immunogènes induisent en effet une inhibition de la synthèse d’ARN, qui est suivie d'une inhibition de la traduction et s’accompagne de l’activation des différentes voies de l’ICD. De plus, une étude rétrospective in silico révèle que les agents classés comme inhibiteurs de la synthèse d’ARN ou de protéines sont prédits comme étant immunogènes. Ces résultats montrent que l’inhibition de la transcription est un évènement précurseur essentiel à l’activation d’une mort cellulaire immunogène. / Chemotherapy still constitutes the standard treatment for most cancers. Yet, some chemotherapeutics are able to trigger pre-mortem stress signals which activate an antitumor immune response and thereby confer long term protection. We used an established model built on artificial intelligence to identify, among a library of 50,000 compounds, anticancer agents that, based on their physicochemical characteristics, were predicted to induce immunogenic cell death (ICD). This algorithm led us to the identification of dactinomycin, which indeed activates the mechanisms preceding dendritic cell activation in vitro and demonstrates immune-dependent anticancer effects in vivo. Dactinomycin, mainly used to treat pediatric sarcomas, is known as able to inhibit transcription. We therefore investigated whether other ICD inducers would share this characteristic. Different immunogenic chemotherapeutics indeed inhibited RNA synthesis and secondarily translation, accompanied by an activation of ICD-related signaling. A retrospective in silico study revealed that agents annotated as inhibitors of RNA or protein synthesis are predicted as immunogenic. These results establish the inhibition of RNA synthesis as a major initial event for ICD induction.

O câncer de pulmão é um dos mais incidentes e letais, e, assim, a busca de novos fármacos é necessária. Atualmente o desenvolvimento de fármacos conta com abordagens computacionais que otimizam este processo. Dado que a fosfatidiletanolamina desempenha importantes papeis fisiológicos e uma das enzimas envolvidas na sua síntese, a CTP:fosfoetanolamina-citidilil-transferase (Pcyt2) é frequentemente superexpressa em células de câncer de pulmão, no presente trabalho, foram avaliados o potencial terapêutico de CHY-1, um análogo da miltefosina desenvolvido como inibidor da enzima Pcyt2, e os mecanismos inerentes à sua atividade antitumoral. O CHY-1 apresentou citotoxicidade superior ao seu protótipo e a outro inibidor da enzima Pcyt2, a meclizina. Além disso, as células malignas foram mais sensíveis ao CHY-1 do que as células não-tumorigênicas. Em conclusão, o presente trabalho evidencia o potencial do CHY-1 como um inibidor da enzima Pcyt2 e candidato a fármaco com atividade preferencial para câncer de pulmão. / Lung cancer is one of the most incident and lethal cancers, thus, the pursuit for new drugs is necessary. Nowadays, new drugs development has computational tools that improves this process. Once that phosphatidylethanolamine plays several important physiological roles and one of the enzymes of its production pathway, CTP:phosphoethanolamine cytidylyltransferase (Pcyt2), is usually overexpressed in lung cancer cells, therefore, this study aimed was to evaluate the antitumor effects of CHY-1, a miltefosine analogue developed as an inhibitor of Pcyt2 enzyme, and to investigate the mechanisms related to its antitumor action. CHY-1 was more cytotoxicity than its prototype, miltefosine, and was more cytotoxic than another inhibitor Pcyt2 enzyme, meclizine. Morevover, malignant cells were more sensitive to CHY-1 effects than non-tumorigenic cells. In conclusion, this work presents CHY-1 as an inhibitor of Pcyt2 enzyme and new candidate a drug with preferential activity on NSCLC cells.

O câncer de pulmão é um dos mais incidentes e letais, e, assim, a busca de novos fármacos é necessária. Atualmente o desenvolvimento de fármacos conta com abordagens computacionais que otimizam este processo. Dado que a fosfatidiletanolamina desempenha importantes papeis fisiológicos e uma das enzimas envolvidas na sua síntese, a CTP:fosfoetanolamina-citidilil-transferase (Pcyt2) é frequentemente superexpressa em células de câncer de pulmão, no presente trabalho, foram avaliados o potencial terapêutico de CHY-1, um análogo da miltefosina desenvolvido como inibidor da enzima Pcyt2, e os mecanismos inerentes à sua atividade antitumoral. O CHY-1 apresentou citotoxicidade superior ao seu protótipo e a outro inibidor da enzima Pcyt2, a meclizina. Além disso, as células malignas foram mais sensíveis ao CHY-1 do que as células não-tumorigênicas. Em conclusão, o presente trabalho evidencia o potencial do CHY-1 como um inibidor da enzima Pcyt2 e candidato a fármaco com atividade preferencial para câncer de pulmão. / Lung cancer is one of the most incident and lethal cancers, thus, the pursuit for new drugs is necessary. Nowadays, new drugs development has computational tools that improves this process. Once that phosphatidylethanolamine plays several important physiological roles and one of the enzymes of its production pathway, CTP:phosphoethanolamine cytidylyltransferase (Pcyt2), is usually overexpressed in lung cancer cells, therefore, this study aimed was to evaluate the antitumor effects of CHY-1, a miltefosine analogue developed as an inhibitor of Pcyt2 enzyme, and to investigate the mechanisms related to its antitumor action. CHY-1 was more cytotoxicity than its prototype, miltefosine, and was more cytotoxic than another inhibitor Pcyt2 enzyme, meclizine. Morevover, malignant cells were more sensitive to CHY-1 effects than non-tumorigenic cells. In conclusion, this work presents CHY-1 as an inhibitor of Pcyt2 enzyme and new candidate a drug with preferential activity on NSCLC cells.