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The N6-methyladenosine, also known as m6A, is the most common post-transcriptional modification in mRNAs and long non-coding RNAs and that profoundly influences mRNA biology, from early processing in the nucleus to final steps of translation and decay in the cytoplasm. Taking into consideration the importance of RNA in shaping cell fate, m6A is widely recognized as an additional layer in the regulation of gene expression, also thanks to its dynamic and reversible nature. Therefore, it is not surprising that any misregulation in m6A content might lead to the loss of cellular homeostasis. This effect is particularly evident when it comes to stem cells differentiation, embryo development and cancer. In a tumorigenic context, the m6A could affect the development, progression, cancer stem cells (CSCs) renewal and drug resistance of solid and liquid tumours. So, the m6A is consistently becoming a new attractive pharmacological target. Neuroblastoma (NB) is a neuroendocrine tumour of early childhood that derives from undifferentiated cells of the sympathoadrenal lineage of the neural crest. About 50% of patients have a very aggressive form of NB, with an overall survival rate of less than 30% despite heavy treatments. Moreover, NB is a challenging druggable tumour due to a low rate of somatic mutations. Somatic mutations at significant frequency have been identified in only five genes that also show detectable expression. Among these, only one is currently a directly validated druggable target. Two m6A regulators (METTL14 and ALKBH5) are aberrantly expressed in high-risk NB patients, and their alteration in NB cell lines affects tumour aggressiveness. Specifically, the overexpression of the methyltransferase METTL14 increases cell proliferation and invasion in vitro and tumour growth in mice acting as an oncogene, while ALKBH5 restoration affects cell proliferation, apoptosis and invasion in an opposite fashion. Importantly, the demethylase ALKBH5 impaired tumour formation in vivo when costitutively expressed and dramatically slows down tumor progression in mice when is induced by causing massive apoptosis. These data suggest that ALKBH5 acts as a potent tumour suppressor in NB. We discovered that METTL14 and ALKBH5 exert their effect on different levels by affecting mRNA stability or translation, respectively. Although the contribution to NB of the altered stability of transcripts related to mRNA processing in METTL14-overexpressing cells is less understand, the increase translation of pro-apoptotic genes in the ALKBH5-overexpression condition leaves little doubts. Our results unveil the m6A and its regulators as potential therapeutic targets for treating NB. Indeed, in collaboration with the Laboratory of Genomic Screening of Professor Alessandro Provenzani, we presented an encouraging proof-of-concept of the reader YTHDF1 as a possible pharmacological target.

Enabling formulations are growing in popularity due to the large number of drugs within the pharmaceutical development pipeline that possess poor water solubility. These sophisticated formulation techniques can increase the solubility of the drug in aqueous media and/or aid in their dissolution. Amorphous solid dispersions (ASDs) are of particular interest due to their ability to generate highly supersaturated solutions upon dissolution. Typically, an ASD consists of amorphous drug homogenously blended with an amphiphilic polymer. The polymer has several roles including to facilitate drug release, as well as to inhibit crystallization of the drug from the solid matrix and from the supersaturated solution generated following dissolution. A phenomenon termed liquid-liquid phase separation (LLPS) or glass-liquid phase separation (GLPS) can occur during ASD dissolution when the amorphous solubility is exceeded. Here the drug attains its maximum thermodynamic activity in solution with the excess drug forming a second phase consisting of colloidal amorphous aggregates. It has been hypothesized that the presence of the colloidal amorphous aggregates could be advantageous in vivo since they can act as a drug reservoir and subsequently maintain the drug at its maximum thermodynamic activity in the gastro-intestinal fluid following solution depletion arising from permeation across the gastrointestinal membrane. However, there are few in vivo studies which test this hypothesis. If colloids form, the polymer must also inhibit crystallization from the drug-rich phase. Hence, the polymer has many roles during ASD dissolution making rational polymer selection for ASD formulation a complex process. While many studies, both past and present, probe drug release during dissolution, a limited number of studies address a mechanistic understanding of the polymer role during dissolution. The purpose of this study was to 1) investigate the interplay of the polymer’s ability to inhibit crystallization (thought to be primarily through hydrophobic interactions) and to facilitate drug release (via hydrophilic interaction with the aqueous media) on ASD performance and 2) determine the in vivo relevance of colloidal amorphous aggregates. Herein, a preliminary correlation was established between in vitro diffusion cell experiments and the amount of drug absorbed in rats. Further, it was found that rapid drug release through use of a relatively hydrophilic polymer is essential, and that the best crystallization inhibitors may be too hydrophobic to achieve adequate release. Therefore, a polymer needs to be an adequate crystallization inhibitor, but be able to release the drug upon oral administration. The implications from this study provides the necessary foundation for assessing ASD phase behavior and performance in vitro in order to make improved in vivo predictions. Ultimately, this research is expected to improve the speed of life-saving drugs progressing through the development pipeline and reduce drug development costs by reducing the need for animal testing.

