Det finns två olika former av isolering. Smittskyddsisolering används för att förhindra smittspridning när en patient blivit smittad av en allmänfarlig infektion och skyddsisolering för att förhindra att en patient som är extra infektionskänslig, exempelvis vid immunsupprimerande behandling, blir smittad. Att vara isolerad innebär begränsad rörelsefrihet och att vara i stort behov av vårdpersonalen vilket kan upplevas som psykiskt påfrestande. Syftet med studien var att beskriva patienters upplevelser av isoleringsvård inom den somatiska slutenvården. Metoden som användes var en litteraturstudie där sju kvalitativa och en kvantitativ artikel användes. I resultatet identifierades fem teman: att vara ensam, förståelsen av att vara isolerad, behovet av information och undervisning, ett rum med utsikt och att känna sig förorenad. I studien framkom att patienterna ofta upplever känslor som ensamhet, ångest, depression och skam i samband med att vara isolerade. Information och undervisning är av stor betydelse för att öka förståelsen till varför isoleringen är nödvändig. Ett rum med utsikt över natur leder till ökat välbefinnande och att ha tillgång till en telefon och tv på rummet var viktigt för att hålla sig uppdaterad med världen utanför. Många upplevde att få ett eget rum som positivt men det bar även med sig en stor ensamhet. En god relation till vårdpersonalen, ständiga besök från närstående och rikligt med information kring isoleringens betydelse var viktiga aspekter som resulterade i en god upplevelse av vårdtiden.

In der vorliegenden Arbeit wurden die Behandlungsabläufe von Patienten mit chronischer Hepatitis C unter Therapie mit Standard-Interferon (Kollektiv 1) bzw. mit pegyliertem Interferon (Kollektiv 2) ausgewertet. Die meisten Patienten erhielten eine Kombinationstherapie mit Ribavirin. Es bestand Strukturgleichheit für die Kollektive hinsichtlich Alter, Geschlecht, BMI vor Therapie, Übertragungsweg der Hepatitis, Hepatitis B-Infektion, HAI-Grading-Score und HAI-Staging-Score. Ein signifikanter Unterschied bestand für das Merkmal HIV-Koinfektion. Nach Therapiebeginn zeigte sich ein schnell einsetzendes serologisches und virologisches Ansprechen. Patienten unter Therapie mit pegyliertem Interferon und Ribavirin hatten die besten Chancen auf ein anhaltendes Therapieansprechen. Eine early virological Response war ein guter Prädiktor für das Erreichen einer sustained virological Response. Die meisten Patienten berichteten über Nebenwirkungen unter Therapie. Die häufigsten Nebenwirkungen waren Müdigkeit und Schmerzen, v.a. in Form von Kopfschmerzen. Diese kamen jeweils bei ca. 70% der Patienten vor. Eine Anämie trat bei ca. 9% der Patienten auf. Hämatokrit, Hämoglobin und Erythrozyten sanken im Kollektiv 2 stärker ab als im Kollektiv 1. Unter Kombinationstherapie mit Ribavirin sank das Hämoglobin zudem mehr ab als unter Interferon- Monotherapie, was auf den hämolytischen Effekt des Ribavirins zurückzuführen ist. Thrombozyten fielen unter Kombinationstherapie im Kollektiv 1 deutlich geringer ab als im Kollektiv 2, was durch einen stärkeren myelosuppressiven Effekt des pegylierten Interferons bedingt sein könnte. Im Kollektiv 1 sanken die Thrombozyten unter Monotherapie stärker ab als unter Kombinationstherapie. Leukopenien traten häufiger unter Therapie mit pegyliertem Interferon auf. Insgesamt zeigte sich im hier analysierten Kollektiv ein geringes Risiko für eine Neutropenie oder Lymphopenie. Vor allem ältere Patienten mit niedrigen neutrophilen Granulozyten bzw. Lymphozyten vor Therapie schienen ein erhöhtes Risiko für eine Neutropenie bzw. Lymphopenie zu haben. Das Therapieansprechen und die Therapiedauer waren für Patienten mit bzw. ohne Leukopenie, Neutropenie oder Lymphopenie ähnlich. Für Infektionen fand sich ebenfalls kein signifikant erhöhtes Risiko bei Patienten mit Leukopenie, Neutropenie oder Lymphopenie. 16% der Patienten im Gesamtkollektiv hatten eine Infektion unter Therapie. Es zeigte sich kein Unterschied zwischen Kollektiv 1 und 2 für Infektionen unter Therapie. Patienten mit bzw. ohne Infektion wurden hinsichtlich der Merkmale Alter, Geschlecht, BMI, Hepatitis B-Infektion, Hepatitis G/GB-Infektion und HIV-Infektion verglichen. Zudem wurden die prätherapeutischen Laborwerte Ferritin, Viruslast, Eisen, TSH, GPT, GOT, Hämoglobin, Hämatokrit, Leukozyten, neutrophile Granulozyten, Lymphozyten, Thrombozyten und Erythrozyten gegenübergestellt und Therapiedauer und Therapieansprechen für Patienten mit bzw. ohne Infektion erhoben. Für keines dieser Kriterien lag ein signifikanter Unterschied zwischen Patienten mit Infektion und Patienten ohne Infektion vor. Die meisten Infektionen waren unkomplizierte, respiratorische Infektionen. Diese traten für Patienten mit Neutropenie und Patienten ohne Neutropenie gleich häufig auf. HIV-Patienten hatten ein höheres Infektionsrisiko. Jedoch war der Unterschied nicht signifikant. Beim Vergleich des prozentualen Absinkens der Lymphozyten vom Ausgangswert zeigte sich ein schwach signifikanter Unterschied zwischen den Werten zu Infektionszeitpunkten und den Werte für Patienten ohne Infektion. Für die absoluten Werte war der Unterschied nicht signifikant. Für neutrophile Granulozyten und Leukozyten fanden sich keine Unterschiede zwischen den Werten für Infekt-Patienten zum Infektionszeitpunkt, den Werten zu infektfreien Zeitpunkten und den Werten für Patienten ohne Infektion. Insgesamt fand sich im hier untersuchten Kollektiv keine Assoziation von Infektionen unter Interferontherapie mit Leukopenien oder Neutropenien. Ein Absinken der neutrophilen Granulozyten scheint daher in größerem Maße ohne Dosisreduktion tolerierbar zu sein als bisher empfohlen. Ein relativer Lymphozytenmangel könnte mit dem Auftreten von Infektionen assoziiert sein. Für den absoluten Lymphozytenmangel fand sich diese Assoziation jedoch nicht. / In the present study, the treatment procedures for patients with chronic hepatitis C during therapy with standard interferon (group 1) or with pegylated interferon (group 2) were evaluated. Most patients received combination therapy with ribavirin. It was par for the collective structure in terms of age, gender, BMI before therapy, transmission of hepatitis, hepatitis B infection, HAI grading and staging score. A significant difference was found for the characteristic HIV co-infection. After starting therapy a rapid onset of serological and virological responses was seen. Patients treated with pegylated interferon and ribavirin had the best chances of sustained response to therapy. An early virological response was a good predictor of sustained virological response. Most patients reported side effects during treatment. The most common side effects were fatigue and pain (both for about 70% of patients), especially in the form of headache. Anaemia occurred in approximately 9 % of patients. The decreases of hematocrit, hemoglobin and erythrocytes was stronger in group 2 than in the first group Under combination therapy with ribavirin hemoglobin decreased also stronger than under interferon monotherapy, which is due to the haemolytic effect of ribavirin. On combination therapy in group 1 platelets were significantly lower than in group 2, which could be due to a greater myelosuppressive effect of pegylated interferon. In group 1, the platelets decreased stronger under monotherapy compared with combination therapy. Leukopenia occurred more frequently during treatment with pegylated interferon. Overall, the analyzed risk of neutropenia and lymphopenia in this collective was small. Especially elderly patients with low neutrophil granulocytes or lymphocytes before starting therapy seemed to have an increased risk for neutropenia and lymphopenia. The treatment response and duration of therapy were similar for patients with or without leukopenia, neutropenia and lymphopenia. There was also no significant increased risk for infections in patients with leucopenia, neutropenia and lymphopenia. 16 % of patients in the total group had an infection during treatment. There was no difference between the collective 1 and 2 for infections during treatment. Patients with and without infection were compared for age, gender, BMI, hepatitis B infection, hepatitis G / GB-infected and HIV-infection. In addition, the pretherapeutic laboratory values ferritin, viral load, iron, TSH, ALT, AST, hemoglobin, hematocrit, leukocytes, neutrophils, lymphocytes, platelets and red blood cells, treatment duration and response rate were compared for patients with and without infection. For none of these criteria a significant difference between patients with infection and patients without infection was found. Most infections were uncomplicated respiratory infections. These occurred equally in patients with neutropenia and patients without neutropenia. HIV patients had a higher risk of infection. However, the difference was not significant. Comparing the percentage drop in the lymphocytes from baseline a weak significant difference was shown between the values at infection times and the avarage values for patients without infection. For the absolute values the difference was not significant. For neutrophils and leukocytes, there were no differences between the values for patients at times of infection, the values at infection-free times and the values for patients without infections. In total no association of infection with interferon therapy with leukopenia or neutropenia was found. A decrease in neutrophils seems therefore to be more tolerable without dose reduction than recommended till now. A relative lack of lymphocytes could be associated with the occurrence of infections. For the absolute lymphocyte deficiency this association was not found.

