Tot i que la hipometilació global i regional del DNA va ser la primera alteració epigenètica detectada en tumors, les dificultats en el seu estudi, així com la manca de metodologies específiques que en permetin un anàlisi detallat, han fet que desconeguem en gran mesura els efectes que aquest fenomen té per a la cèl·lula tumoral. En aquesta tesi ens vàrem proposar realitzar estudis globals i específics que permetessin establir possibles associacions entre la hipometilació i la inestabilitat genètica en tumors primaris humans. En primer lloc es va dur a terme la caracterització dels patrons de metilació globals en una sèrie de tumors colorectals. Aquest anàlisi ens va permetre observar una correlació positiva entre el grau de desmetilació dels tumors primaris i el nombre d'alteracions cromosòmiques que aquests acumulen. Per a continuar aprofundint en l'estudi de la hipometilació en tumors, i donada la manca de metodologies específiques per a realitzar aquesta mena d'estudis, ens vàrem proposar desenvolupar una nova metodologia d'anàlisi de la metilació, centrada en l'anàlisi dels elements repetitius dispersos Alu, els quals contenen una fracció important de la metilació del DNA en humans. Així es com va sorgir la nova metodologia Amplification of UnMethylated Alu (AUMA), recollida en el segon treball. L'aplicació d'AUMA a una sèrie de tumors colorectals ens ha permès identificar elements repetitius Alu desmetilats al llarg de tot el genoma i també ens ha permès identificar elements Alu amb alteracions de la metilació en tumors. Un anàlisi bioinformàtic paral·lel ens ha permès complementar els resultats obtinguts experimentalment. En aquest treball hem desenvolupat també una nova metodologia de quantificació d'elements Alu desmetilats, la qual hem anomenat Quantification of UnMethylated Alu (QUMA) i de la qual no hi ha cap precedent en la literatura. De l'estudi d'una de les alteracions de la metilació detectades en patrons AUMA n'ha sorgit el tercer treball d'aquesta tesi. En aquest cas hem fixat la nostra atenció en un element repetitiu MIR desmetilat en teixit normal, el qual s'hipermetila en tumors amb una elevada freqüència. L'estudi de l'estat de metilació de les illes CpG dels gens adjacents a aquest element MIR ens ha conduït a la identificació de 8 noves illes CpG hipermetilades en tumors i línies cel·lulars de càncer colorectal. L'anàlisi de les modificacions d'histones associades al silenciament d'aquests gens ens ha permès identificar patrons de cromatina molt semblants als descoberts recentment en cèl·lules mare embrionàries, connectant així la biologia de les cèl·lules mare amb el desenvolupament del càncer. / Although hypomethylation was the first tumor-associated DNA methylation alteration in tumors to be discovered, its role in tumorigenesis has remained basically unexplored, mainly due to the lack of specific methodologies of study. In the first work, we performed a global analysis of DNA methylation and genetic alterations in a series of colorectal tumors. Results indicate that a positive correlation exists between the degree of DNA hypomethylation and the number of genetic alterations that a tumor cell accumulates. In order to gain insight into the role that DNA hypomethylation might play in tumor development, we proposed to develop new methodologies that would allow performing both global and specific analyses of DNA hypomethylation, constituting the second work in this thesis. The new methodology mainly targets Alu repeats, which have been previously found to be heavily methylated in most somatic tissues, and has been therefore named Amplification of unMethylated Alu (AUMA). AUMA application to a series of primary colorectal tumors allowed the genome-wide identification of multiple unmethylated Alu elements in normal tissues, as well as Alu elements with altered methylation patterns in tumors. We also aimed to develop a quantification method, which was named Quantification of UnMethylated Alu (QUMA). Both AUMA and QUMA experimental results were complemented using a bioinformatic approach, which indicated that there is a stronger pressure to methylate younger Alu elements, among which there are elements able to retrotranspose. In a third work, we focused on the specific analysis of an AUMA target. A MIR element unmethylated in normal colorectal mucosa was found to undergo extensive hypermethylation in a large proportion of tumors. DNA methylation analysis of promoter CpG methylation of genes around the MIR element allowed the identification of 8 clustered genes whose CpG islands become hypermethylated in colorectal tumors and cell lines. Histone modification profiling across the promoters of the DNA methylated genes identified chromatin profiles that closely resemble those found in embryonic stem cells, therefore linking stem cells biology with cancer development.

