The aim of thesis was to study the effect of fluoranthene (FLT) on growth and biochemical processes of plant Petunia (Petunia hybrida cv. Lady blue) in in vitro conditions. In this experiment were used segments of the middle parts of the leaves, shoots from organogenesis in vitro and apical meristem of stem with four to five leaves from long-term in vitro culture. It was observed if fluoranthene influence organogenesis of shoots in vitro, contents of chlorophyll a and b, content of cytokinins and rating of shoots (from organogenesis in vitro) and apical meristem of stem with four to five leaves. It was used culture MS medium containing benzylaminopurin (1.5 mg/l), 1-naphtylacetic acid (0.18 mg/l) and fluoranthene (1 mg/l) or without fluoranthene (control). In the case of organogenesis in vitro, the experiment was performed at 4 different variations of media with subculturing to other media in triplicate. Variations of the media were chosen to allow period of cultivation with fluoranthene, which affects growth and biochemical processes. MS medium containing indol-3-butyric acid (0.5 mg/l) and FLT in different concentrations (0.1, 1, 3 a 5 mg/l) was used for monitoring rooting. The results showed that fluoranthen is able to affect organogenesis of shoots formed on the segments of leaves. There was lower frequency compared to the control organogenesis. It was found that fluoranthene more affects beginning of cultivation compared to later exposure of fluoranthene during cultivation. It was found the highest uptake of benzyladenine and its riboside from the culture medium. Fluoranthene affected significantly content of dihydrozeatin. Zeatin and its riboside were recorded in a minimal amount. Fluoranthene caused lower content of chlorophylls a and b in explantats. In the case of chlorophyll a were no significant differences between influence by fluoranthene at the beginning of the cultivation or during of cultivation. It was noted that fluoranthene influence the morphology of the roots subcultured shoots from organogenesis in vitro. Plant roots exhibited less branching and roots were shorter in culture medium containing higher content of fluoranthene (3 and 5 mg/l).

Recently, the increasing importance of reproductive biotechnologies rises. They provide us to get higher performance of livestock or to improve treatment in human medicine. It is neccessary to have a sufficient amount of developmentaly competent oocytes and further healthy liveable embryos for in vitro culture to supply a progress of reproductive technologies. Immediately after fertilization, pronucleus formation is a key moment for further embryonicdevelopment. Male and female pronuclei have their own pattern of histone code. For development of early embryo, it is neccessary to supply the correct pattern of histone code. NAD+-dependent histon deacetylases, sirtuins, are one of the mechanism which plays in regulation of histone code. These family contains seven isoforms, SIRT1-7. Based on current research, we decided for hypothesis that sirtuins are present in porcine fertilized oocytes and regulate the pronucleus formation. In this thesis, porcine COCs were culture in modificated culture medium and after 44 hr. maturation, only oocytes with extruded first polar body were chosen and used for further in vitro fertilization. Presumed zygotes were subsequently cultured with sirtuins inhibitors, nicotinamide or sirtinol. After 22 hr. of in vitro culture, zygotes were subjected by imunocytochemicaly localization of methylated and acetylated (on lysine K9) histone H3 and image analysis. Our results show that SIRT1 is localizated in porcine zygotes, especially in pronuclei. There are changes in acetylation and methylation H3K9 after sirtuin inhibition. Significant increase of H3K9 acetylation and decrese in H3K9 methylation are appeared. Sirtinol usage has confirmed that the changes are result of SIRT1 action. Role of SIRT1 in histone code regulation of pronucleus formation is still not enought described in porcine.

This diploma thesis focuses on the topic of degradability of mycotoxins in vitro method. The first part covers a brief description of mold (micromycetes) and the products of secondary metabolism - mycotoxins, masked mycotoxins and negatives effect on cattle and pigs health.The second part description own work dealing digestibility selected mycotoxins was tested in rumen fluid in vitro. The three groups of barley crop with different fungicide treatment were included in the experiment. The first group served as the control one without fungicide treatment. The second group of barley (variant A) was treated with Hutton (0,8 L/ha at BBCH 36) + Zantar (1,5 L/ha at BBCH 65). The third group of barley (variant B) was treated with the combination of Hutton (0,8 L/ha at BBCH 36) + Prosaro EC250 (0,75 L/ha at BBCH 65). In the original mass of barely, ten levels of mycotoxins were established. Subsequently, the samples were incubated in the machine Daisy II for 24 hours. The cellulase and pepsin enzymes were used in the incubation. Following mycotoxins were determined in the incubation fluid such as dexynivalenol, zearalenone, deoxynivalenol-3-glucoside and 3-acetyl-deoxynivalenol. In the variant A, the level of dexynivalenolu was higher by 36%, zearalenone by about 2%, deoxynivalenol-3-glucoside by 12%, and 3-acetyl-deoxynivalenol by 39%. Low levels of the mycotoxins were found out in the variant B. Deoxynivalenol level was lower by 19%, zearalenone by 30%, deoxynivalenol-3-glucoside by 37% (p < 0,05). The 3-acetyl-deoxynivalenol level was higher by 12% in a comparison with the control group. The obtained results showed that the fungicidal treatment and digestive enzymes could eliminate the transition of mycotoxins into incubative (rumen) liquid, and thereby to reduce the risk of the load of the organism by the mycotoxins.