A CD8+ cell-mediated host defense relies on cognate killing of infected target cells and on local inflammation induced by the secretion of IFN-g. Using assays of single cell resolution, it was studied to what extent these two effector function of CD8+ cells are linked. Granzyme B (GzB) is stored in cytolytic granules of CD8+ cells and its secretion is induced by antigen recognition of these cells. Following entry into the cytosol GzB induces apoptosis in the target cells. It was measured whether GzB release by individual CD8+ cells is accompanied by the secretion of IFN-gƒnƒnand of other cytokines. HIV peptide libraries were tested on bulk peripheral blood mononuclear cells and on purified CD4+ and CD8+ cells obtained from HIV infected individuals. The library included a panel of previously defined HLA class I restricted HIV peptides and an overlapping 20-mer peptide-series that covered the entire gp120 molecule. To characterize the in vivo differentiation state of the T-cells, freshly isolated lymphocytes were tested in assays of 24h duration. The data showed that only ~20% of the peptides triggered the release of both GzB and IFN-g from CD8+ cells. The majority of the HIV peptides induced either GzB or IFN-g, ~40% in each category. The GzB positive, IFN-g negative CD8+ cells did not produce IL-4 or IL-5, which suggests that they do not correspond to Tc2 cells but represent a novel Tc1 subclass, which was termed Tc1c. Also the IFN-g positive, GzB negative CD8+ cell subpopulation represents a yet undefined CD8+ effector cell lineage that was termed Tc1b. Tc1b and Tc1c cells are likely to make different, possibly antagonistic contributions to the control of HIV infection. Since IFN-g activates HIV replication in latently infected macrophages, the secretion of this cytokine by Tc1b cells in the absence of killing may have adverse effects on the host defense. In contrast, cytolysis by Tc1c cells in the absence of IFN-g production might represent the protective class of response. Further studies in the field of Tc1 effector cell diversity should lead to valuable insights for management of infections and developing rationales for vaccine design. / Im Verlauf von Infektionskrankheiten basiert die Verteidigung durch CD8+-Zellen auf der direkten Tötung von infizierten Zellen über die Perforin/Granzyme-Kaskade und auf der Entzündungsbildung verursacht durch die Sekretion von Interferon-Gamma (IFN-g). In der vorliegenden Arbeit wurde die Granzyme B (GzB) Sezernierung als direkter Nachweis für das Abtöten von Zellen und parallel die Produktion von IFN-g durch HIV peptid-spezifische T-Zellen in chronisch HIV-infizierten Patienten gemessen. Eine Auswahl von in vorhergehenden Arbeiten definierten HLA-Klasse-I spezifischen HIV-Peptiden und eine HIV-Peptide-Bibiliotek, bestehend aus sich überlappenden 20-mer Peptiden, die das gesamte Gp120 Molekül von HIV-1 darstellten, wurden benutzt, um T-Lymphozyten aus frisch von HIV-infizierten Patienten gewonnenen mononukleären Zellen aufgereinigte CD8+-Zellen zu stimulieren. ELISPOT-Assays wurden benutzt, um die Sekretion von GzB und IFN-g mit einer Auflösung auf der Ebene der Einzelzelle zu messen. Nur ~20% der Peptide lösten die Freisetzung von sowohl GzB als auch IFN-g von CD8+ Zellen aus. Die Mehrheit der Peptide induzierte entweder GzB oder IFN-g, je ~40% in der jeweiligen Kategorie. Granzyme B-positive Zellen produzierten in parallel gemessen kein IL-4 oder IL-5. Da sie aus diesem Grunde keine Tc2 Zellen darstellen, wurden sie als neue Untergruppe Tc1c definiert. Diese GzB+/IFN-g- CD8+ Zellen vermutlich eine durch Apoptose induziertes Absterben von infizierten Zellen auslösen, ohne gleichzeitig eine Entzündungsreaktion zu verursachen. Die GzB-/IFN-g+ CD8+-Zellen stellen ebenfalls eine neue bisher unbeschriebene Zelluntergruppe dar und wurden als Tc1b Zellen bezeichnet. Diese könnten Entzündungsreaktion verursachen, ohne gleichzeitig direkt das Abstreben von Zellen zu induzieren und im Verlauf der HIV Infektion eine antagonistische Rolle zu den Tc1c Zellen einnehmen. Diese Tc1-CD8+ Effektorzell-diversität könnte die Implementierung und Feineinstellung von fundamental verschieden Verteidigungsstrategien gegen HIV und andere Infektionskrankheiten ermöglichen. Die hier vorgelegten Studien liefern eindeutige Indizien dafür, dass es in HIV-Infizierten eine signifikante Population von GzB sezernierenden CD8+-Zellen gibt, die weder IFN-g noch IL-4 oder IL-5 produzieren und daher in der Lage sind, mit Hilfe der Perforin/Granzyme-Kaskade zu töten, ohne dabei klassische Tc1 oder Tc2-Zellen darzustellen. Die höhere Sensitivität des GzB ELISPOT-Assays Zytotoxizität im Vergleich zum Chromium-Release-Assay zu messen, bietet eine hilfreiche Methode zum besseren Verständnis CD8+-Zell vermittelter Immunität. Die Ergebnisse führen zu der Schlussfolgerung, dass es im Menschen die von uns erstmals beschriebenen GzB+/IFN-g- und GzB-/IFN-g+ Untergruppen von CD8+-Zellen gibt. Aufgrund der verschiedenen Effektorfunktionen die diese vermutlich ausüben, erscheint es wichtig ihre jeweiligen Anteile im Kampf gegen HIV und andere Infektionskrankheiten zu ermitteln. Bei der Beurteilung von Immunantworten, ausgelöst durch experimentelle HIV-Impfstoffe, dürfte es sich als ausgesprochen wichtig erweisen, diese GzB produzierenden CD8+-Zellen neben den konventionell gemessenen IFN-g sezernierden CD8+-Zellen zu berücksichtigen. Diese Vorgehensweise sollte wertvolle Einblicke gewähren, in wie weit der jeweilige Phänotyp von Effektorzellen den höheren oder effektiveren Schutz gewährt und daher wertvolle Hilfe beim Management von Infektionen und im Bereich des Impfstoffdesign liefern.

