La potentialisation synaptique dans les neurones d'hippocampes repose sur l'activation du récepteur NMDA (NMDAR) et l'influx de Ca²⁺. Des changements dans le Ca²⁺ cytosolique sont détectés par des effecteurs tels que la calpaïne et la protéine kinase II Ca²⁺/calmoduline-dépendante (CaMKII), transformant ces informations en signaux qui induisent une potentialisation synaptique. Une fois activée par l'influx de Ca²⁺, la calpaïne clive de nombreuses protéines cytosoliques, récepteurs et protéines d'échafaudage, remodelant ainsi la structure synaptique, ainsi que l'activité et/ou la dynamique de nombreuses protéines. Le rôle de la calpaïne au cours du processus de plasticité synaptique a été documenté, mais le mécanisme moléculaire est loin d'être clair. Dans cette étude, nous avons examiné le lien possible entre la calpaïne et CaMKII dans la médiation de la potentialisation à long terme (LTP). Nous avons utilisé des inhibiteurs pharmacologiques de la calpaïne pour interférer avec son activation lors de la potentialisation synaptique induite chimiquement dans des cultures dissociées d'hippocampe de rat. Nous avons d'abord confirmé que l'activité de la calpaïne est essentielle pour l'induction de la LTP dans les cultures neuronales dissociées. Nous montrons que l'activité de la calpaïne est essentielle pour de nombreux processus moléculaires importants pour la LTP. L'inhibition de l'activité de la calpaïne a bloqué la phosphorylation de ERK et l'insertion des récepteurs synaptiques AMPA; deux processus régulés par CaMKII impliqués dans la potentialisation synaptique. De plus, nous montrons que la calpaïne est essentielle pour l'autophosphorylation de CaMKII en utilisant un anticorps contre pCaMKII (Thr286). En mesurant le temps de vie par fluorescence (FLIM) avec un capteur basé sur le transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET) (Camui) de l'activation de CaMKII, nous montrons que l'inhibition de la calpaïne empêche le changement dépendant de l'activité de la conformation de l'holoenzyme CaMKII et donc l'activation de la kinase. Nous avons aussi utilisé l'imagerie time-lapse et avons découvert que la translocation CaMKII post-synaptique dépendante de l'activité est diminuée par les inhibiteurs de la calpaïne. De plus, nous avons mesuré les taux de diffusion de CaMKII par SPT-PALM en utilisant CaMKII-meos2 et les résultats indiquent que l'inhibition de la calpaïne empêche la diminution dépendante de l'activité de la mobilité de l'holoenzyme. Nos résultats montrent clairement que les inhibiteurs de la calpaïne affectent la dynamique de CaMKII. Cela suggère que la calpaïne affecte directement CaMKII ou agit en amont de CaMKII. En effectuant des expériences dans des cellules HEK qui n'ont pas de CaMKII endogène, nous avons démontré que la calpaïne n'affecte pas directement CaMKII. Nous avons émis l'hypothèse que la calpaïne joue un rôle dans le processus de plasticité en amont de CaMKII. Nous avons étudié l'influx Ca²⁺ dépendant de l'activité en utilisant l'imagerie GCaMP6 et nos résultats indiquent que l'activité de la calpaïne est essentielle pour cette l'augmentation de Ca²⁺. En disséquant davantage la voie de signalisation, utilisant différents protocoles de stimulation (dépolarisation synaptique ou globale), nous montrons que la calpaïne affecte l'afflux de Ca²⁺ dépendant de NMDA et non l'influx de Ca²⁺ dépendant de la dépolarisation. Ainsi, notre étude montre que la calpaïne joue un rôle essentiel dans la LTP d'une manière dépendante du NMDAR