Estudios recientes han permitido estimar que aproximadamente un 5% del genoma consiste en duplicaciones segmentarias (DS), secuencias de entre 1-100 kb con un nivel de similitud de más del 95% (Eichler, 2001). Las regiones flanqueadas por duplicaciones segmentarias son susceptibles de sufrir reordenamientos mediante recombinación homóloga no alélica y se ha hipotetizado que estas regiones representan puntos calientes de inestabilidad genómica propensos a variación en número de copia (CNVs). Esta variación estructural (deleciones, duplicaciones e inversiones) representa una fuerza mutacional infravalorada en la contribución a las enfermedades genéticas, y en particular en los loci susceptibles a retraso mental. La aparición de nuevas tecnologías como los arrays de CGH o el MLPA permiten el análisis de alta resolución para la identificación de alteraciones genéticas y variaciones en número de copia a nivel de todo el genoma. La aplicación de estas tecnologías ha permitido, recientemente, establecer la implicación de microdeleciones y microduplicaciones en diversas enfermedades genéticas, como por ejemplo el retraso mental (RM). Las técnicas convencionales (cariotipo, FISH, CGH o PCR) de las que disponemos actualmente para el estudio de enfermedades genéticas como el retraso mental no son los suficientemente sensibles para la detección de reordenamientos submicroscópicos. Disponiendo de la tecnología y el material adecuado, es posible la caracterización molecular nuevas variantes geonómicas en retraso mental. Debido a la gran cantidad de casos de RM en los que se desconoce su etiología, el objetivo principal de esta tesis ha sido la caracterización de variantes genómicas responsables de RM aplicando nuevas tecnologías: aCGH del cromosoma X y MLPA. El MLPA se basa en la detección simultánea del número de copias de una secuencia específica mediante la hibridación genómica del DNA con una mezcla de sondas específicas. La cantidad relativa del producto amplificado se correlaciona con el número de copias de la secuencia diana de esa sonda. Por otro lado, los arrays de CGH permiten detectar reordenamientos cromosómicos desequilibrados de <1 Mb. Con el uso de clones genómicos distribuidos de forma que cubran la totalidad del cromosoma X se puede generar un array específico que permitirá obtener un cariotipo molecular de este cromosoma a nivel de 100kb, lo que permitirá detectar microdeleciones, microduplicaciones e inversiones del cromosoma X. Esta parte del proyecto que incluye tanto el diseño, la construcción y validación del array como la hibridación de las muestras se realiza de forma coordinada con el Centro de Regulación de Barcelona (CRG).Para este estudio se seleccionaron pacientes procedentes de familias con herencia compatible con un RM ligado al cromosoma X. Estas familias procedían del Departamento de Bioquímica y Genética Molecular del Hospital Clínico de Barcelona y del grupo GIRMOGEN (Grupo Investigación Retraso Mental de Origen Genético). A todos ellos se les había realizado previamente un cariotipo, se había descartado la expansión del triplete CGG el gen FMR1, responsable del Síndrome del X frágil y no se habían detectado reordenamientos subteloméricos. Gracias a la aplicación de estas tecnologías hemos identificado y caracterización de nuevas variantes genómicas implicadas en RM (11,5%). La detección de reordenamientos cripticos en pacientes afectos de estas enfermedades nos ha permitido establecer una correlación genotipo/fentipo e identificar nuevos genes y mecanismos implicados en el desarrollo del RM. / "CARACTERIZATION OF GENOMIC VARIANTS. APLICATION OF NEW TECHONOLOGIES TO THE STUDY OF MENTAL RETARDATION" TEXT:Mental Retardation (RM) is a common disorder affecting 1-3% of general population. X-linked MR represents and important group inside MR. Nowadays OMIM lists 359 entries about XLMR although only 44 X-linked genes are known to cause XLMR (syndromic and non-syndromic). On the other hand, subtelomeric rearrangements comprise 5-7% of MR with unknown genetic origin. There are few reports about submicroscopic rearrangements that affect X chromosome due to the difficulties that implicate these studies. CGHarray (array-based comparative genomic hibridization) measures submicroscopic DNA copy number changes and allows the simultaneous high-resolution mapping of these changes onto the genome sequence. With the construction and application of a specific CGH microarray, it will be possible to characterize different molecular variants inside this chromosome in those cases of MRLX without molecular diagnosis. On the other hand, MLPA is based in the simultaneous detection of the number of copies of a specific sequence through hybridization of genomic DNA with a mixture of specific probes. The main objective of the present project is to identify submicroscopic duplications and deletions affecting chromosome X in patients with non-syndromic. For this study we selected patients from families with an inheritance consistent with an XLMR. These families came from the Department of Biochemistry and Molecular Genetics at the Hospital Clinical of Barcelona and the GIRMOGEN group (Research Group for Mental Retardation of Genetic Origin). The application of new techonolgies such as MLPA o aCGH has led to the identification of new rearrangements in the X chromosome responsible for MR (11,5%). The detection of cryptic rearrangements in MR patients has enabled us to establish a gentype/phenotype correlation and to identify new genes and mechanisms involved in the development of MR.