Der Gram-positive Erreger Staphylococcus aureus ist ein Bestandteil der normalen Haut und Schleimhautflora des Menschen, kann aber auch ein weites Spektrum von Krankheitsbildern hervorrufen. Ein besonderes Charakteristikum dieses Pathogens besteht in der Expression von Oberflächenstrukturen, welche eine hohe Affinität für Proteine der extrazellulären Matrix (ECM) von eukaryontischen Organismen aufweisen und die kollektiv als MSCRAMM (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) bezeichnet werden. Das auf der Bakterienoberfläche gebundene Fn kann in der Folge als eine Art molekulare Brücke zwischen FnBP exprimierenden S. aureus und dem Fn-Rezeptor auf der Wirtszellseite, dem Integrin 51, dienen. Neben der Anheftung an das Wirtsgewebe kann die indirekte Assoziation mit Integrin 51 die Aufnahme der Bakterien durch die eukaryontische Zelle auslösen. Wie die bakterielle Adhäsion an Integrin 51 und die Aggregation der Integrine durch die mit Fn-beschichteten Bakterien in ein Signal zur Aufnahme der Pathogene durch die Zelle umgesetzt wird, ist nicht vollständig geklärt und sollte im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden. Zu diesem Zweck wurde ein neues und effektives Protokoll zur fluoreszenzmikroskopischen Differenzierung von extra- und intrazellulären Bakterien entwickelt. Diese Methode besitzt den Vorteil, von Bakterien-spezifischen Antikörpern unabhängig zu sein. Dadurch bietet sich die Möglichkeit, Bakterien, gegen die es noch keine spezifischen Antiseren gibt, dennoch auf ihre zelluläre Lokalisation und Invasivität mittels mikrobiologischer Methoden untersuchen zu können. Im Hinblick auf die nähere Untersuchung der Signaltransduktion bei der Invasion von S. aureus war die kritische Rolle von Tyrosinkinasen für die Integrin-vermittelte Invasion ein erster wichtiger Hinweis. Diese Befunde führten zu weiteren spezifischeren Untersuchungen, wobei eine wichtige Rolle für Kinasen der Src Familie gezeigt werden konnte. Ein weiterer Hinweis auf die Bedeutung der Src-Kinasen für die Internalisierung von S. aureus war ein dramatischer Rückgang der Aufnahmerate in Src/Yes/Fyn-defizienten Maus-Fibroblasten, verglichen mit Src-rekonstituierten Zellen. Auf biochemischer Ebene konnte eine deutliche Aktivierung der Src-Kinase nach einer Infektion mit S. aureus, nicht aber nach Infektion mit dem nicht-pathogenen S. carnosus festgestellt werden. Integrin-reiche fokale Kontakte (FK) sind angereichert mit Proteinen wie Talin, Vinculin, Paxillin, Tensin, -Actinin oder Zyxin sowie Signalenzymen wie der Fokalen Adhäsions Kinase (FAK) oder Kinasen der Src Familie. Die Protein Tyrosin Kinase (PTK) FAK ist nach Integrinstimulierung eines der Schlüsselenzyme in FK. Dies war der Anlass nach der Bedeutung von FAK für die Integrin-vermittelte Internalisierung von S. aureus zu fragen. Ebenfalls ein wichtiger Hinweis waren die starken Rekrutierungen von Markerproteinen von fokalen Komplexen zum Ort von zellgebunden S. aureus nicht aber von S. carnosus. Daraufhin wurde mittels dominant-negativer FAK-Mutanten und FAKdefizienter Mausfibroblasten der Einfluss von FAK für die Internalisierung von S. aureus untersucht. Bei beiden Versuchsansätzen konnte ein starker Rückgang der Aufnahme beobachtet werden. Zusammengefasst bestätigten diese Ergebnisse die essentielle Rolle von FAK für die Integrin vermittelte Aufnahme der pathogenen S. aureus. Bei der Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts spielen eine Reihe von Proteinen eine wichtige Rolle, darunter auch Cortactin. Cortactin ist ein bekanntes Substrat der Src-Kinasen und es lag nahe, nach einer funktionellen Verbindung von Src, FAK und Cortactin zu suchen. Dominant-negative Cortactin-Mutanten, die keine Assoziation mit dem Arp2/3 Komplex oder mit Dynamin aufweisen, oder welche die von Src-vermittelte Phosphorylierung am C-Terminus verhindern, blockierten die Aufnahme von S. aureus. Mikroskopisch konnte eine starke Rekrutierung von Cortactin zu zellgebundenen S. aureus beobachtet werden, jedoch wurde die Rekrutierung nicht von FAK beeinflusst. Die Phosphorylierung von Cortactin aufgrund S. aureus-Infektion war allerdings FAK- und Src-abhängig. Diese Ergebnisse legen nahe, dass ine bisher unbeschriebene FAK/Src Cortactin Signalachse für die Regulation der Integrin-Internalisierung verantwortlich ist. Die detaillierten Untersuchungen der rezeptorvermittelten Aufnahme und der dabei induzierten Signaltransduktion in Wirtszellen gaben neue Erkenntnisse über die Pathogenitätsstrategien von S. aureus. Darüber hinaus ermöglichen diese Arbeiten neue Einblicke in die molekularen Vorgänge, welche die Internalisierung von Integrinen steuern. / The gram-positive bacterium S. aureus is part of the normal skin and mucosal flora of humans, but it can also give rise to a wide spectrum of infectious diseases. Virulence-associated features of this pathogen include surface structures that interact with extracellular matrix (ECM) proteins of eukaryotic organisms. These adhesins have been collectively termed MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules). Fibronectin (Fn) binding to bacterial FnBPs functions as a molecular bridge linking the pathogen to the principal cellular Fn receptor, the integrin 51. In addition to allowing adherence of the bacteria to the host cell surface, the clustering of integrins also leads to the internalization of the microorganisms. How the integrin engagement by the fibronectin-coated bacteria is transduced into the cell and how this signal initiates bacterial engulfment is poorly characterized. Therefore, the major aim of this work was to identify host components that regulate integrin-dependent internalization of pathogenic S. aureus. As a first step, a novel and elegant microscopic method for the evaluation of bacterial invasiveness into eukaryotic cells was developed. The protocol is based on differential fluorescent staining of extracellular and intracellular bacteria and allows quantification of bacterial invasiveness using a fluorescence microscope. The most important advance of this method is the fact, that the bacteria are covalently labeled and therefore, robust and invariant staining of the total bacterial population is achieved. In addition, the protocol does not rely on bacteria-specific antibodies making this the method of choice in case specific antisera against the pathogen are not available. Functional analysis of signaling pathways involved in the uptake process revealed an important role for protein tyrosine kinases (PTKs) during integrin-mediated internalisation of S. aureus. The important function of Src PTKs was further corroborated by the dramatic decrease of S. aureus uptake by Src/Yes/Fyn-deficient cells compared to Src-expressing cells. Biochemically, a significant activation of Src PTKs was observed in human epithelial cells in response to infection with S. aureus, whereas there was no activation after an infection with the non-pathogenic S. carnosus. Integrin-initiated focal contacts (FC) are enriched in specific marker proteins such as vinculin, paxillin, tensin, actinin, or zyxin as well as signaling enzymes including the focal adhesion kinase (FAK) or Src PTKs. In contrast to S. carnosus, contact of S. aureus with the eukaryotic host cell membrane resulted in strong recruitment of FC marker proteins to the site of adherent bacteria. To investigate the role of FAK for the internalization of S. aureus, dominantnegative FAK-mutants and FAK-deficient mouse cells were infected with the pathogen. In all cases, a major reduction in the number of internalized S. aureus was observed. Taken together these results demonstrated an essential role of FAK for the integrin-mediated uptake of S. aureus and suggested that an active FAK/Src complex regulates bacterial internalization via integrins. In a further approach, effectors of the FAK/Src complex and potential regulators of actin cytoskeleton dynamics during internalization of S. aureus were investigated. Biochemical analysis of infected cells revealed the actin-binding protein cortactin as a major tyrosine phosphorylated protein in response to pathogenic staphylococci. Furthermore, cortactin was recruited to the vicinity of cell-bound S. aureus, but not to S. carnosus. Various dominant-negative cortactin mutants that were either compromised in their association with the Arp2/3 complex or dynamin-2, or that lacked critical tyrosine phosphorylation sites in the C-terminal domain interfered with the uptake of S. aureus. As both FAK and cortactin are substrates of active Src kinases and both are responsive to integrin stimulation, it was hypothesized that there is a functional link between FAK, Src, and cortactin. Though the recruitment of cortacin to the vicinity of cell-bound S. aureus was not influenced by the presence of FAK, the phosphorylation status of cortactin after infection with S. aureus or after integrin stimulation by a fibronectin matrix was dependent on both FAK and Src. Together, these results reveal a novel FAK/Src-cortactin signalling axis regulating integrin internalisation. The detailed examination of the FnBP-triggered, integrin-mediated bacterial uptake offers new insight into the pathogenicity strategies of S. aureus and might open up novel avenues for therapeutic intervention. In addition, this work furthers our understanding of the molecular processes regulating the internalisation of integrins.