Orientador: José Angelo Camilli / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T16:59:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_LucasPereiraLopesde_M.pdf: 1756933 bytes, checksum: 1c3778ee02f4dd8104d6a216a95db04b (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Alguns estudos mostram que a introdução do óxido de nióbio (Nb2O5) na composição do Bioglass® poderia ser uma solução para melhorar sua resistência mecânica, mantendo sua biocompatibilidade e bioatividade, porém, apesar da melhora na resistência mecânica causada pela adição deste óxido ser bem documentada na literatura, suas propriedades bioativas ainda são pouco conhecidas. Neste contexto, o objetivo do presente estudo foi avaliar experimentalmente as propriedades bioativas do óxido de nióbio em ratos albinos (Rattus norvegius) da linhagem Wistar. Para isso, bastões vítreos compostos por diferentes concentrações do Nb2O5 foram implantados na tíbia de ratos. Além disso, cada vidro teste, na forma de pó, foi implantado no músculo de ratos para análise de suas propriedades pró-angiogênicas, usando o Bioglass 45S5 (Bioglass®) como controle. As eutanásias foram realizadas 14 e 28 dias pós-cirurgias. Lâminas histológicas de cortes transversais das tíbias foram coradas a H&E para mensuração da área de osso subperiostal existente na cortical adjacente ao implante e a quantidade de osso esponjoso formado ao redor do bastão vítreo nos grupos de 14 dias, bem como da espessura da lâmina óssea formada ao redor do bastão nos grupos de 28 dias. Foi ainda realizada marcação imuno-histoquímica e a razão entre a área total do implante em mm2 e o número total de vasos sanguíneos contados manualmente num aumento de 400x para verificação a capacidade do material de estimular a angiogênese. A avaliação histológica revelou a ausência total de inflamação tanto após 14 quanto após 28 dias de implante. Os resultados das comparações entre as áreas de osso subperiostal dos grupos após 14 e 28 dias (feitas através de um teste ANOVA com post hoc tukey) e da quantidade de osso esponjoso formado ao redor do implante nos grupos 14 dias (feitas através do teste Kruskal-Wallis com Mann-Whitney como post hoc) mostraram que o BGPN1.3 apresentou maior capacidade de induzir a formação óssea do que o grupo controle, já com relação ao número de vasos sanguíneos e espessura da lâmina óssea formada ao redor do implante todos os grupos apresentaram resultado semelhantes. Assim, se concluiu que o BGPN1.3 trata-se de um material inovador por ser biocompatível, apresentar propriedade osteoindutiva superior e capacidade pró-angiogênica semelhante ao Bioglass® / Abstract: Some studies show that the introduction of niobium oxide (Nb2O5) into Bioglass® composition could be a solution to improve its mechanical strength while maintaining its biocompatibility and bioactivity, but in spite of improvement in resistance caused by addition of the oxide is well documented in the literature, their bioactive properties are still poorly known. In this context, the aim of this study was to experimentally evaluate the bioactive properties of niobium oxide in albino rats (Rattus norvegius). For this, glassy rods composed of different concentrations of Nb2O5 were implanted in the rats¿ tibia. In addition, each test glass in powder form was implanted into the muscle of mouse for analysis of their pro-angiogenic properties using 45S5 Bioglass (Bioglass®) as control. Euthanasia were performed 14 and 28 days post-surgery. Histological slides of cross sections of tibiae were H & E stained for measuring the area of existing subperiosteal bone in adjacent to the implant and the amount of cancellous bone formed around the vitreous rod after 14 days pos-surgery as well as the thickness of the formed bone sheet around the rod in groups of 28 days. It was also performed immunohistochemical staining to calculate the ratio between the total area in mm2 of the implant and the total number of blood vessels, counted manually using a magnification of 400x, to check the capacity of the material to stimulate angiogenesis. Histological evaluation revealed the complete absence of inflammation after both 14 and after 28 days of implantation. The results of the comparisons between the areas of subperiosteal bone of groups after 14 and 28 days (made by an ANOVA with Tukey post hoc test) and the amount of cancellous bone formation around the implant in the groups 14 days (done by Kruskal -Wallis with Mann-Whitney post hoc) revealed that BGPN1.3 showed greater ability to induce bone formation than the control group, when compared the number of blood vessels and thickness of the blade bone formed around the implant all groups showed similar results. Thus, we concluded that BGPN1.3 is an innovative material to be biocompatible and display better osteoinductive property than Bioglass® showing similar pro-angiogenic capacity / Mestrado / Anatomia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Eliana Maria Zanotti Magalhães / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T23:25:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Simoes_LucianaFranceschi_D.pdf: 13158668 bytes, checksum: 8fb7b4a656ae812560a18a5466806eea (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A busca de novos tratamentos para a esquistossomose é relevante devido a constatação de linhagens do Schistosoma mansoni com perda de sensibilidade aos fármacos atuais. A interferência por RNA (RNAi) é uma técnica que pode ser usada no silenciamento de um gene especifico, através de um RNA dupla fita (dsRNA). Essa ferramenta se mostra eficaz em aplicações terapêuticas em vírus, príons e patógenos intracelulares. Estudos mostram que a técnica do RNAi é bastante eficiente no verme Caenorhabditis elegans. Até o momento poucos trabalhos analisaram a técnica de RNAi no combate a esquistossomose. Este trabalho teve como objetivo aplicar a técnica da interferência por RNA em S. mansoni e avaliar sua eficiência em testes in vitro e in vivo, tendo como alvo o gene fucosiltransferase, enzima envolvida no processo de fucosilação de lipídios e proteínas essenciais ao parasita e o gene glicosilfosfatidilinositol, que atua como ancora de superfície, na qual se ligam antígenos protéicos e glicoprotéicos. A supressão gênica foi estudada em testes in vitro e in vivo, com observações da atuação na biologia, morfologia e mortalidade dos vermes. Como resultados nos testes in vitro, obtiveram-se alterações tegumentares nos adultos, extravasamento do conteúdo interno de fêmeas e alterações na oviposição, apresentando os grupos tratados maior quantidade de ovos mortos e malformados quando comparados com os grupos controles. Nos experimentos in vivo verificou-se diminuição no numero de vermes recuperados, mortalidade de vermes em alguns grupos tratados, e alteração na oviposição, quando examinados pelas técnicas de Kato e oograma. Análise histológica do fígado mostrou diferenças no número, na área e na conformação dos granulomas dos grupos tratados quando comparados com os grupos controles. A mortalidade de ovos eliminados nas fezes de camundongos após dois dias de tratamento também se mostrou significativamente maior nos grupos tratados com moléculas para silenciamento. Esses resultados sugerem o potencial uso da técnica de RNAi no estudo da esquistossomose / Abstract: The search for new schistosomiasis treatments is relevant due to the observation of resistant Schistosoma mansoni strains for current drugs. The interference by RNA (RNAi) is a technique which can be used for silencing a specific gene using a double strain RNA (dsRNA). This methodology presents efficacy in therapeutic use in virus, prions, and intracellular pathogens. Studies demonstrate that RNAi technique is very efficient in Caenorhabditis elegans worm. Up to the moment, a few studies have analyzed the RNAi technique against schistosomiasis. Thus, the aims of this study were apply the interference by RNA in S. mansoni and evaluate its efficiency in in vitro and in vivo tests, having the fucosyltransferase gene, an enzyme involved in parasite essential lipids and proteins fucosilation process, and the glicosylfosfatidilinositol gene, which acts as anchor-surface where proteic and glicoproteic antigens are bonded, as targets. The genic suppression was studied in in vitro and in vivo tests, with observation of its action in the biology, morphology, and mortality of the worms. The results for in vitro testswere integumentary alteration in adults, internal content extravasation in females, and oviposition alteration, with higher amount of dead eggs and not well formed eggs in the treated groups in comparison with the control groups. The in vivo tests presented a decrease in the number of recovered worms, worm mortality in some groups, and oviposition alteration when analyzed under the Kato and oogram techniques. Histological analysis of the liver presented differences in the number, area, and conformation of the granulomas of the treated groups in comparison with the control groups. The mortality of the eggs eliminated on the mice feces after two days of treatment were also significantly higher in the groups treated with the silencing molecules. These results suggest the potential use of the RNAi technique in the schistosomiasis treatment / Doutorado / Relações Antrópicas, Meio Ambiente e Parasitologia / Doutora em Biologia Animal