et que l'inhibition de la calpaïne interfère dans les premières étapes de la signalisation médiée par le Ca²⁺ conduisant à l'induction du LTP. En discutant de ces résultats, nous fournissons des résultats préliminaires qui peuvent nous éclairer au niveau de l'impact de l'inhibition pharmacologique de la calpaïne sur la fonction des récepteurs NMDA. / Synaptic potentiation in hippocampal neurons relies on NMDA receptor (NMDAR) activation and Ca²⁺ influx. Changes in cytosolic Ca²⁺ are detected by effectors such as calpain and Ca²⁺/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII), transforming this information into signals inducing synaptic potentiation. Once activated by Ca²⁺ influx, calpain cleaves many cytosolic proteins, receptors, and scaffolding proteins, thereby remodeling the synaptic structure, as well as the activity and/or dynamics of many proteins. The role of calpain during the synaptic plasticity process has been documented, but the molecular mechanism is far from clear. In this study, we examined the possible link between calpain and CaMKII in the mediation of Long Term Potentiation (LTP). We used pharmacological inhibitors of calpain to interfere with its activation during chemically induced synaptic potentiation in rat hippocampal dissociated cultures. We first confirmed that calpain activity is essential for LTP induction in dissociated neuronal cultures. We show that calpain activity is essential for many molecular processes important for LTP. Inhibition of calpain activity blocked ERK phosphorylation and insertion of synaptic AMPA receptors - two CaMKII-regulated processes involved in synaptic potentiation. Further, we show that calpain is essential for CaMKII autophosphorylation by using an antibody against pCaMKII (Thr286). By performing Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based sensor (Camui) of CaMKII activation, we show that calpain inhibition prevents activity-dependent change in the conformation of the CaMKII holoenzyme and thus the activation of the kinase. We further used time-lapse imaging and found that activity-dependent post-synaptic CaMKII translocation is decreased by calpain inhibitors. Furthermore, we measured diffusion rates of CaMKII by SPT-PALM using CaMKII-meos2 and the results indicate that calpain inhibition prevents the activity-dependent decrease in the mobility of the holoenzyme. Our results clearly show that calpain inhibitors affect CaMKII dynamics. This suggests that either calpain affects CaMKII directly or is upstream to CaMKII. By performing experiments in HEK cells that do not have endogenous CaMKII, we demonstrated that calpain does not affect CaMKII directly. We hypothesized that calpain plays a role in the plasticity process at an upstream level to CaMKII. We investigated activity-dependent Ca²⁺ influx using GCaMP6 imaging and our results indicate that calpain activity is essential for this increase in Ca²⁺. Further dissecting the pathway, using different stimulation protocols (synaptic or global depolarisation), we show that calpain affects NMDA-dependent Ca²⁺ influx and not the depolarisation dependent Ca²⁺ influx. Thus, our study shows that calpain plays an essential role in LTP in an NMDAR dependent manner and that inhibiting calpain interferes in the early steps of Ca²⁺- mediated signaling leading to LTP induction. In discussing these results, we provide preliminary results that may shed light on the impact of pharmacological inhibition of calpain on NMDA receptor function.