Das fakultativ intrazelluläre Bakterium Listeria monocytogenes besitzt die Fähigkeit, eukaryotische Wirtszellen zu penetrieren, sich in diesen zu vermehren, fortzubewegen und zwischen den Zellen auszubreiten. Im Zuge des intrazellulären Lebenszyklus gehen Listerien Wechselwirkungen mit ver-schiedenen zellulären Proteinen ein. Als eines dieser Proteine konnte das zelluläre Phosphoprotein Stathmin identifiziert werden. Dieses Protein bindet an Untereinheiten des Tubulins und destabilisiert dadurch Mikrotubuli (MT). Es wird durch Phosphorylierung von vier spezifischen Serinresten in seiner MT-destabilisierenden Aktivität reguliert. Da Stathmin als Antwort auf externe Signale zelluläre Funktionen, z. B. Zell-Proliferation und Differenzierung reguliert, vermutet man seine Funktion in einer Art Relais welches verschiedene Signale aus dem Umfeld der Zelle integriert. In mit L. monocytogenes infizierten Wirtszellen wird Stathmin an die Oberfläche intrazellulärer Bakterien rekrutiert. Inwiefern diese Rekrutierung das Phosphorylierungsmuster von Stathmin und damit dessen Aktivität beeinflusst, konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht geklärt werden. Stathmin knock-out Mäuse sollten sich gut eignen, um die Rolle von Stathmin während einer Infektion mit L. monocytogenes EGD in vitro und in vivo zu untersuchen. Es stellte sich heraus, dass in Stathmin(-/-)-Makrophagen der intrazelluläre Lebenszyklus der Listerien nicht signifikant beeinflusst ist. Nach intravenöser Verabreichung von 5x103 L. monocytogenes waren drei Tage nach der Infektion in Leber und Milz der knock-out Mäuse allerdings signifikant mehr Listerien nachzuweisen, als in den Organen wildtypischer Mäuse. Mittels Immunfluoreszenzmikroskopie und einem anti-Stathmin-Antiersum konnte an mit verschiedenen L. monocytogenes-Mutanten infizierten Zellen gezeigt werden, dass Stathmin mit der Oberfläche intrazellulärer Listerien kolokalisiert. Allerdings konnten dabei die Angaben in der Literatur nicht bestätigt werden, wonach für diese Kolokalisation die Expression von ActA notwendig ist. Die Ergebnisse dieser Arbeit sprechen im Gegensatz zu den publizierten Daten dafür, dass Stathmin über einen bisher noch unbekannten Mechanismus ActA-unabhängig an intrazelluläre Listerien rekrutiert wird. Zweikomponentensysteme ermöglichen Bakterien eine rasche Anpassung an sich verändernde Umweltbedingungen, da sie extra- und intrazelluläre Stimuli in zelluläre Signale umwandeln. Um die 16 in der Genomsequenz von L. mono-cytogenes EGDe identifizierten Zweikomponentensysteme charakterisieren zu können, wurden individuelle Mutanten konstruiert, in denen individuelle Response Regulatorgene deletiert sind. Die erhaltenen Mutanten wurden in vitro und in vivo auf ihr Wachstumsverhalten hin untersucht. Es zeigte sich, dass unter den angewandten Kultur- und Versuchsbedingungen keines der Zweikomponentensysteme eine signifikante Rolle bei der Anpassung an Temperatur, sowie an oxidativen oder osmotischen Stress spielt. Die Zugabe von 5 % Ethanol hatte einen stark hemmenden Effekt auf das Wachstum von 4 Mutanten, wohingegen zwei andere Mutanten in Gegenwart des Alkohols deutlich besser wuchsen. Unter anaeroben Bedingungen konnte kein Unterschied im Wachstum beobachtet werden. Die Expression wichtiger Virulenzgene war in keiner der untersuchten Mutanten im Vergleich zum Ausgangsstamm verändert. Die intrazelluläre Replikation sowie intrazelluläre Bewegung und Ausbreitung im Zellrasen waren durch die Deletion der Response Regulatorgene nicht beeinträchtigt. Abgesehen von geringen Unterschieden in der Invasivität einiger Deletionsmutanten für Cos-1 und Caco-2 Zellen zeigte sich keiner der Response Regulatoren für den intrazellulären Lebenszyklus von L. monocytogenes erforderlich. Es zeigte sich, dass der in der vorliegenden Arbeit verwendete L. monocyto-genes-Wildstamm auch bei der für die Flagellenexpression normalerweise nicht-permissiven Temperatur von 37° C noch beweglich ist. Die L. monocytogenes ΔdegU-Mutante war dagegen auf Weichagar temperaturunabhängig unbeweglich. Die elektronenmikroskopische Analyse ergab, dass dieser Stamm im Gegensatz zum Wildtyp auch bei 24° C keine Flagellen ausbildet. Durch vergleichende Proteomanalysen konnte gezeigt werden, dass L. monocytogenes ΔdegU bei 24° C wesentliche Proteine des Flagellenapparates nicht synthetisiert. Mittels Transkriptomanalysen konnten die Ergebnisse der Proteomanalysen bestätigt werden. Es wurden neben Genen, die für Proteine der Flagellenbiosynthese und Chemotaxis codieren, noch weitere Gene identifiziert, die offensichtlich unter der transkriptionellen Kontrolle des Response Regulators DegU stehen. Die Ergebnisse der in vivo Studien zeigten, dass L. monocytogenes ΔdegU deutlich virulenzattenuiert ist. Für die restlichen L. monocytogenes ΔTCS-Mutanten waren im Vergleich zum Wildtyp die Unterschiede in Leber und Milz nur leicht verändert und statistisch nicht signifikant. / The facultative intracellular pathogen Listeria monocytogenes is able to penetrate eukaryotic host cells, to multiply and move intracellularly and to spread between the cells. In the course of the intracellular lifecycle the listeriae interact with different cellular proteins. The cellular phosphoprotein stathmin was identified as one of these proteins. This protein binds to the tubulin subunits thereby destabilizing microtubules. It is regulated in its microtubule-destabilizing activity via phosphorylation of four specific serine residues. Since stathmin regulates cellular functions, i. e. cell proliferation and differentiation, its function is presumed in acting as a type of relay integrating different signals of the cell´s environment. In L. monocytogenes infected host cells stathmin is recruited to the bacterial cell surface. Whether and to which extent this recruitment influences the phosphorylation pattern of stathmin and thereby its activity, could not be identified during this work. Stathmin knock-out mice should be valuable for experimentally testing the influence of stathmin in an infection with L. monocytogenes in vitro and in vivo. It appeared that the listerial intracellular lifecycle is not significantly influenced in stathmin(-/-) macrophages. However, three days after intravenous application of 5x103 L. monocytogenes EGD the bacterial load in liver and spleen of stathmin knock-out mice was significantly higher than in organs of wildtype mice. By means of immunfluorescence microscopy with an anti-stathmin antiserum it could be revealed that within infected cells stathmin colocalizes with the listerial cell surface. Data from the literature, however, suggesting that this recruitment of stathmin is dependent upon the expression of ActA, could not be confirmed implicating stathmin to be recruited in an up to now unknown ActA-independent manner. Two-component systems enable bacteria to efficiently adapt to changes in the environment by converting extra- and intracellular signals into cellular responses. In order to characterize the 16 identified two-component systems of L. monocytogenes EGDe in detail individual mutants with deletions in each one of the response regulator genes were constructed. The growth characteristics of the mutants were examined in in vitro and in vivo experiments. It appeared that under the culture and test conditions applied, neither one of the TCS plays a role for adapting to temperature, as well as oxidative or osmotic stress. The addition of 5 % ethanol severely impaired growth of 4 of the mutants, whereas growth of two other mutatns was enhanced. No difference in growth between wildtype listeriae and the individual mutants was observed when the cells were grown anaerobically. Expression of important virulencefactor genes was not altered in the mutants tested compared to the wildtype strain. Intracellular replication as well as intracellular movement and spreading was not affected by either one of the response regulator gene deletions. Despite a slightly reduced invasiveness of a few deletion mutants for Cos-1 and Caco-2 cells none of the response regulators appeared to be necessary for the intracellular lifecycle of L. monocytogenes. The wildtype strain used throughout this work proved to be motile even at 37° C, a temperature usually non-permissive for flagellin expression. In contrast, the L. monocytogenes ΔdegU mutant displayed a non-motile phenotype on semisolid agar irrespective of the temperature applied. Electron microscopical analysis demonstrated that, unlike the wildtype strain EGD, this deletion mutant did not produce flagella, not even at 24° C. Comparative proteomics revealed that at 24° C L. monocytogenes ΔdegU did not produce the major components of the flagella apparatus. The results of transcriptome analysis were in line with the results of the proteome analysis and, aside of genes for flagella biosynthesis and chemotaxis, identified other genes obviously under transcriptional regulation by DegU. In vivo studies revealed that only L. monocytogenes ΔdegU showed a conspicuous virulence attenuation. There were significantly less bacteria in liver and spleen compared to an infection with the wildtype strain L. monocytogenes EGD. For the other L. monocytogenes ΔTCS-mutants the difference of bacterial counts in liver and spleen compared to the wildtype was slightly altered but not statistically significant.