A individualização do tratamento é o desafio atual no campo da reprodução assistida. Fatores prognósticos clássicos como idade ou testes de avaliação da reserva ovariana não são suficientes para predizer completamente a resposta das pacientes à indução da ovulação. Essa tese investiga se polimorfismos do receptor do Hormônio Folículo Estimulante ou do receptor do Hormônio Anti-Mulleriano influenciam na resposta ovariana à administração de uma dose padrão de gonadotrofinas para Fertilização In Vitro numa população caucasiana francesa altamente selecionada. Para avaliação correta da resposta à indução da ovulação, usamos parâmetros clássicos como número de oócitos recuperados ou embriões obtidos e também a relação entre o número de folículos que atingem a maturidade ao final do ciclo de indução e o número basal de folículos antrais – taxa de maturação folicular. Como resultados, apresentamos que a presença do alelo G para o receptor do Hormônio Anti Müllleriano está associado com um número menor de oócitos recuperados na punção ovariana. Já o polimorfismo do receptor do FSH Ser 680, apesar de associado com um nível de FSH basal mais elevado, não altera a taxa de maturação folicular. Esses dados podem ajudar, no futuro, a escolha correta do melhor protocolo de indução da ovulação assim como a dose de gonadotrofina a ser utilizada. / Tailoring for a single patient the use of controlled ovarian stimulation is the next challenge in the field of reproductive technology. Classic prognostic factors such as age or ovarian reserve tests have shown to be limited to predict patient’s response towards ovulation induction. This thesis searches to investigate if whether FSH or AMH receptor polymorphisms influence ovarian response to standard gonadotropins administration in a high selected French Caucasian population. In order to correctly evaluate the real ovarian response of each patient, we make use of classical parameters like the number of oocytes retrieved or number of embryos obtained at the end of an IVF cycle, and also the relationship between the number of follicles that reach maturity criteria and the total number of pre antral follicles – follicular output rate. Our results show that the presence of the G allele in the AMH receptor is associated with a lower number of oocytes retrieved. In addition, although FSHR Ser680 genotype is associated with higher basal FSH levels, this polymorphism as well as the Ala307 does not influence the follicular output rate. Our data can help to choose the best protocol and initial dose of gonadotrophin for ovulation induction in the future.

Atualmente, ocorre um grande aumento na geração de resíduos sólidos como consequência do crescimento populacional, juntamente com a expansão da industria. O manejo inadequado dos resíduos sólidos gerados pode afetar a saúde pública e o meio ambiente. Neste contexto, os aterros sanitários são uma alternativa adequada de destinação destes resíduos, no entanto a confinação seguida pela decomposição dos resíduos gera um efluente líquido denominado chorume. O chorume é um líquido escuro de odor desagradável e com alta carga de compostos orgânicos o qual, sem tratamento correto pode causar a poluição das águas subterrâneas e adjacentes. Estudos prévios demonstram uma relação entre a exposição ao chorume e o aumento de radicais livres e índices de lipoperoxidação em diferentes órgãos, inclusive no cérebro e fígado de roedores. Portanto, o estresse oxidativo pode ser um mecanismo bioquímico relacionado à toxicidade de xenobióticos como o chorume de aterros sanitários. A partir dessas informações torna-se necessária a busca por formas de tratamento eficientes para os agentes potencialmente tóxicos presentes no chorume. Uma alternativa de tratamento são os Processos Oxidativos Avançados (POAs) como o tratamento fotoeletrooxidativo que possui elevada capacidade e velocidade de degradação. O objetivo deste trabalho foi avaliar a neurotoxicidade e hepatotoxicidade induzidas pela exposição in vitro ao chorume de aterro sanitário em roedores. Além disso, o chorume submetido ao tratamento fotoeletrooxidativo também foi testado em roedores para avaliar a eficiência do tratamento. Nossos resultados demonstraram que o chorume pode induzir estresse oxidativo em estruturas cerebrais e fígado tanto em camundongos quanto em ratos. Nós também observamos que o hipocampo é menos vulnerável ao dano oxidativo induzido pelo chorume do que o estriado e o cerebelo. No entanto, o estriado e o cerebelo, são mais suscetíveis ao dano quando comparados ao fígado. O chorume submetido ao tratamento fotoeletrooxidativo também induziu estresse oxidativo, principalmente, no estriado e no fígado e diminuiu a atividade da enzima glutationa S-transferase no estriado. Adicionalmente, nós podemos sugerir que a fotoeletrooxidação foi incapaz de alterar eficientemente os compostos tóxicos presentes no chorume. / In the last decades, the solid waste has been increasing by great amounts due to world’s population growth together with the expansion of the industrialization. The inadequate treatment of the solid waste constitutes an important environmental problem and can affect the public health. In this context, the landfills are an appropriate alternative for the destination of the waste; however, the confinement followed by decomposition of the solid waste produce a liquid efluent known as leachate. Leachate is a dark liquid formed within landfills with elevated concentrations of chemical compounds. The absense of its treatment may cause severe pollution to the groundwater aquifer and to the adjacent surface waters. Previous studies demonstrated a relationship between the leachate exposure and the increase of free radicals and lipid peroxidation in different organs of rodents, including the brain and liver. Therefore, oxidative stress may be a biochemistry mechanism related to toxicity of xenobiotics such as landfill leachate. In view of the toxicity induced by leachate, the development of new technologies of treatment becomes necessary. In this context, one of the alternatives are the Advanced Oxidation Processes such as the photoelectrooxidative process which is formed by combination of two methods and has a high capacity and speed of degradation. The aim of this study was to evaluate the neurotoxicity and hepatotoxicity induced by in vitro exposure to landfill leachate in rodents. Moreover, leachate submitted by the photoelectrooxidative process was tested in rodents to evaluate the efficiency of the treatment. Our results showed that the landfill leachate can induce oxidative stress in brain structures and liver in both rats and mice. Additionally, we observed that the hippocampus is less vulnerable to oxidative stress induced by leachate when compared to striatum and cerebellum. However, brain structures are more susceptible to oxidative damage compared to liver. Leachate submitted to photoelectrooxidative process also induced increase on oxidative parameters in different structures evaluated, and decreased the glutathione S-transferase activity in striatum. Finally, we can suggest that photoelectrooxidation was unable to alter efficiently the toxic compounds presents in leachate.