Les canaux sodiques dépendant du voltage jouent différents rôles dans la transmission des signaux nociceptifs. Ils participent notamment à la genèse et à la transmission de la douleur. De plus, leur modulation serait impliquée dans les douleurs pathologiques. L’objectif général de ma thèse était d’étudier les impacts de la modulation des canaux Na+ afin de comprendre les effets sur l’activité des neurones sensitifs. Cette recherche s’est orientée sur 3 axes principaux. Premièrement, nous avons étudié la synergie entre les canaux Na+ qui mènent aux différents profils électrophysiologiques des neurones. Nous avons observé que les différents canaux Na+ exprimés dans les neurones de petits diamètres des DRG confèrent des propriétés uniques à chacun des neurones. Le remodelage des canaux Na+ qui survient dans différents états pathologiques pourrait être responsable de l’hyperexcitabilité de ces neurones. Deuxièmement, nous avons exploré les effets du butamben sur les canaux sodiques. Cette molécule soulage les douleurs pathologiques liées au cancer durant plusieurs semaines sans effet secondaire. Nous avons observé que cette molécule inhibe efficacement les canaux Na+ exprimés dans les neurones périphériques expliquant partiellement ses effets anesthésiques. De plus, son affinité est plus grande pour les canaux présents au sein des neurones sensitifs périphériques (Nav1.7 et Nav1.8) que pour celui présent dans neurones moteurs (Nav1.6). Cette propriété participerait à la sélectivité du butamben pour l’anesthésie tout en limitant les effets secondaires. Finalement, nous avons étudié les effets sur les canaux Na+ de trois inhibiteurs sélectifs de la recapture de la sérotonine (SSRI) fréquemment utilisés pour traiter différentes douleurs pathologiques (fluoxétine, paroxétine et citalopram). Nous avons observé que les effets analgésiques de la paroxétine et de la fluoxétine pourraient en partie passer par l’inhibition des canaux Na+. C’est par ailleurs improbable pour le citalopram compte tenu de sa haute spécificité pour les transporteurs de la sérotonine. L’étude a permis une meilleure connaissance de l’impact des canaux Na+ sur l’excitabilité des neurones nociceptifs. Ces avancées permettent notamment de mieux appréhender les mécanismes soutenant l’effet anesthésique des molécules telles que les SSRI et le butamben. Finalement, ces connaissances apparaissent cruciales dans le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. / Voltage gated sodium channels (Na+ channel) play different roles in the transmission of nociceptive signals. They are partially responsible of the genesis and the transmission of the nociceptive action potentials. Moreover, their modulation could be involved in pathological pain. The aim of the study was to investigate the impact of the modulation of sodium channels to understand how it affects nociceptive peripheral neurons excitability. This research was conducted in three phase. First, we were interested in the synergy between the different Na+ channels leading to multiple electrophysiological profiles of neurons. We observed that the different Na+ channels expressed by the small dorsal root ganglion (DRG) neurons confer unique properties to these neurons. The remodeling which occurs in various pathological conditions may thus be responsible for the increased excitability of those neurons. Second, we explored the effects of butamben on sodium channels. This molecule relieves cancer pain for several weeks without side effects. We found that the drug effectively inhibits Na + channels expressed in peripheral neurons. This partially explains its anesthetic effects. Moreover, its affinity is greater for the channels present in peripheral sensory neurons (Nav1.7 and Nav1.8) than the one present in motor neurons (Nav1.6). This property contributes to the selectivity of butamben for analgesia and limits its secondary effects. Finally, we studied the effects on Na+ channels of three selective serotonin reuptake inhibitors (SSRI) commonly used in the treatment of various pathological pains (fluoxetine, paroxetine and citalopram). We observed that paroxetine and fluoxetine may partially contribute to the analgesia through the inhibition of Na+ channels. Citalopram is unlikely to provide anesthesia through this mechanism as it is very selective for serotonin transporter. The study provides a better understanding of the impact of Na+ channels on neuronal excitability of nociceptive neurons. These advances contribute to a better understanding of the mechanisms leading to anesthesia by drugs such as SSRIs and butamben. In conclusion, these findings bring fundamental knowledge in the development of new therapeutic strategies.