The obligate intracellular gram-negative bacterium, Chlamydophila pneumoniae (Cpn), has a significant impact as an acute and chronic disease-causing pathogen. Its potential to undergo persistent infections has been linked to chronic diseases. Several in vitro cell culture models are used to study persistent conditions, mainly IFN_ stimulation, treatment with antibiotics and iron depletion. Little is known about changes in the Cpn transcriptome during the acute and persistent infection. Therefore, the Cpn transcriptome during its acute developmental cycle and iron depletion-mediated persistence was examined in this study. Based on expression profiles, genes with similar expression changes formed 12 clusters using the self-organizing map algorithm. While other studies define genes based on their onset of transcription, here the important feature for clustering was the expression profile. This turned out to be more appropriate for comparing the time specific relevance of a certain cluster of genes to their proposed functions in the cycle. The Cpn clusters were grouped into the 'Early', 'Mid' and 'Late' classes as described for Ctr. Additionally, a new gene expression class containing genes with steadily increasing expression at the end of the developmental cycle was defined and termed 'Tardy' class. Comparison of the Cpn clusters to published proteomics data showed that genes encoding elementary body (EB) proteins peaked in the 'Late' gene cluster. This indicated that genes of the ‘Late’ and ‘Tardy’ class have different roles in RB to EB re-differentiation. Moreover, using lexical comparison the EB mRNA profile was significantly linked to the ‘Tardy’ cluster class. This provided evidence that initial translation in the cycle might be directed from stable transcripts present in the infectious EB form. Based on these criteria the novel ‘Tardy’ class was separated from the ‘Late’ class. The gene ontologies were used to identify specific pathways and physiological functions active during the different phases of development. Additionally, the transcriptome of Cpn in the persistent stage was compared to that of the acute developmental cycle. The Cpn transcriptome was altered in the iron-depletion mediated persistence. Genes upregulated were linked to clusters at the beginning of the developmental cycle, and genes down-regulated were linked to clusters at the end of the developmental cycle. These data provided strong evidence that the Cpn transcriptome during persistence is a gene expression arrest in mid-development. In early acute infection convergently or divergently oriented gene pairs preferentially had an antagonistic expression profile, whereas tandemly oriented gene pairs showed a correlated expression profile. This suggests that the Cpn genome is organized mainly in tandemly arranged operons and in convergently or divergently oriented genes with favored antagonistic profiles. The microarray studies done with the Cpn strain CWL029 also showed expression signals for several genes annotated only for the Cpn strains AR39 and J138. BLAST comparison verified that these genes are also coded in the CWL029 genome. Several of these genes were convergently arranged with their neighboring gene and shared overlapping genome information. Among these were parB, involved in DNA segregation and rpsD, an alternative sigma factor responsible for the transcription at late stages of the developmental cycle. Both genes have been described to have major roles in the chlamydial cycle. These genes had an antagonistic expression profile at the beginning of the acute developmental cycle and in persistence, as described before to be predominant for convergently oriented genes. Real time RT-PCR analysis showed that full-length rpsD mRNA transcripts were down-regulated, whereas short-length rpsD mRNA transcripts were up-regulated during the persistent infection. This demonstrated that the rpsD promoter is activated during the persistent infection and that because of the collision of the RNA polymerases full length transcripts were down-regulated. This sigma factor-independent mechanism is known as ‘Transcriptional Interference’. This is the first description on how the alternative sigma factor rpsD might be down-regulated during persistent infections. Finally, the host cell transcriptome was analyzed in the acute and persistent infection mediated by the depletion of iron. Cpn infection triggered the upregulation of relB, involved in an alternative NF-KB signaling pathway. Several genes coding for cell cycle proteins were triggered, including cyclin G2 and cyclin D1 and inhibitors of CDK4. Taken together, this work provides insights into the modulation of the pathogen and the host transcriptome during the acute infection and the iron mediated persistent infection. / Das obligat intrazelluläre, gram-negative Bakterium Chlamydophila pneumoniae (Cpn) wird mit akuten und chronischen Krankheiten in Verbindung gebracht. Besonders sein Potential persistente Infektionen zu durchlaufen ist mit chronischen Krankheiten korreliert worden und deshalb von besonderem Interesse. Verschiedene in vitro Zellkulturmodelle werden verwendet um persistente Infektionen zu untersuchen, darunter IFN_ Stimulation, Antibiotika Behandlung und Eisenmangel. Über die Genregulation von Cpn als auch der Wirtzelle in der akuten und persistenten Infektion ist jedoch wenig bekannt. In dieser Arbeit wurde das Cpn Transkriptom als auch das von epithelialen Wirtszellen in der akuten und in der durch Eisenmangel induzierten Infektion untersucht. Mittels eines Algorithmuses für ‚selbstorganisierende Netzwerke’ (SOM) wurden signifikant regulierte Gene aufgrund ihres Expressionsprofiles in 12 Cluster gegliedert. Diese 12 Cluster wurden wiederum in die Klassen der ‘Frühen’ (engl.: ‘Early’), ‘Mittleren’ (engl.: ‘Mid’) und ‘Späten’ (engl.: ‘Late’) Gene eingeteilt. Diese Unterteilung lehnt sich an schon beschriebenen Genexpressionsstudien für Ctr an. Weiterhin wurde die neue Klasse der ‘Verspäteten’ (engl.: ‘Tardy’) Gene eingeführt. Diese hatten am Ende des Entwicklungszykluses ein kontinuierlich ansteigendes Expressionsprofil. Mit publizierten Proteinen aus chlamydialen Elementarkörperchen (EK) korrelierten vor allem Gene aus den ‘Späte’ jedoch nicht aus den ‘Verspätete’ Klassen. Gene dieser beiden Klassen müssen also eine unterschiedliche Rolle im EK Redifferenzierungsprozess spielen. Weiterhin waren überdurchschnittlich viele mRNA Transkripte aus der Klasse der ‘Verspäteten’ Gene in den EK vorhanden. Dies führte zu der Annahme, daß ein Teil der initiale Proteinexpression von stabilen mRNA-Transkripten aus der infektiösen EK Form erfolgt. Anschließend wurden, Gene, die für spezifische Signalwege und physiologische Funktionen von Cpn kodieren, basierend auf der ‚Gene Ontology’ während des Entwicklungszykluses untersucht. Weiterhin wurde das Transkriptom von Cpn in der Persistenz mit dem Transkriptom der akuten Infektion verglichen. Unter Persistenzbedingungen zeigte Cpn ein verändertes Expressionsprofil. Hochregulierte Gene konnten akuten Clustern am Anfang des akuten Entwicklungszykluses und herunterregulierte Gene Clustern am Ende des akuten Entwicklungszykluses zugeordnet werden konnten. Dies legt nahe, daß es sich bei der Persistenz nicht um ein neues Transkriptionsprofil handelt, sondern eher um eine Arretierung des Transkriptomes in der Mitte des akuten Entwicklungszykluses. Weiterhin zeigten konvergent und divergent orientierte Gene am Anfang des Zyklus bevorzugt ein antagonistisches Expressionsprofil, während in Reihe angeordnete (‘tandem’) Gene ein korreliertes Expressionsprofil aufwiesen. Bei