A nefrolitíase pode ser definida como uma consequência de alterações nas condições de cristalização da urina no trato urinário. A incidência desta patologia nos Estados Unidos é de 5 % em mulheres e 12 % em homens e sua recorrência é de 50 % em 5 a 10 anos e 75 % em 20 anos. Cálculos renais são compostos por porções inorgânicas e orgânicas. Em seres humanos, a porção inorgânica é principalmente composta por sais de cálcio (cerca de 80 %), seguido pelos cálculos de ácido úrico (5-10 %). Estes também podem ser compostos por estruvita, cistina, entre outros.Quanto à matriz orgânica, ela é formada predominantemente por proteínas, como a nefrocalcina, osteopontina, hemoglobina, proteína de Tamm Horsfall, entre outras. As formas de tratamento desta patologia consistem em intervenção cirúrgica ou litotripsia de ondas de choque extracorpóreas (LOCE). As plantas pertencentes ao gênero Copaifera (Fabaceae, caesalpinoideae) são nativas de regiões tropicais da América Latina e da África Ocidental. Conhecidas no Brasil como copaibeiras, e popularmente como pau dóleo, estas árvores encontram-se amplamente distribuídas na Amazônia e regiões centrais do Brasil. C. langsdorffii Desf. é a espécie mais comum fora da Região Amazônica. Estudos realizados com seu óleoresina demonstraram diferentes atividades biológicas, tais como cicatrizante e antiinflamatória. Partes aéreas de C. langsdorffii foram coletadas no Campus da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto - USP e utilizadas na obtenção do extrato hidroalcoólico 7:3. Este extrato foi submetido a diferentes modalidades cromatográficas com o objetivo de isolar seus principais componentes. Para os ensaios in vivo, as pastilhas de oxalato de cálcio foram obtidas por meio de uma reação de supersaturação e a nefrolitíase foi induzida introduzindo-se estas pastilhas na bexiga de ratos. O tamanho dos cálculos, a bioquímica urinária e variáveis gerais, tais como peso corpóreo, volume de urina coletada por 24 horas e volume de água ingerida foram determinados. O extrato hidroalcoólico de partes aéreas de C. langsdorffii é constituído majoritariamente de compostos polares. Duas substâncias pertencentes à classe dos flavonóides foram isoladas e identificadas: os flavonóis quercetrina (quercetina 3-O--L-ramnopiranosídeo) e canferol 3-O--Lramnopiranosídeo. No ensaio in vivo, os animais tratados com o extrato hidroalcoólico de C. langsdorffii apresentaram menor média na massa de cálculos formados e menor média no número de cálculos formados (matriz + satélites). Além disso, sugere-se que o tratamento com o extrato altere a morfologia dos cálculos, já que a pressão necessária para desintegrar os cálculos dos animais sem tratamento é, em média, cerca de duas vezes maior do que a necessária para desintegrar aqueles retirados de animais tratados (6,90±3,45 vs. 3,00±1,51 kgf). / Nephrolithiasis can be defined as a consequence of alterations in the crystallization conditions of urine in the urinary tract. The incidence of the disease in United States is 5 % in women and 12 % in men and the recurrence is 50 % in 5 to 15 years and 75 % in 20 years. Renal calculi are composed by inorganic and organic portions. In humans, the inorganic portion is principally composed by calcium salts (around 80 %) and uric acid calculi (5-10 %). Also, they can be composed by struvite, cystine and so on. As far as the organic matrix is concerned, proteins, like nephrocalcin, osteopontin, hemoglobin and Tamm Horsfall protein basically compose it. The current treatment of nephrolithiasis is based on surgical interventions and extracorporeal shock wave lithotripsy (ESWL). Plants belonging to the genus Copaifera (Fabaceae, caesalpinoideae) are native of tropical regions of Latin America and Occidental Africa. In Brazil, known as copaibeiras, they are widely found in Amazon and central regions. C. langsdorffii Desf. is the specie commonly found out of the Amazon region. Studies with its oil-resin have showed biological properties, including healing and anti-inflammatory activities. Aerial parts of C. langsdorffii were collected at the FCFRP - USP Campus and used to obtain the hydroalcoholic extract 7:3. The extract was submitted to several chromatographic procedures in order to isolate its main compounds. In the in vivo assays, calcium oxalate disks were obtained by a supersaturation reaction and nephrolitiasis was induced by the introduction of those disks in the bladder of rats. Calculi size, urinary biochemistry and general parameters, e.g. body weight, 24 hours urine and water volume ingested were determined. Hydroalcoholic extract of aerial parts of C.langsdorffii is rich in polar compounds. Two compounds from flavonoids group were isolated and identified: the flavonols quercitrin (quercetin 3-O--L-rhamnopyranoside) and kaempferol 3-O--L-rhamnopyranoside. Results of in vivo experiments demonstrated that animals treated with C. langsdorffii showed reductions in the mean calculi mass and in the mean number of calculi (matrix and satellites). Besides, the experiment suggests that the treatment with C. langsdorffii modifies the calculi morphology, since the pressure needed to break calculi of non-treated animals is more than two-fold larger than the pressure needed to break those taken from treated animals (6,90±3,45 vs. 3,00±1,51 kgf).