Este trabalho teve como objetivo investigar o efeito do estresse hiperosmótico ou hiposmótico agudo, in vitro, sobre o metabolismo da glicose em brânquias anteriores e posteriores, hepatopâncreas e músculo da mandíbula do caranguejo Neohelice granulata. Foi avaliada a captação de 2-Deoxi-D-1-14C-Glicose, a formação de 14CO2 a partir da oxidação de 14Cglicose e a síntese de glicogênio a partir de 14C-glicose em todos os tecidos estudados. Não foram constatadas diferenças significativas na captação de 2-Deoxi-D-1-14C-glicose em nenhum dos tecidos estudados. Nas brânquias anteriores, brânquias posteriores e no hepatopâncreas, o estresse hiperosmótico reduziu significativamente, em relação ao grupo controle, a formação de 14CO2 a partir de 14C-glicose. Entretanto, o estresse hiposmótico reduziu a formação de 4CO2 a partir de 14C-glicose somente no hepatopâncreas. Nos outros tecidos, o estresse hiposmótico não alterou a formação de 4CO2 a partir da oxidação de 14Cglicose. No estresse hiposmótico, a capacidade de síntese de glicogênio a partir de 14C-glicose aumentou, significativamente, no hepatopâncreas e nas brânquias anteriores. Contudo, nas brânquias posteriores, este estresse não alterou, de forma significativa, a formação de 14Cglicogênio. Os resultados mostram que o estresse hiperosmótico aumentou a capacidade de síntese de 14C-glicogênio somente no hepatopâncreas. Já, nos outros tecidos, não foram verificadas alterações significativas. No músculo mandibular, o estresse osmótico agudo (hiposmótico e hiperosmótico), in vitro, não alterou, significativamente, nenhum dos parâmetros metabólicos determinados neste estudo. Nossos resultados sugerem que os mecanismos responsáveis pela redução regulatória do volume celular (RVD) ou pelo aumento regulatório do volume celular (RVI), após o estresse osmótico agudo, in vitro, não alteram a captação de glicose pelos tecidos de N. granulata. Estes resultados apontam para um controle endócrino ou de outros fatores endógenos sobre a captação de glicose, via GLUTs, nos tecidos de N. granulata, visto que, a alteração de volume tissular, decorrente do estresse agudo, in vitro, não foi capaz de modificar significativamente a captação de 2-DG. Nas brânquias anteriores, não foi verificada alteração na capacidade de oxidação de glicose no choque hiposmótico, contudo, a síntese de 14C-glicogênio aumentou significativamente neste tecido. Este resultado sugere que durante o estresse hiposmótico agudo, a glicose livre intracelular seria utilizada na síntese de glicogênio em resposta à modificação de volume celular. Em brânquias posteriores, não foi constatada alteração significativa da formação de 14CO2 e de síntese de 14C-glicogênio a partir de 14C-glicose em resposta ao estresse hiposmótico agudo, in vitro. Como, nas brânquias, a atividade de oxidação de glicose é bastante elevada, quando comparada àquela verificada nos outros tecidos, a atividade basal de oxidação seria suficiente para suprir a energia necessária ao processo osmorregulatório, durante o estresse osmótico agudo, in vitro. O estresse hiperosmótico agudo, in vitro, diminuiu, de forma marcante, a formação de 14CO2 a partir de glicose no hepatopâncreas e nas brânquias anteriores e posteriores, contudo, não alterou a oxidação no músculo. No hepatopâncreas de N. granulata, os resultados do presente trabalho sugerem que a resposta ao estresse hiperosmótico, in vitro, seria semelhante àquela verificada durante o choque hiposmótico: a diminuição da oxidação de glicose levaria a um redirecionamento deste substrato para a via de síntese de glicogênio. A submissão do tecido muscular ao estresse hiposmótico ou hiperosmótico agudo, in vitro, não alterou de forma significativa as vias do metabolismo da glicose investigadas no presente trabalho. Assim, as alterações de volume celular não seriam suficientes para ativar ou inibir as diferentes vias envolvidas na utilização da glicose neste tecido. Concluindo, a alteração do volume celular decorrente do estresse osmótico agudo, in vitro, alterou o fluxo de carbonos nos tecidos hepatopancreático e branquial de N. granulata, sugerindo a participação do metabolismo de carboidrato no processo regulatório de volume celular em tecidos de caranguejos.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-03-29T13:15:32Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1146273 bytes, checksum: 4c59d7889b107c9a870070465d40075b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-29T13:15:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1146273 bytes, checksum: 4c59d7889b107c9a870070465d40075b (MD5) Previous issue date: 2013-01-30 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Pfaffia glomerata (Amaranthaceae), conhecida como ginseng brasileiro, é uma importante espécie medicinal nativa do Brasil. O objetivo do presente estudo foi avaliar a influência da ploidia das plantas e das condições de cultivo in vitro e ex vitro no crescimento e produção de metabólitos secundários em P. glomerata. Nesse trabalho foram utilizados explantes diploides e tetraploides induzidos artificialmente por uso de colchicina. Nas condições in vitro foram avaliados os efeitos da poliploidização, da adição de sacarose ao meio de cultura e da concentração atmosférica de CO2 nos parâmetros de crescimento e acúmulo de 20E em P. glomerata. Enquanto nas condições ex vitro analisou- se o crescimento, acúmulo de pigmentos, densidade estomática, teores de 20E e saponinas triterpênicas em função da ploidia da planta, volume de vaso e tratamento com