En insuffisance rénale chronique (IRC), on observe un déséquilibre minéral qui est associé au développement d’un remodelage osseux anormal et de calcification vasculaire, un processus qui est semblable à la formation osseuse car il implique une trans-différenciation de cellules musculaires lisses vasculaires en cellules ostéoblastiques semblables à celles retrouvées dans l’os. Un lien a été rapporté entre le remodelage osseux ralenti et la calcification vasculaire en IRC mais la cause de ce lien demeure mal comprise. Nous avons étudié l’implication des inhibiteurs de la voie Wnt dans ce lien dans un modèle d’IRC chez le rat avec calcification vasculaire induite par un supplément de calcium, phosphore et vitamine D (Ca/P/vitD). Les animaux IRC+Ca/P/vitD présentaient de la calcification vasculaire, un remodelage osseux ralenti, un défaut de minéralisation et des niveaux sériques et vasculaires d’inhibiteurs de la voie Wnt élevés. La présence dans le vaisseau calcifié d’un inhibiteur de la voie Wnt de source ostéocytaire, la sclérostine, suggère que les cellules ostéoblastiques acquièrent un phénotype ostéocytaire. De plus, les inhibiteurs de la voie Wnt produits par le vaisseau pourraient avoir des conséquences sur l’os, ce qui cadrerait avec la formation ralentie et le défaut de minéralisation observés. Les inhibiteurs de la voie Wnt en circulation pourraient aussi avoir des effets vasculaires puisque les vaisseaux calcifiés présentaient des signes d’inhibition de la voie Wnt/β-caténine, les niveaux d’inhibiteurs de la voie Wnt ne semblant toutefois pas associés à un ralentissement de la calcification. Nos résultats mettent donc en lumière une implication potentielle des inhibiteurs de la voie Wnt dans le lien entre l’os et le vaisseau en IRC. / Chronic kidney disease (CKD) patients suffer from a dysregulation of minerals levels which is associated with abnormal bone remodeling and vascular calcification, a process similar to bone formation in that it implies the trans-differentiation of vascular smooth muscle cells into osteoblast-like cells. A link was reported between decreased bone formation and vascular calcification in CKD, but the cause of this link remains unclear. We have studied the involvement of Wnt pathway inhibitors in this process in a rat model of CKD with vascular calcification induced by a calcium, phosphorus and vitamin D supplement (Ca/P/vitD). CKD+Ca/P/vitD rats presented with vascular calcification, decreased bone turnover, defective mineralization and increased levels of circulating and vascular Wnt inhibitors. The expression by the calcified vessel of sclerostin, a Wnt inhibitor typically produced by osteocytes, suggests that vascular osteoblast-like cells could acquire an osteocytic phenotype as osteoblasts do in bone. Moreover, vascular Wnt inhibitors could have consequences on bone and contribute to the decrease in bone formation and the mineralization defect. The high circulating levels of Wnt inhibitors could also have vascular effects, which is supported by the fact that the Wnt/β-catenin pathway appears to be inhibited in the calcified vessels despite the fact that high levels of Wnt inhibitors were not correlated with a decrease in the severity of vascular calcification. Our results therefore suggest an implication of Wnt pathway inhibitors in the bone-vessels link that is frequently observed in CKD.

Titre de l'écran-titre (visionné le 25 juillet 2023) / Selon les projections de l'Alzheimer's Disease International (ADI, 2018), le nombre mondial de cas diagnostiqués de maladie d'Alzheimer (MA) triplera d'ici 2050. Ce trouble est caractérisé par un ensemble de symptômes que l'on peut diviser en trois catégories, soit les symptômes cognitifs, les symptômes fonctionnels et les symptômes psychologiques et comportementaux (SCPD). Les inhibiteurs de la cholinestérase (IAChEs) - donépézil, rivastigmine, et galantamine - sont des agents pharmacologiques qui sont prescrits pour le traitement symptomatologique de la MA. Il est estimé que 80 % des personnes qui sont atteintes de la MA sont prises en charge par un proche. Le rôle de proche aidant (PA) est associé à un ensemble de stresseurs. Le terme fardeau est souvent utilisé pour faire référence à cette charge et à ses conséquences négatives. La sévérité de la symptomatologie de l'aidé a un effet documenté sur le fardeau du PA et les symptômes fonctionnels et les SCPD seraient les catégories de symptômes dont l'effet négatif est le plus important. L'objectif de ce mémoire doctoral est d'évaluer si par leurs effets sur la symptomatologie de l'aidé, les IAChEs ont des répercussions positives sur le fardeau du PA. Pour ce faire, une recension systématique avec résumé narratif a été réalisée. Les résultats obtenus révèlent des changements en faveur du traitement sur au moins une des trois catégories de symptômes de la MA et des changements concomitants en faveur du traitement sur le fardeau dans 8 des 12 études retenues. Toutefois, les effets observés sont petits et plusieurs variables non contrôlées pourraient expliquer les différences observées. Les résultats de cette recension laissent croire que les IAChEs n'ont pas d'effets cliniquement significatifs sur le fardeau du PA. Les IAChEs ne pouvant pas être utilisés comme façon de diminuer le fardeau, la mise en place d'autres interventions s'adressant tant au PA, à l'aidé qu'à la dyade semble être une avenue bien plus prometteuse.