A nefrolitíase pode ser definida como uma consequência de alterações nas condições de cristalização da urina no trato urinário. A incidência desta patologia nos Estados Unidos é de 5 % em mulheres e 12 % em homens e sua recorrência é de 50 % em 5 a 10 anos e 75 % em 20 anos. Cálculos renais são compostos por porções inorgânicas e orgânicas. Em seres humanos, a porção inorgânica é principalmente composta por sais de cálcio (cerca de 80 %), seguido pelos cálculos de ácido úrico (5-10 %). Estes também podem ser compostos por estruvita, cistina, entre outros.Quanto à matriz orgânica, ela é formada predominantemente por proteínas, como a nefrocalcina, osteopontina, hemoglobina, proteína de Tamm Horsfall, entre outras. As formas de tratamento desta patologia consistem em intervenção cirúrgica ou litotripsia de ondas de choque extracorpóreas (LOCE). As plantas pertencentes ao gênero Copaifera (Fabaceae, caesalpinoideae) são nativas de regiões tropicais da América Latina e da África Ocidental. Conhecidas no Brasil como copaibeiras, e popularmente como pau dóleo, estas árvores encontram-se amplamente distribuídas na Amazônia e regiões centrais do Brasil. C. langsdorffii Desf. é a espécie mais comum fora da Região Amazônica. Estudos realizados com seu óleoresina demonstraram diferentes atividades biológicas, tais como cicatrizante e antiinflamatória. Partes aéreas de C. langsdorffii foram coletadas no Campus da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto - USP e utilizadas na obtenção do extrato hidroalcoólico 7:3. Este extrato foi submetido a diferentes modalidades cromatográficas com o objetivo de isolar seus principais componentes. Para os ensaios in vivo, as pastilhas de oxalato de cálcio foram obtidas por meio de uma reação de supersaturação e a nefrolitíase foi induzida introduzindo-se estas pastilhas na bexiga de ratos. O tamanho dos cálculos, a bioquímica urinária e variáveis gerais, tais como peso corpóreo, volume de urina coletada por 24 horas e volume de água ingerida foram determinados. O extrato hidroalcoólico de partes aéreas de C. langsdorffii é constituído majoritariamente de compostos polares. Duas substâncias pertencentes à classe dos flavonóides foram isoladas e identificadas: os flavonóis quercetrina (quercetina 3-O--L-ramnopiranosídeo) e canferol 3-O--Lramnopiranosídeo. No ensaio in vivo, os animais tratados com o extrato hidroalcoólico de C. langsdorffii apresentaram menor média na massa de cálculos formados e menor média no número de cálculos formados (matriz + satélites). Além disso, sugere-se que o tratamento com o extrato altere a morfologia dos cálculos, já que a pressão necessária para desintegrar os cálculos dos animais sem tratamento é, em média, cerca de duas vezes maior do que a necessária para desintegrar aqueles retirados de animais tratados (6,90±3,45 vs. 3,00±1,51 kgf). / Nephrolithiasis can be defined as a consequence of alterations in the crystallization conditions of urine in the urinary tract. The incidence of the disease in United States is 5 % in women and 12 % in men and the recurrence is 50 % in 5 to 15 years and 75 % in 20 years. Renal calculi are composed by inorganic and organic portions. In humans, the inorganic portion is principally composed by calcium salts (around 80 %) and uric acid calculi (5-10 %). Also, they can be composed by struvite, cystine and so on. As far as the organic matrix is concerned, proteins, like nephrocalcin, osteopontin, hemoglobin and Tamm Horsfall protein basically compose it. The current treatment of nephrolithiasis is based on surgical interventions and extracorporeal shock wave lithotripsy (ESWL). Plants belonging to the genus Copaifera (Fabaceae, caesalpinoideae) are native of tropical regions of Latin America and Occidental Africa. In Brazil, known as copaibeiras, they are widely found in Amazon and central regions. C. langsdorffii Desf. is the specie