paclobutrazol (PBZ). Todos os parâmetros de crescimento avaliados e o acúmulo de metabólitos secundários foram reprimidos em plantas tetraploides comparadas às diploides em condições de cultivo in vitro e ex vitro. Foram observadas nos indivíduos tetraploides características específicas de poliploidia, como redução da densidade estomática e aumento da relação largura/comprimento foliar. Em condições in vitro, a presença de sacarose no meio de cultura promoveu melhor crescimento, porém inibiu o acúmulo de 20E. Assim, a fotoautotrofia mostra-se mais favorável por apresentar potencial na produção comercial massal de mudas dessa espécie com altos teores de 20E. O enriquecimento de CO2 (1.000 μmol/mol de CO2) também induziu a produção de plantas com maiores biomassa e acúmulo de 20E, favoráveis ao interesse comercial. Após aclimatização, plantas de P. glomerata apresentaram forte indução nos parâmetros de crescimento quando crescidas em vasos de maior volume, enquanto a aplicação de PBZ não interferiu na produção de biomassa e metabólitos secundários. Dessa forma, a utilização de vasos de maior volume é um importante fator na produção em escala comercial de ginseng brasileiro. / Pfaffia glomerata (Amaranthaceae), known as Brazilian ginseng, is an important medicinal species native to Brazil. The objective of this study was to evaluate the influence of the ploidy level and in vitro and ex vitro culture conditions on the growth and secondary metabolite production in P. glomerata. Explants of diploids and tetraploids artificially induced by colchicine explants were used. Under in vitro conditions, we evaluated the effects of polyploidization, supplementation of sucrose to the culture medium and atmospheric CO 2 concentration on growth parameters and 20-hydroxyecdysone (20E) accumulation of P. glomerata nodal explants. Following transfer to ex vitro conditions, growth, pigment content, stomatal density, levels of 20E and saponins were analyzed according to the plant ploidy, vessel volume and treatment with paclobutrazol (PBZ). All growth characteristics and accumulation of secondary metabolites were inhibited in tetraploid background compared with diploids, both under in vitro and ex vitro conditions. Specific characteristics of polyploidy, such as reduced stomatal density and increased width/length ratio of leaves were found in tetraploid individuals. Under in vitro conditions, the presence of sucrose in the culture medium promoted better growth, but inhibited 20E accumulation. Thus, the photoautotrophy seems to be more favorable because shows potencial commercial mass production of seedlings of this species with high levels of 20E. CO2 enrichment also induced plant production with higher biomass and 20E accumulation, favorable for commercial purposes. After acclimatization, P. glomerata showed significant increase in growth parameters when it was grown in higher-volume pots, while the PBZ application did not affect the biomass and secondary metabolite production. Thereby, the use of larger pots is an important factor in commercial-scale production of Brazilian ginseng. / Não foi localizado o cpf do autor. Tese enviada pela secretaria do curso por e-mail, em 28-03-17.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-05-09T13:12:43Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 473798 bytes, checksum: 36309cb46ce305a2a74b1c1b0f6ef96d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-09T13:12:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 473798 bytes, checksum: 36309cb46ce305a2a74b1c1b0f6ef96d (MD5) Previous issue date: 2003-08-23 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A destruição dos ambientes naturais das bromeliáceas, aliada à coleta indiscriminada, tem levado muitas espécies nativas à extinção. No Estado de Minas Gerais já se encontram listadas 48 espécies ameaçadas. Diante disso foram selecionas três espécies nativas deste Estado (Acanthostachys strobilacea, Aechmea bambusoides e Quesnelia quesneliana) para o desenvolvimento de protocolos de propagação in vitro. No laboratório, as sementes passaram por um processo de desinfestação e foram estabelecidas in vitro. Na fase de multiplicação in vitro, para cada espécie foi feito um experimento, testando-se cinco concentrações de BAP (0, 10, 20, 40 e 80 μM) e duas concentrações dos sais minerais de MS (50% e 100%). Avaliou-se o número de brotações formadas, a altura média das brotações e a presença de raízes nas brotações. Em seguida, as brotações foram transferidas para meio de alongamento e enraizamento. Na fase de aclimatização, as plântulas foram submetidas a experimentos distintos. No caso de A. strobilacea as plântulas tiveram as raízes removidas e foram separadas em três grupos: 1 (10 a 20 mm), 2 (30 a 40 mm) e 3 (50 a 60 mm). As plântulas de A. bambusoides foram separadas em dois grupos: 1 (20 a 40 mm) e 2 (acima de 4,1 a 60 mm). Testou-se como substrato xaxim (Dicksonia sellowiana) e aguapé (Eichhornia crassipes) nessas duas espécies. Para Q. quesneliana, selecionadas com 20 a 30 mm de altura, testou-se xaxim, aguapé e a mistura destes (1:1). Verificou-se que o tratamento de desinfestação das sementes propiciou percentagem de contaminação menor que 1%, para as três espécies. O número de brotações formadas, na etapa de multiplicação, foi maior na concentração estimada de 26,8 μM de BAP para A. strobilacea; 26,11 μM para A. bambusoides e 22,15 μM para Q. quesneliana. No entanto, a altura média das brotações diminuiu com o aumento da concentração de BAP. A formação