den mit dem Cpn Stamm CWL029 durchgeführten Mikroarrayexperimenten konnten auch Expressionswerte für einige ausschließlich für die Stämme AR39 und J138 beschriebenen Gene gemessen werden. Ein Vergleich mittels BLAST zeigte, daß diese Gene auch im CWL029 Genom kodiert sind. Dazu gehörten mehrere Gene, welche konvergent zu ihren Nachbargenen orientiert waren und eine Sequenzüberlappung mit diesen aufwiesen. Darunter fielen parB, welches eine Rolle für die Trennung der DNA in der Zellteilung spielt, und rpsD, ein alternativer Sigma-Faktor, der für die Transkription in der späten Phase des Entwicklungszyklus verantwortlich ist. Für beide Genpaare konnte in der frühen akuten und in der persistenten Infektion ein antagonistisches Expressionsprofil beobachtet werden, wie es bei konvergent orientierten Genpaaren überwiegt. Mittels quantitativer qRT-PCR wurde für rpsD gezeigt, dass vollständige mRNA-Fragmente in der Persistenz herunterreguliert, während kurze mRNA-Fragmente hochreguliert waren. Als Erklärung für diesen Effekt dient ein Modell, welches auf einer Kollision der RNA Polymerasen basiert. Dieser Sigma-Faktor unabhängige Mechanismus ist in der Literatur als ‘Transkriptionelle Interferenz’ bekannt und führt so trotz einer Promoteraktivierung zu einer verminderten Anzahl an vollständigen mRNA Transkripten. Die Herunterregulation von RpsD auf Proteinebene in der Cpn Persistenz ist beschrieben worden. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde das Wirtszelltranskriptom in der akuten und persistenten Infektion untersucht.Infektion mit Cpn führte zu einer Hochregulation von relB, welches an alternativen NF-KB Signalwegen beteiligt ist und das anti-apoptotische Potential verstärkt. Weiterhin waren Gene differentiell exprimiert, welche für die Zellzyklusproteine Cyclin-G2 und Cyclin-D1 sowie Inhibitoren von CDK4 kodieren. Zusammenfassend gibt diese Arbeit gibt einen Einblick sowohl in das Transkriptom des Pathogens als auch der Wirtszelle während der akuten und durch Eisenmangel ausgelösten persistenten Infektion als auch potentiellen Mechanismen zu Persistenzentstehung auf der Ebene der Genregulation.

Many species are today threatened by extinction. In streams and rivers, the historical clearing of obstacles in favour of transportation of floating timber has led to a decrease in the important habitat complexity. The larvae of freshwater pearl mussel (Margaitifera margaritifera) lives as a parasite on the gills of brown trout (Salmo trutta)wich effects the host negatively. In this study the effects of the activity, the amount of prey captured and the amount of initiated interaction with other trouts in different habitat complexity and different grade of infection from glochidia was investigated. The behaviour of brown trout was studies in the laboratory at Karlstads university in 2015. Analyses from data collected in laboratory studies at Karlstad University showed that there was no significant difference in activity or the amount of food captured between fish in complex and homogeneous habitats with high or low infection. In the case of initiated interactions there was a significantly higher rate of initiated interactions in homogeneous habitats than in complex habitats. The understanding of how the host is affected by parasites and even a changing habitat is important to be able to protect sensitive species with a parasitic lifecycle.

The intracellular pathogen Chlamydia is the causative agent of millions of new infections per year transmitting diseases like trachoma, pelvic inflammatory disease or lymphogranuloma venereum. Undetected or recurrent infections caused by chlamydial persistence are especially likely to provoke severe pathologies. To ensure host cell survival and to facilitate long term infections Chlamydia induces anti-apoptotic pathways, mainly at the level of mitochondria, and restrains activity of pro-apoptotic proteins. Additionally, the pathogen seizes host energy, carbohydrates, amino acids, lipids and nucleotides to facilitate propagation of bacterial progeny and growth of the chlamydial inclusion. At the beginning of this study, Chlamydia-mediated apoptosis resistance to DNA damage induced by the topoisomerase inhibitor etoposide was investigated. In the course of this, a central cellular protein crucial for etoposide-mediated apoptosis, the tumour suppressor p53, was found to be downregulated during Chlamydia infections. Subsequently, different chlamydial strains and serovars were examined and p53 downregulation was ascertained to be a general feature during Chlamydia infections of human cells. Reduction of p53 protein level was established to be mediated by the PI3K-Akt signalling pathway, activation of the E3-ubiquitin ligase HDM2 and final degradation by the proteasome. Additionally, an intriguing discrepancy between infections of human and mouse cells was detected. Both activation of the PI3K-Akt pathway as well as degradation of p53 could not be observed in Chlamydia-infected mouse cells. Recently, production of reactive oxygen species (ROS) and damage to host cell DNA was reported to occur during Chlamydia infection. Thus, degradation of p53 strongly contributes to the anti-apoptotic environment crucial for chlamydial infection. To verify the importance of p53 degradation for chlamydial growth and development, p53 was stabilised and activated by the HDM2-inhibiting drug nutlin-3 and the DNA damage-inducing compound etoposide. Unexpectedly, chlamydial development was severely impaired and inclusion formation was defective. Completion of the chlamydial developmental cycle was prevented resulting in loss of infectivity. Intriguingly, removal of the p53 activating stimulus allowed formation of the bacterial inclusion and recovery of infectivity. A similar observation of growth recovery was made in infected cell lines deficient for p53. As bacterial growth and inclusion formation was strongly delayed in the presence of activated p53, p53-mediated inhibitory regulation of cellular metabolism was suspected to contribute to chlamydial growth defects. To verify this, glycolytic and pentose phosphate pathways were analysed revealing the importance of a functioning PPP for chlamydial growth. In addition, increased expression of glucose-6-phosphate dehydrogenase rescued chlamydial growth inhibition induced by activated p53. The rescuing effect was even more pronounced in p53-deficient cells treated with etoposide or nutlin-3 revealing additional p53-independent aspects of Chlamydia inhibition. Removal of ROS by anti-oxidant compounds was not sufficient to rescue chlamydial infectivity. Apparently, not only the anti-oxidant capacities of the PPP but also provision of precursors for nucleotide synthesis as well as contribution to DNA repair are important for successful chlamydial growth. Modulation of host cell signalling was previously reported for a number of pathogens. As formation of ROS and DNA damage are likely to occur during infections of intracellular bacteria, several strategies to manipulate the host and to inhibit induction of apoptosis were invented. Downregulation of the tumour suppressor p53 is a crucial point during development of Chlamydia, ensuring both host cell survival and metabolic support conducive to chlamydial growth. / Intrazellulär lebende Chlamydien führen jährlich zu Millionen an Neuinfektionen und lösen Krankheiten wie das Trachom, eine Entzündung des Auges, sowie entzündliche Beckenerkrankungen oder Lymphogranuloma venereum, eine venerische Lymphknotenentzündung, aus. Unentdeckte oder wiederkehrende Infektionen, ausgelöst durch chronisch persistierende Chlamydien, führen