commonly found out of the Amazon region. Studies with its oil-resin have showed biological properties, including healing and anti-inflammatory activities. Aerial parts of C. langsdorffii were collected at the FCFRP - USP Campus and used to obtain the hydroalcoholic extract 7:3. The extract was submitted to several chromatographic procedures in order to isolate its main compounds. In the in vivo assays, calcium oxalate disks were obtained by a supersaturation reaction and nephrolitiasis was induced by the introduction of those disks in the bladder of rats. Calculi size, urinary biochemistry and general parameters, e.g. body weight, 24 hours urine and water volume ingested were determined. Hydroalcoholic extract of aerial parts of C.langsdorffii is rich in polar compounds. Two compounds from flavonoids group were isolated and identified: the flavonols quercitrin (quercetin 3-O--L-rhamnopyranoside) and kaempferol 3-O--L-rhamnopyranoside. Results of in vivo experiments demonstrated that animals treated with C. langsdorffii showed reductions in the mean calculi mass and in the mean number of calculi (matrix and satellites). Besides, the experiment suggests that the treatment with C. langsdorffii modifies the calculi morphology, since the pressure needed to break calculi of non-treated animals is more than two-fold larger than the pressure needed to break those taken from treated animals (6,90±3,45 vs. 3,00±1,51 kgf).

Doctor of Philosophy / Department of Chemistry / Duy H. Hua / The objectives of this research project were to (i) synthesize different bicyclic and tricyclic pyrone and pyridinone compounds; (ii) study the mechanism of action of these compounds in solution as anti-Aβ (amyloid β) agents using different biophysical techniques; and (iii) study the biological activity of pyrone compounds for the counteraction of Aβ toxicity using MC65 cells, a human neuroblastoma cell line and 5X- familial Alzheimer’s disease (5X FAD, a transgenic mice with five different mutations) mice. A series of tricyclic pyrone and pyridinone compounds were investigated. The tricyclic pyrones and pyridinones were synthesized utilizing a condensation reaction between cyclohexenecarboxaldehye (25) and 4-hydroxy-6-methyl-2-pyone (24) or 4-hydroxy-6-methyl-2-pyridinone (51), respectively. A tricylic pyrone molecule CP2 (2, code name) was synthesized and has an adenine base unit attached to the pyrone core. For structure activity relationship (SAR) studies, the adenine group of CP2 was replaced with other DNA base units (thymine, cytosine and guanine) and various heterocyclic moieties. Since nitrogen containing compounds often exhibit increased bioactivity and brain-penetrating abilities, oxygen atom (O5’) was displaced with a nitrogen atom in the middle ring of the tricyclic pyrone. A condensation reaction of pyrone 51 and 25 was carried out to give the linear pyranoquinoline (52) and the L-shaped pyranoisoquinoline (53). The neurotoxicity of amyloid-β protein (Aβ) is widely regarded as one of the fundamental causes of neurodegeneration in Alzheimer’s disease (AD). Recent studies suggest that soluble Aβ oligomers rather then protofibrils and fibrils may be the primary toxic species. Different biophysical techniques including atomic force microscopy (AFM), circular dichroism (CD), surface plasmon resonance (SPR) spectroscopy, and protein quantification assays were used to study the mechanism of aggregation of Alzheimer Aβ peptide in solution. In search of potentially bioactive compounds for AD therapies, MC65 cell line was used as a screening model. Different tricyclic pyrone and pyridinone compounds protect MC65 cells from death. We studied the efficacy of CP2 in vivo by treatment of 5X FAD mice, a robust Aβ42-producing animal model of AD, with a 2-week course of CP2, which resulted in 40% and 50% decreases in non-fibrillar and fibrillar Aβ species respectively.