de raízes só foi observada na ausência de BAP, para todas as espécies estudadas. O meio MS com a metade da concentração dos sais foi eficiente na multiplicação, no alongamento e no enraizamento de A. strobilacea e Q. quesneliana. Para A. bambusoides melhores resultados foram conseguidos com o meio MS não modificado. O aguapé pode ser utilizado como substrato para aclimatização das três espécies, sendo que, para Q. quesneliana, o aguapé deve ser misturado com areia na proporção 1:1. / The destruction of the habitats of the bromeliaceae, together with the indiscriminate gathering, has threatened many native species to extinction level. Today In the state of Minas Gerais 48 species are listed as endangered. Considering this, three species (Acanthostachys strobilacea, Aechmea bambusoides and Quesnelia quesneliana) native to this state were selected for the establishment of in vitro propagation protocols. In the laboratory, the seeds underwent a disinfestation process and were established in vitro. In the in vitro multiplication phase an experiment was carried out with each one of the selected species for testing five BAP concentrations (0, 10, 20, 40 e 80 μM) and two concentrations of mineral salts in the MS culture medium (50% e 100%). Evaluations were made through the produced axillary shoots, considering their number, mean height and rooting. After these evaluations, the shoots were transferred to the elongation and rooting medium. In the acclimatization phase the plantlets underwent different experiments. In the case of A. strobilacea the plantlets had their roots removed, then separated in three groups: 1 (10 to 20 mm), 2 (30 to 40 mm) and 3 (50 to 60 mm). The plantlets of A. bambusoides were separated in two groups: 1 (20 to 40 mm) and 2 (41 to 60 mm). These two species were tested on two substrates: xaxim (Dicksonia sellowiana) and water- hyacinth (Eichhornia crassipes). For the experiment with Q. quesneliana, the plantlets utilized had 20 to 30 mm of height and the substrates tested were xaxim, water-hyacinth and a mix of these (1:1). It was verified that the disinfestation treatment of the seeds provided contamination less than 1%, in all species. The numbers of axillary shoots produced in the multiplication phase were greater in the estimated concentrations of BAP: 26,8 μM in A. strobilacea; 26,11 μM in A. bambusoides and 22,15 μM in Q. quesneliana. However, the mean height of axillary shoots decreased with increasing BAP concentration. In all species rooting occurred only in the absence of BAP. The MS medium with half of the salt concentrations was efficient in the multiplication, elongations and rooting of A. strobilacea and Q. quesneliana. For A. bambusoides the best results were obtained with the unmodified MS medium. The water-hyacinth may be utilized as substrate in the acclimatization of the three species, but in the case of Q. quesneliana this substrate must be mixed with sand in an 1:1 proportion.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-07-27T14:38:19Z No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 1644273 bytes, checksum: c8b636cbf0fc55b1e32f92cfa9cb1ad6 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-27T14:38:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 1644273 bytes, checksum: c8b636cbf0fc55b1e32f92cfa9cb1ad6 (MD5) Previous issue date: 2001-08-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A propagação dos Citrus pode se dar: através da cultura de células e tecido e através da propagação vegetativa clássica, com métodos de estaquia, mergulhia e enxertia, sendo este último o que apresenta maior interesse comercial. Dentre os hipobiotos atualmente mais utilizados, destaca-se a tangerineira ‘Cleópatra’ (Citrus reshni Hort. ex. Tan), devido as suas características agronômicas. Desta forma, este trabalho teve como objetivo geral, a pontualização de um eficiente protocolo organogênico de células, tecido e órgãos, uma vez que o cultivo in vitro de células e tecidos constitui uma estratégia de extraordinária importância para solucionar problemas não apenas no âmbito da propagação, como também do melhoramento genético clássico e do melhoramento genético não convencional, notadamente das plantas lenhosas perenes, como são os citros. Sementes de tangerineira ‘Cleópatra’ ( Citrus reshni Hort. ex. Tan) obtidas de frutos de plantas de 16 anos de idade, foram utilizadas como explantes, visando a obtenção do maior número possível de plântulas axênicas, normais e vigorosas. Após 50 dias de incubação no escuro em meio MS (Murashige & Skogg, 1962) na ausência de vitaminas, foram avaliados o número de tubos contaminados; porcentagem de sementes germinadas; número de plântulas e raízes por semente; comprimento do epicótilo e das plântulas; e vigor destas. O melhor resultado foi obtido ao se utilizar as concentrações de HclO a 0,50% v/v por 30 minutos para a primeira desinfestação e a de 1,00% v/v por 5 minutos para a Segunda desinfestação. As plântulas, obtidas de acordo com o protocolo descrito acima, tiveram o epicótilo seccionado em cinco segmentos, os quais foram utilizados para avaliação da influência de BAP e ANA em distintas condições de incubação (luz, escuro e escuro/luz). Após 50 dias em incubação em -1 meio MS, suplementado com três concentrações de ANA (0,00; 0,10 e 1,00 mg.L ) e quatro-1 de BAP (0,00; 0,50; 1,00 e 3,00 mg.L ) e pelas combinações entre estas, foram avaliados no extremo distal e proximal, dos referidos explantes, o número de gemas, brotos e o tamanho dos calos formados. O