häufig zu schwerwiegenden Komplikationen. Um das Überleben der Wirtszelle und dauerhafte Infektionen zu ermöglichen, induzieren Chlamydien antiapoptotische Signalwege, hauptsächlich auf Höhe der Mitochondrien, und beeinträchtigen darüber hinaus die Aktivität proapoptotischer Proteine. Energie, Kohlenhydrate, Aminosäuren, Lipide und Nukleotide bezieht der Krankheitserreger vollständig aus der Wirtszelle. Erst dadurch wird sowohl die Vermehrung der Bakterien, als auch das Wachstum der chlamydialen Inklusion ermöglicht. Zu Beginn dieser Arbeit wurde die Chlamydien-vermittelte Resistenz gegenüber induziertem Zelltod nach Schädigung der DNA durch den Topoisomerase-Inhibitor Etoposid untersucht. Im Zuge dessen wurde entdeckt, dass der Tumorsuppressor p53, ein zentrales zelluläres Protein entscheidend für die Etoposid-induzierte Apoptose, während Chlamydien-Infektionen herunterreguliert wird. Nachdem verschiedene chlamydiale Stämme und Serovare untersucht wurden, konnte festgestellt werden, dass es sich bei der Herunterregulierung von p53 um ein allgemeines Merkmal chlamydialer Infektionen von humanen Zellen handelt. Die Reduzierung der Proteinmenge von p53 wird dabei durch den PI3K-Akt Signalweg, Aktivierung der E3-Ubiquitin-Ligase HDM2 und abschließendem Abbau durch das Proteasom vermittelt. Zusätzlich wurde ein interessanter Unterschied zwischen Infektionen humaner und muriner Zellen entdeckt. Sowohl Aktivierung des PI3K-Akt Weges, als auch der Abbau von p53 konnten in Chlamydien-infizierten Mauszellen nicht beobachtet werden. Kürzlich wurde darüber berichtet, dass während chlamydialer Infektionen reaktive Sauerstoffspezies produziert werden und die DNA der Wirtszelle geschädigt wird. Demnach trägt der Abbau von p53 entscheidend dazu bei, ein für chlamydiale Infektionen maßgebliches, anti-apoptotisch geprägtes Umfeld zu generieren. Um die Bedeutung des Abbaus von p53 für Wachstum und Entwicklung von Chlamydien zu ermessen, wurde p53 durch den HDM2-inhibierenden Wirkstoff Nutlin-3, sowie die DNA-Schäden induzierende Verbindung Etoposid stabilisiert bzw. aktiviert. Die Entwicklung der Chlamydien, sowie die Ausbildung der Inklusion wurden dadurch überraschenderweise stark beeinträchtigt bzw. waren fehlerhaft. Die Vollendung des chlamydialen Entwicklungszyklus wurde verhindert, was den Verlust der Infektivität nach sich zog. Interessanterweise erlaubte das Entfernen des p53-aktivierenden Stimulus die Ausbildung der bakteriellen Inklusion und die Wiedererlangung der Infektivität. Eine ähnliche Beobachtung konnte in Zelllinien mit einer p53-Defizienz gemacht werden. Da bakterielles Wachstum und Ausbildung der Inklusion durch aktiviertes p53 stark eingeschränkt war, wurde vermutet, dass p53-vermittelte Inhibierung des zellulären Metabolismus am fehlerhaften Wachstum der Chlamydien beteiligt ist. Analyse von Glykolyse und Pentosephosphatweg (PP-Weg) zeigten den Stellenwert eines funktionierenden PP-Wegs für das Wachstum der Chlamydien auf. Zusätzlich konnte durch Überexpression der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase das durch aktiviertes p53 gehemmte Wachstum der Chlamydien wiederhergestellt werden. Dieser Effekt war noch deutlicher in p53-defizienten Zellen, die mit Etoposid bzw. Nutlin-3 behandelt wurden. Demnach tragen auch p53-unabhängige Aspekte zur Einschränkung des chlamydialen Wachstums bei. Das Entfernen von reaktiven Sauerstoffspezies durch Antioxidationsmittel war jedoch nicht ausreichend zur Wiedererlangung der chlamydialen Infektivität. Demnach sind nicht nur die anti-oxidativen Eigenschaften des PP-Wegs sondern auch das Bereitstellen von Vorläufermolekülen für die Nukleotidsynthese, sowie dessen Beitrag zur DNA-Reparatur entscheidend für erfolgreiches Wachstum von Chlamydien. Veränderung der Signaltransduktion der Wirtszelle wurde bereits bei einigen Krankheitserregern nachgewiesen. Da reaktive Sauerstoffspezies und DNA Schäden häufig bei Infektionen intrazellulärer Bakterien auftreten, entstanden unterschiedliche Strategien, den Wirt zu manipulieren und das Einleiten des Zelltodes zu verhindern. Das Herunterregulieren des Tumorsuppressors p53 ist entscheidend während der Entwicklung von Chlamydien. Sowohl das Überleben der Wirtszelle, als auch die für chlamydiales Wachstum förderliche Unterstützung durch den Stoffwechsel werden dadurch gewährleistet.

Staphylococcus aureus is a facultative Gram-positive human pathogen which can cause different severe infections. Staphylococci are phagocytosed by professional and non-professional phagocytes; they are strongly cytotoxic against eukaryotic cells and have been proposed to play a role in immune evasion by spreading within migrating phagocytes. This study investigated the post invasive events upon S. aureus infection. Strains which are able to escape the phagosome were identified and the responsible toxins were determined. Thereby innovative insights into host pathogen interaction were obtained. A novel class of small amphipathic peptides with strong surfactant-like properties, the phenol soluble modulins, particularly PSMα as well as the leukocidin LukAB, are involved in phagosomal escape of the clinical S. aureus strains LAC, MW2 and 6850 in non-professional and professional phagocytes. Whereas, PSMβ, δ-toxin, α-toxin, β-toxin or phosphatidyl inositol-dependent phospholipase C did not affect phagosomal escape. By blocking the bacterial DNA-dependent RNA polymerase with rifampicin phagosomal escape is determined to start approximately 2.5 hours post infection. Phagosomal escape further was required for intracellular replication of S. aureus. Strains which are not able to escape cannot replicate in the acidic vacuole, whereas, the host cytoplasm offers a rich milieu for bacterial replication. Additionally, phagosomal escape, with intracellular bacterial replication induces the subsequent host cell death. This could be confirmed by an infection assay including S. aureus knockout mutants in psmα or lukAB which were significantly less cytotoxic, compared with those infected with escape-positive wild type strains. Further, this study showed that phagosomal escape is not only mediated by bacterial toxins. Since, the phagocyte-specific cognate receptors for both escape relevant toxins, FPR2 (PSMα receptor) and CD11b (LukAB receptor) are produced in epithelial and endothelial cells only after infection with S. aureus in a calcium dependent fashion. The knockdown of both receptors using siRNA prevents S. aureus to escape the phagosome. Furthermore, blocking intracellular calcium release with the inositol trisphosphate receptor (IP3R) inhibitor 2-APB prohibits upregulation of fpr2 and cd11b and subsequently phagosomal escape of S. aureus. To conclude, the current study clarifies that phagosomal escape and host cell death are interplay of both, bacterial toxins and host cell factors. Staphylococcus aureus ist ein fakultativ Gram-positives Humanpathogen, dass verschiedene schwerwiegende Infektionen verursachen kann. Staphylokokken werden von professionellen und nicht-professionellen Phagozyten (Fresszellen) zu gleich aufgenommen. Desweitern sind sie stark zytotoxisch für eukaryotische Zellen. Außerdem wird vermutet, dass sie sich mittels migrierender Phagozyten dem angeborenen Immunsystem entziehen können. In dieser Studie werden die post-invasiven Ereignisse während einer Staphylokokken Infektion untersucht. Im Detail wurden Stämme identifiziert die aus den Phagosomen entkommen können und die dafür verantwortlichen Toxine. Im Zuge dessen wurden neue Erkenntnisse der Interaktion zwischen Bakterien und Wirtszellen gewonnen. Eine neue Klasse von kleinen amphiphatischen