O câncer de mama constitui o segundo tipo de câncer mais frequente no mundo e o mais comum entre as mulheres, representando uma das principais causas de morte. O tamoxifeno é um fármaco antiestrogênico utilizado para o tratamento deste tipo de câncer desde 1971 e ainda é o mais utilizado nos casos de tumores mamários que expressam receptores de estrógeno. Apesar de apresentar resultados significativamente positivos, seu efeito antiestrogênico não se restringe apenas ao sítio tumoral causando, com isso, efeitos colaterais graves que podem deixar sequelas. A proposta deste trabalho foi desenvolver sistemas de liberação nanoparticulados à base de PLA e PLA-PEG para veiculação do tamoxifeno, como uma estratégia para o potencial aumento da segurança e da eficácia deste fármaco através de um possível direcionamento passivo ao sítio de ação, devido à permeabilidade vascular aumentada destas regiões tumorais. As nanopartículas foram preparadas pela técnica de nanoprecipitação e apresentaram diâmetro médio inferior a 200 nm para a maioria das formulações. Foram avaliados três estabilizantes, o poloxamer 407, o poloxamer 188 e o polissorbato 80, este último proporcionou maior eficiência de encapsulação, 86,7% e 100%, nas nanopartículas de PLA e PLA-PEG, respectivamente. Quanto à composição das nanopartículas de PLA-PEG, o polímero utilizado inicialmente (PLA(1000)-PEG(750)) apresentou distribuição de tamanho heterogênea, perfil multimodal e alto índice de polidispersividade. Assim, este polímero foi substituído pelo PLA(5000)-PEG(1000), que apresentou distribuição de tamanho uniforme, perfil monomodal e baixo índice de polidispersividade. A caracterização por microscopia eletrônica de varredura comprovou a homogeneidade no tamanho de partícula, mostrando seu formato esférico. As análises de espectrofotometria no infravermelho e calorimetria diferencial exploratória sugeriram que não ocorreu nenhum tipo de interação ou reação entre o fármaco e os demais componentes das formulações. Dois métodos analíticos para a determinação do tamoxifeno foram validados com sucesso por CLAE e espectroscopia UV-vis. O perfil de liberação in vitro do tamoxifeno a partir das nanopartículas de PLA apresentou característica sustentada e alcançou 50% em 180 h, tendo sido totalmente liberado após 288 h. Já as nanopartículas de PLA(5000)-PEG(1000) liberaram apenas 16,9% do fármaco após 216 h. A liberação do fármaco a partir das nanopartículas foi muito mais lenta comparada ao tamoxifeno não encapsulado, evidenciando a vantagem da incorporação do fármaco em nanopartículas compostas por PLA e PLA-PEG. No estudo do perfil de concentração plasmática em ratas Wistar, não foi possível detectar o fármaco e seu principal metabólito pelo método por CLAE desenvolvido, sugerindo que os sistemas nanoparticulados tenham extravasado rapidamente para os órgãos. / Breast cancer is the second most frequent type of cancer in the world and it is the most common among women, representing a major cause of death. Tamoxifen is an antiestrogen drug used in the treatment of this type of cancer since 1971 and it is the most employed drug in the treatment of breast cancer subtypes that expresses estrogen receptors. Despite presenting significantly positive results, its antiestrogen effect is not restricted to the tumour site, causing, as consequence, severe side effects. The purpose of this work was to develop nanostructured drug delivery systems based on PLA and PLA-PEG loaded with tamoxifen, as a strategy to potentially increase the safety and efficacy of this drug through a possible passive accumulation the site of action, due to the enhanced vascular permeability of tumour sites. Nanoparticles were prepared by the nanoprecipitation technique and presented average diameter smaller than 200 nm for the majority of the formulations. Three stabilizing adjuvants were analysed, poloxamer 407, poloxamer 188 and polysorbate 80 and the last one yielded the highest encapsulation efficiency, 86.7% and 100%, for the PLA and PLA-PEG nanoparticles, respectively. Regarding the PLA-PEG nanoparticles composition, the first polymer employed was (PLA(1000)-PEG(750)), which presented heterogeneous particle size distribution, multimodal profile and high polydispersity index. So, it was replaced by PLA(5000)-PEG(1000), which exhibited uniform particle size distribution, monomodal profile and low polydispersity index. The characterization by scanning electron microscopy confirmed the homogeneity of particles size, evidencing their spherical shape. Infrared spectrophotometry and differential scanning calorimetry analysis suggested that any interaction or reaction had occurred between the drug and the other components of the formulations. Two analytical methods for tamoxifen quantification were successfully validated by HPLC and UV-vis spectroscopy. In vitro tamoxifen release profile from PLA nanoparticles presented sustained release and reached 50% in 180 h, being completely released after 288 h, whereas PLA(5000)-PEG(1000) nanoparticles released only 16.9% of tamoxifen after 216 h. Drug release from nanoparticles was much slower compared to the non-encapsulated tamoxifen, showing the advantage of nanoparticles composed of PLA and PLA-PEG. In the plasmatic concentration profile study carried out in Wistar rats, it was not possible to detect tamoxifen or its main metabolite by the HPLC method, suggesting that nanoparticles quickly extravased to organs.