processo organogênico ocorreu, tanto por organogênese direta (extremo distal), quanto por indireta (extremo proximal). Na organogênese direta, uma maior formação de gemas foi obtida quando BAP foi adicionado ao meio na concentração de 0,50 -1 mg.L , sob incubação em escuro/luz; e a posterior brotação destas ocorreu de forma mais efetiva em meio com 1,60 mg.L -1 de BAP, sob incubação em luz. Para a organogênese indireta, a incubação dos explantes no escuro foi a mais efetiva em todas as etapas, entretanto, as necessidades requeridas, quanto à natureza do regulador de crescimento e da concentração destes, variaram. Para o processo calogênico foram necessárias combinações específicas entre ANA e BAP, para cada explante, enquanto, para a formação de gemas e brotos a adição de 0,50 mg.L -1 de BAP ao meio de cultivo promoveu de uma forma geral os melhores resultados. Visando a avaliação da influência de AIB, ANA e 2,4D no processo de enraizamento adventício in vitro, foram utilizados como explantes, ápices de plântulas axênicas (protocolo descrito anteriormente). Nesta etapa, o meio MS foi suplementado com 4 concentrações de AIB e de ANA (0,00; 0,50; 1,00 e 1,50 mg.L -1 ), e a combinação de AIB e -1 ANA na concentração de 0,50 mg.L , para ambos reguladores de crescimento, sendo que para esta combinação também foram adicionadas duas diferentes concentrações de 2,4D -1 (0,20 e 0,40 mg.L ). Após 50 dias de incubação, foram avaliados: o número de ápices enraizados, o número de raízes por plântulas, o comprimento de raízes, ápices com formação -1 de calos e o vigor das plântulas. A combinação de AIB e ANA a 0,50 mg.L para ambos, e -1 ANA na concentração de 0,50 mg.L , foram os tratamentos que apresentaram melhores resultados. / The propagation of the Citrus can occur: by culture of cells and tissue and by the classic vegetative propagation, using methods of cutting, budding and grafting, the last method mentioned represents, comercially, the most interesting. Among the rootstock more utilized today. The mandarin tree "Cleópatra"( Citrus reshni Hort. ex. Tan) is pointed out due to it's agronomical features. Thus, this work had as a general objective, the pointing of an efficient organogenic protocol of cells, tissues and organs, once that the cultivation in vitro of cells and tissues constitutes a strategy of an extreme importance in solving problems, not only in a propagation aspect as well as in the classic and non-conventional genetic improvement, notedly from the hardwood plants, as the Citrus are. Seeds from the "Cleópatra" tangerine tree ( Citrus reshni Hort. ex. Tan) obtained from the fruits of sixteen year -old plants, were utilezed as explants, with the objective of obtaining the highest number possible of normal and vigorous axenic plantules. After fifty days of incubation in the dark in a MS mean (Murashige & Skoog, 1962)in the absense of vitamins, the number of contaminated tubes; percentage of germinated seeds; number of plantules and roots per seed; length of the epicotile and plantules and their strength. The best result was obtained while using the concentrations of HClO to 0.50%v/v during thirty minutes for the first desinfectation and of 1,00%v/v during five minutes for the second desinfectation. The plantules obtained according to the protocol described above had the epicotile seccionated in five segments, that were utilized for evaluating the influence of BAP and ANA in distinct incubation conditions (light, dark, and light/dark). After fifty days of incubation n i a MS mean, suplemented with three concentrations of ANA (0,00; 0,10 and 1,00 -1 -1 mg.L ) and four of BAP (0,00;0,50;1,00 and 3,00 mg.L ) and by combinations betweens them, the number of buds, shoots, and the size of the formed callus were evaluated in the extreme apical and basal of the reffered explants. The organogenic process occurred by directorganogenesis (extreme apical) as well as indirect (extreme basal). In the direct organogenesis a higher formation of buds was obtained when BAP was added to the mean in the concentration -1 of 0,50 mg.L , under incubation in the dark-light; and their posterior shoottting occurred in a more effective form, with 1,60 mg.L -1 of BAP, under light incubation. For the indirect organogenesis, the incubation of the explants in the dark was the most effective in all stages, however, the required necessities varied, in relation to the nature of the growth regulator and their concentrations. For the callogenic process, specific combinations were necessary between ANA and BAP, to each of the explants, while that the formation of buds and soots, an addition -1 of 0,50 mg.L of BAP to the mean of cultivation promoted in a general way the best results. Aiming the evaluation of the influence of AIB, ANA and 2,4D in the process of adventious rooting in vitro, the apex of axenic plantules (previouly described protocol) were used. In that stage the MS mean was suplemented with four concentrations of AIB and of ANA (0,00; 0,50; -1 - 1,00 and 1,50 mg.L ), and the combination of AIB and ANA in the concentration of 0,50 mg.L , for both growth regulator, and two different concentrations of 2,4D (0,20 and 0,40 mg.L -1 ) were also added. After fifty days of incubation, the number of rooted apexes, roots per plantules, root length, apexes with formation of callus and the plantule's vigour were evaluated. -1 The combination of AIB and ANA to 0,50 mg.L for both, and ANA in the concentration of -1 0,50 mg.L , were the treatments that presented the best results.