Peptiden mit starken grenzflächenaktiven Eigenschaften (Surfactant), die sogenannten Phenol soluble modulins (PSMs) im Besonderen PSMα sowie das Leukozidin LukAB, sind am phagosomalen Ausbruch der klinisch relevanten S. aureus Stämmen LAC, MW2 und 6850 in nicht professionellen und professionellen Phagozyten involviert. Hingegen, sind PSMβ, δ-toxin, α-toxin, β-toxin oder Phosphatidylinositol abhängige Phospholipase C nicht am phagosomalen Ausbruch beteiligt. Durch die Hemmung der bakteriellen DNA-abhängigen RNA Polymerase mit Rifampicin wurde der Zeitpunkt für den Ausbruch auf etwa 2,5 Stunden nach der Infektion eingegrenzt. Der phagosomale Ausbruch ist weiterhin für die intrazelluläre Replikation von S. aureus notwendig. Während Stämme, die nicht ausbrechen können in der angesäuerten Vakuole nicht replizieren können, bietet das Zytoplasma ein reichhaltiges Milieu für die Vermehrung. Zudem wird der Pathogen induzierte Zelltod erst nach dem phagosomalen Ausbruch und mit anschließender Vermehrung ermöglicht. Nachgewiesen wurde dies mittels psmα und lukAB defizienten Mutanten welche signifikant weniger zytotoxisch waren als der Wildtyp Stamm. Diese Studie zeigt darüber hinaus, dass der phagosomale Ausbruch nicht nur durch bakterielle Toxine vermittelt wird. Sondern, dass die Phagozyten-spezifischen Rezeptoren für beide relevanten Toxine, FPR2 (PSMα Rezeptor) und CD11b (LukAB Rezeptor), in Epithel- und Endothelzellen nach Infektion mit S. aureus calciumabhängig produziert werden und für den Ausbruch notwendig sind. Der knockdown beider Rezeptoren mittels siRNA verhindert den Ausbruch. Wird der intrazelluläre Calciumstrom mittels des Inositoltrisphosphat Rezeptor (IP3R) Inhibitor 2-APB blockiert können die Gene fpr2 und cd11b nicht hochreguliert werden und der Ausbruch wird ebenfalls verhindert. Folglich zeigt diese Studie, dass der phagosomale Ausbruch und Pathogen induzierte Zelltod sowohl durch bakterielle Toxine als auch Wirtsfaktoren vermittelt wird. / Staphylococcus aureus ist ein fakultativ Gram-positives Humanpathogen, dass verschiedene schwerwiegende Infektionen verursachen kann. Staphylokokken werden von professionellen und nicht-professionellen Phagozyten (Fresszellen) zu gleich aufgenommen. Desweitern sind sie stark zytotoxisch für eukaryotische Zellen. Außerdem wird vermutet, dass sie sich mittels migrierender Phagozyten dem angeborenen Immunsystem entziehen können. In dieser Studie werden die post-invasiven Ereignisse während einer Staphylokokken Infektion untersucht. Im Detail wurden Stämme identifiziert die aus den Phagosomen entkommen können und die dafür verantwortlichen Toxine. Im Zuge dessen wurden neue Erkenntnisse der Interaktion zwischen Bakterien und Wirtszellen gewonnen. Eine neue Klasse von kleinen amphiphatischen Peptiden mit starken grenzflächenaktiven Eigenschaften (Surfactant), die sogenannten Phenol soluble modulins (PSMs) im Besonderen PSMα sowie das Leukozidin LukAB, sind am phagosomalen Ausbruch der klinisch relevanten S. aureus Stämmen LAC, MW2 und 6850 in nicht professionellen und professionellen Phagozyten involviert. Hingegen, sind PSMβ, δ-toxin, α-toxin, β-toxin oder Phosphatidylinositol abhängige Phospholipase C nicht am phagosomalen Ausbruch beteiligt. Durch die Hemmung der bakteriellen DNA-abhängigen RNA Polymerase mit Rifampicin wurde der Zeitpunkt für den Ausbruch auf etwa 2,5 Stunden nach der Infektion eingegrenzt. Der phagosomale Ausbruch ist weiterhin für die intrazelluläre Replikation von S. aureus notwendig. Während Stämme, die nicht ausbrechen können in der angesäuerten Vakuole nicht replizieren können, bietet das Zytoplasma ein reichhaltiges Milieu für die Vermehrung. Zudem wird der Pathogen induzierte Zelltod erst nach dem phagosomalen Ausbruch und mit anschließender Vermehrung ermöglicht. Nachgewiesen wurde dies mittels psmα und lukAB defizienten Mutanten welche signifikant weniger zytotoxisch waren als der Wildtyp Stamm. Diese Studie zeigt darüber hinaus, dass der phagosomale Ausbruch nicht nur durch bakterielle Toxine vermittelt wird. Sondern, dass die Phagozyten-spezifischen Rezeptoren für beide relevanten Toxine, FPR2 (PSMα Rezeptor) und CD11b (LukAB Rezeptor), in Epithel- und Endothelzellen nach Infektion mit S. aureus calciumabhängig produziert werden und für den Ausbruch notwendig sind. Der knockdown beider Rezeptoren mittels siRNA verhindert den Ausbruch. Wird der intrazelluläre Calciumstrom mittels des Inositoltrisphosphat Rezeptor (IP3R) Inhibitor 2-APB blockiert können die Gene fpr2 und cd11b nicht hochreguliert werden und der Ausbruch wird ebenfalls verhindert. Folglich zeigt diese Studie, dass der phagosomale Ausbruch und Pathogen induzierte Zelltod sowohl durch bakterielle Toxine als auch Wirtsfaktoren vermittelt wird.

An der Klinik und Poliklinik für Thorax-, Herz-, und Thorakale Gefäßchirurgie der Universität Würzburg wurden im Zeitraum vom Mai 2012 bis Juli 2013, bei 688 konsekutiv behandelten kardiochirurgischen Patienten, klinisch relevante Entzündungsparameter prä- und postoperativ nach dem Studienprotokoll erhoben (Procalcitonin, C-reaktives Protein, Leukozyten, Fibrinogen und Thrombozytenanzahl). Primärer Endpunkt war die Entwicklung einer postoperativen noskomialen Infektion. Diese Studie bestätigt die Kinetik des Procalcitonins und des C-reaktiven Proteins. Ein Anstieg auf das Maximum erfolgt beim PCT bereits 24 Stunden nach dem operativen Eingriff und beim CRP bis zum 3. postoperativen Tag. Die Kinetik des Anstiegs war schneller bei Patienten, die im weiteren Verlauf eine nosokomiale Infektion entwickelten. Als Cut-off Wert für die Diagnose einer Infektion wird am 3. POD ein PCT- Werte ab 1,67ng/ml gewertet. Der 3. postoperative Tag ist der Tag, an dem das Procalcitonin die höchste Sensitivität (61,7%) und Spezifität (60%) erreicht. Die Ergebnisse dieser Studie legen nahe, dass der hohe Stellenwert, den das Procalcitonin heute genießt nicht ungerechtfertigt ist, die Anwendung jedoch nur im Zusammenhang mit einem klinischen Assessment des Patienten sinnvoll ist, zum Beispiel mithilfe des SOFA-Scores. Das Procalcitonin hat in dieser Studie einen Negativ-prädiktiven Wert von 88,8% bei einem Cut-off Wert von 1,62ng/ml. Das Procalcitonin eignet sich zum Ausschluss von Infektionen. / In the Clinic and polyclinik for thoracic, cardiac, and thoracovascular surgery of the University of Würzburg 688 consecutive patients have been analyzed in the time between May 2012 and July 2013. During this period clinically relevant inflammatory parameters have been collected (procalcitonin (PCT), c-reactive protein (CRP), white bloodcellcount (WBC), fibrinogen and platelet count). Primary endpoint was the development of a postoperative nosocomial infection. This study can confirm the kinetics of procalcitonin and c-reactive protein. The highest levels of PCT are reached within 24h after the intervention, whereas the CRP values reach their apex on the third postoperative day (POD). The kinetics of PCT raising where faster in patients the would later on evelop a nosocomial infection. As a cut-off value for diagnosing a nosocomial infection with PCT we suggest a PCT-value of 1,67ng/ml. During the 3. POD this value reachest the highest sensitivity (61,7%) and the highest specificity (60%). The results of this study suggest, that the high value that the Procalcitonin holds today is not unjustified, although the implementation in the day to day use should only occur while combining it with a clinical assessment of the patient, for example using the SOFA-score. PCT had a Negative-predicitve-Value of 88,8% at a cut-off value of 1,62ng/ml. PCT is therefore suitable to exclude infections.