O câncer de mama é a segunda principal causa de morte entre as mulheres nos países em desenvolvimento, devido ao seu alto grau de malignidade. O tratamento baseia-se, principalmente, em terapias hormonais, uma vez que as células deste tipo de tumor expressam, em sua maioria, um elevado número de receptores hormonais, responsáveis pela regulação do crescimento do mesmo. O tamoxifeno é um fármaco da classe dos moduladores seletivos de receptores de estrógeno, que atua através do antagonismo à ativação de tais receptores por este hormônio, reduzindo, assim, a taxa de crescimento celular do tecido tumoral. Embora o tratamento com tamoxifeno seja altamente efetivo, este se relaciona a severos efeitos colaterais dosedependentes. O objetivo central deste trabalho foi desenvolver sistemas micelares de longo tempo de circulação contendo tamoxifeno, preparados à base do fosfolipídeo DSPE-PEG(n), associado ou não ao derivado de vitamina E TPGS, para administração intravenosa, capazes de permitir um acúmulo maior do fármaco no sítio tumoral devido a suas dimensões nanométricas, permitindo, desta forma, a redução da dose e a consequente redução dos efeitos colaterais. A determinação da eficiência de encapsulação e a quantificação do tamoxifeno no estudo de liberação in vitro a partir dos sistemas obtidos foram realizadas por CLAE, utilizando métodos previamente validados. Os melhores resultados foram alcançados com as formulações à base de DSPE-PEG(2000) e TPGS, preparadas pelo método de evaporação do solvente, as quais apresentaram diâmetro médio inferior a 20 nm, baixo índice de polidispersividade e eficiência de encapsulação entre 70 e 95%. A análise por microscopia eletrônica de transmissão evidenciou o formato esférico e comprovou a homogeneidade do tamanho das partículas. Os sistemas foram caracterizados, ainda, por espectrofotometria no infravermelho para avaliação de possíveis interações entre os componentes das formulações. O perfil de liberação in vitro demonstrou que após 168 h, no máximo cerca de 30% do fármaco foi liberado, verificando-se que o aumento na quantidade de TPGS na formulação reduziu a porcentagem de tamoxifeno liberado. A baixa taxa de liberação in vitro sugere que a maior parte do fármaco mantenha-se no interior da estrutura micelar durante o período de permanência no sangue, favorecendo a chegada da nanoestrutura íntegra ao sítio tumoral. No estudo do perfil de concentração plasmática em ratas Wistar, não foi possível detectar o fármaco e seu principal metabólito pelo método por CLAE desenvolvido, sugerindo que os sistemas micelares tenham extravasado rapidamente para os órgãos. / Breast cancer is the second main cause of death among women in development countries due to their high malignance grade. The treatment is mainly based on hormonal therapies, once the cells of the majority of mammary tumors express a high number of hormone receptors, responsible for the tumor growth. Tamoxifen is a selective estrogen receptor modulator drug, acting through the antagonism of the activation of the estrogen receptor, reducing thus the tumor growing rate. Despite the treatment with tamoxifen is highly effective, it is related to severe dose-dependent side effects. The central objective of this work was the development of long time circulation micelles containing tamoxifen, prepared with the phospholipid DSPEPEG(n) and TPGS, a vitamin E derivative, by the method of solvent evaporation, for intravenous administration, able to allow a higher accumulation of the drug at the tumoral site due to their nanometric dimensions, leading to a reduction in the dose and consequently in the side effects. The determination of the encapsulation efficiency and the quantification of tamoxifen in the in vitro release profile study from the micellar systems were carried out by HPLC, using methods previously validated. The best results were achieved with the formulations based on DSPE-PEG(2000) and TPGS, which showed mean particle diameter less than 20 nm, low polydispersity index and encapsulation efficiency ranging from 70 to 95%. The transmition electronic microscopy pointed the spherical shape and proved the homogeneity of particle size. The systems were also characterized by infrared spectrophotometry to identify eventual interactions among the components of the formulations. The in vitro release profile study showed that after 168 h, a maximum of about 30% of tamoxifen was released, evidencing that the increase of the TPGS amount in the formulation reduced the amount of tamoxifen released. The low rate of in vitro release drug suggests that the major part of the drug will remain encapsulated during the period of blood permanence, favoring the arrival of the intact nanostructure at the tumoral site. During the evaluation of the plasmatic concentration profile, conducted with Wistar rats, it was not possible to detect neither the tamoxifen nor its main metabolite, suggesting that the intact micelles may have quickly accumulated in the organs.