SILVA, Anderson Weiny Barbalho. Localização de proteínas, quantificação de RNAm e papel das citocinas TNF-α e IL-1β no desenvolvimento folicular in vivo e in vitro em bovinos. 2016. 202 f. Tese (Doutorado em Biotecnologia)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2016-08-30T20:32:25Z No. of bitstreams: 1 2016_tese_awbsilva.pdf: 11114380 bytes, checksum: 03441619657fa0d30e6b11bd187ddab7 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2016-08-30T20:35:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_tese_awbsilva.pdf: 11114380 bytes, checksum: 03441619657fa0d30e6b11bd187ddab7 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-30T20:35:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_tese_awbsilva.pdf: 11114380 bytes, checksum: 03441619657fa0d30e6b11bd187ddab7 (MD5) Previous issue date: 2016 / The aims of this study were: 1) to investigate the expression and distribution of messengers RNAs and proteins of TNF-α and interleukin 1 systems members in the ovaries of cyclic cows; 2) to evaluate the effects of TNF-α, Dexamethasone and IL-1β, on the survival and activation of bovine primordial follicles in vitro; 3) to characterize the expression profile of TNF-α and IL-1β systems in bovine granulosa cells of preovulatory follicles during ovulation induced by GnRH/LH in vivo; 4) to evaluate the influence of gonadotropins (FSH/LH) in the expression of mRNA for TNF-α system and IL-1β system in cumulus cells cultured in vitro; and 5) to analyze the effect of TNF-α and IL-1β on cumulus cells expansion, ultrastructure integrity of cultured COCs; mRNA expression of HAS-2, CASP3, CASP6 and iNOS of cumulus cells after in vitro culture. Bovine ovaries were processed for immunohistochemistry and Western Blot analyzes for the location of proteins for TNF-α system and interleukin system 1 in preantral and antral follicles. To evaluate the in vitro follicular survival and activation, ovarian tissues were cultured for 6 days in the presence of IL-1β, TNF-α or Dexamethasone at different concentrations. To evaluate the profile of expression of TNF-α and IL-β systems after GnRH treatments in vivo, granulosa cells from bovine preovulatory follicles were collected at different time points. COCs were cultured for 12 and 24h in the presence of gonadotropins, TNF-α and IL-1β. TNF-α system (TNF-α, TNFR1 and TNFR2) and interleukin I system (IL-1β, IL-1RA, IL-1RI and IL-1RII) were detected in preantral and antral follicles by immunohistochemistry. Variable levels of mRNA for the interleukin 1 system members were observed at different stages of development. Concerning to in vitro culture of bovine ovarian tissue, the presence of TNF-α (10 ng/mL) reduced the follicular survival and increased the number of apoptotic cells, whereas the addition of dexamethasone (10 ng/mL) maintained the follicular ultrastructure. On the other hand, the presence of IL-1β (10 or 50 ng/mL) was able to maintain the percentage of normal follicles and promote the primordial follicles activation. In vivo, an increased expression of mRNA for TNF-α and TNFR1 was observed 12 h after GnRH treatment. Higher levels of mRNA for TNFR2 were observed at 3, 6 and 12 h after GnRH administration. However, it was seen an increase in mRNA levels for IL-1RA 24h after GnRH induction. In vitro, TNF-α and IL-1β did not shown additive effect of cumulus cells expansion. The levels of mRNA for TNF-α, TNFR1 and TNFR2 were increased in COCs cultured for 12 h in the presence of gonadotropins. The presence of gonadotropins increased the mRNA levels for IL-1R1 and IL-1RA in cumulus cells after 24h of culture. The presence of TNF-α reduced levels of HAS-2, CASP3 and CASP6, whereas IL-1β increased levels of mRNA for IL-β, IL-1RA and HAS-2 in cultured cumulus cells. Furthermore, IL-1β increased iNOS expression after 24h of culture. Ultrastructural analysis confirmed the integrity of COCs cultured in presence of TNF-α or IL-1β. In conclusion, TNF-α system members and interleukin-1 system members are differentially expressed in ovarian cells. TNF-α reduces the follicular survival in vitro, while dexamethasone enhances the ultrastructure of cultured follicles. On the other hand, IL-1β promotes the development of primordial follicles in vitro. The expression of TNF-α system and the IL-1 system is regulated by gonadotropins in vivo and in vitro. The presence of TNF-α and IL-1β maintain the normal ultrastructure of cultured COCs. These results indicate an important role of TNF-α and interleukin 1 systems in the regulation of bovine folliculogenesis and ovulation. / Os objetivos deste estudo foram: 1) investigar a expressão e a distribuição de RNAs mensageiros e proteínas dos sistemas TNF-α e interleucina 1 em ovários de vacas cíclicas, 2) avaliar os efeitos do TNF-α, Dexametasona e da IL-1β, na sobrevivência e ativação de folículos primordiais bovinos cultivados in situ; 3) caracterizar o perfil de expressão do sistema TNF-α e do sistema IL-1β em células da granulosa de folículos pré-ovulatórios bovinos, durante a ovulação induzida por GnRH/LH in vivo; 4) avaliar a influência das gonadotrofinas (FSH/LH) na expressão de RNAm para o sistema TNF-α e sistema IL-1β em células do cumulus cultivadas in vitro; e 5) analisar o efeito do TNF-α e da IL-1β na expansão de células do cumulus, na manutenção da integridade ultraestrutural de CCOs; na expressão de RNAm para HAS-2, CASP3, CASP6 e iNOS em células do cumulus após cultivo in vitro. Ovários bovinos foram processados para análises de imunohistoquímica e Western Blot para a localização das proteínas para o sistema TNF-α e do sistema interleucina 1 em folículos pré-antrais e antrais. Para avaliação da sobrevivência e ativação folicular in vitro, fragmentos ovarianos foram cultivados por 6 dias na presença de IL-1β, TNF-α ou Dexametasona em diferentes concentrações. Células da granulosa de folículos pré-ovulatórios bovinos foram coletadas em diferentes momentos após a administração intramuscular de GnRH para avaliação do perfil de expressão dos sistemas TNF-α e IL-β in vivo. CCOs foram cultivados in vitro por 12 e 24 h na presença de gonadotrofinas, TNF-α e IL-1β. Os resultados da imunohistoquímica mostraram que as proteínas para os membros do sistema TNF-α (TNF-α, TNFR1 e TNFR2) e do sistema interleucina I (IL-1β, IL-1RA, IL-1RI e IL-1RII) foram detectados em folículos pré-antrais e antrais. Foram observados níveis variáveis de RNAm para o sistema interleucina 1 nas diferentes categorias foliculares analisadas. Em relação ao cultivo in vitro de fragmentos ovarianos, a presença de TNF-α (10 ng/mL) reduziu a sobrevivência folicular e aumentou o número de células apoptóticas, enquanto que a adição de Dexametasona (10 ng/mL) ao meio de cultivo manteve a ultraestrutura folicular. Por outro lado, a presença de IL-1β (10 ou 50 ng/mL) foi capaz de manter a percentagem de folículos normais e de promover a ativação dos folículos primordiais. In vivo, um aumento na expressão de RNAm para TNF-α e TNFR1 foi observado 12 h após tratamento com GnRH. Níveis mais elevados de RNAm para TNFR2 foram observados em 3, 6 e 12 h após administração de GnRH. No entanto, foi observado um aumento nos níveis de RNAm para IL-1RA após 24h da indução por GnRH. In vitro, o TNF-α e a IL-1β não apresentaram efeito aditivo à expansão das células do cumulus. Os níveis de RNAm para TNF-α, TNFR1 e TNFR2 foram aumentados em CCOs cultivados por 12 h na presença de gonadotrofinas. A presença de gonadotrofinas aumentou os níveis de RNAm para IL-1R1 e IL-1RA em células do cumulus após cultivo por 24h. O TNF-α reduziu os níveis de RNAm para HAS-2, CASP3 e CASP6, enquanto que a IL-1β elevou os níveis de expressão de IL-β, IL-1RA e HAS-2 em células do cumulus cultivadas. Além disso, a IL-1β aumentou a expressão de iNOS após 24h de cultivo. A análise ultraestrutural confirmou a integridade dos CCOs cultivados na presença de TNF-α ou IL-1β. Em conclusão, os componentes do sistema TNF-α e do sistema interleucina 1 são expressos diferencialmente em células ovarianas. O TNF-α reduz a sobrevivência folicular in vitro, enquanto a Dexametasona mantém a ultraestrutura de folículos cultivados. Por outro lado, a IL-1β promove o desenvolvimento de folículos primordiais in vitro. A expressão do sistema TNF-α e do sistema IL-1 é regulada por gonadotrofinas in vivo e in vitro. A presença de TNF-α e IL-1β mantém a ultraestrutura normal de CCOs cultivados. Estes resultados sugerem um importante papel do sistema TNF-α e do sistema interleucina 1 na regulação da foliculogênese e ovulação em bovinos.