La mauvaise localisation cytoplasmique et l'agrégation de la TDP-43, communément appelée pathologie TDP-43, est une caractéristique de nombreuses maladies neurodégénératives, notamment la SLA (sclérose latérale amyotrophique), la démence frontotemporale (FTD). La TDP-43 est une protéine de liaison ADN / ARN située principalement dans le noyau des cellules et contribue au métabolisme de l'ARN, à la condensation de la chromatine et à la régulation de la traduction. Il a été démontré que l'augmentation de la TDP-43 cytoplasmique dans la SLA / FTD supprime la traduction globale en se liant avec RACK1 sur le polyribosome. Cependant, l'impact de la pathologie du TDP-43 sur le profil de traduction neuronal cérébral in vivo reste inconnu. De nombreux groupes ont généré diverses souris transgéniques exprimant des mutations TDP-43 et ont montré des changements pathologiques rappelant la SLA humaine et la FTD chez ces souris. Auparavant, il a été rapporté que dans les cas de SLA, le TDP-43 se lie à la sous-unité p65 NF-κB et améliore son activité de signalisation dans le système nerveux central (SNC). En outre, un extrait de racine de plante médicinale appelée Withania somnifera et son actif withanolide Withaferin-A (WFA), un puissant inhibiteur de NF-ĸB, a réduit l'inflammation et montré des effets bénéfiques lorsqu'il est administré dans des modèles de souris ALS/FTD. Une étude a montré que le traitement WFA protégeait les neurones dopaminergiques et la fonction motrice chez les rats vieillissants. Il a été rapporté que WFA perturbe la réorganisation du modulateur essentiel NF-ĸB (NEMO) en modifiant de manière covalente la cystéine-397, et par conséquent endommage la signalisation IKKß. Dans la présente étude, nous avons testé le potentiel thérapeutique de deux inhibiteurs de NF-ĸB WFA et un nouvel analogue semi-synthétique de WFA nommé IMS-088 en utilisant des modèles de souris transgéniques pour FTD / ALS exprimant hTDP-43 mutants. En outre, nous avons également cherché à identifier le profil de traduction de l'ARN neuronal sous-jacent aux changements associés à la maladie dans la FTD / SLA. Le traitement de ces inhibiteurs de NF-ĸB à des souris mutantes exprimant hTDP-43 a amélioré les déficits cognitifs, réduit l'activité de NF-ĸB, réduit les agrégats cytoplasmiques de TDP-43 et augmenté les niveaux de marqueurs d'autophagie. En utilisant la spectrométrie de masse de peptides nouvellement synthétisés de ribosomes, nous avons également étudié l'impact du traitement IMS-088 sur le profil de traduction neuronal à l'aide d'un double RiboTag transgénique; souris hTDP-43A315T. Nous avons identifié et rapporté pour la première fois que la protéinopathie TDP-43 provoque une désorganisation neuronale du cytosquelette, y compris la répression traductionnelle des ARNm des neurofilaments. En outre, notre étude a révélé que l'induction de l'autophagie réduit la pathologie TDP-43 et améliore le défaut de traduction observé chez les souris modèles de la SLA / FTD. En se basant sur ces résultats, nous suggérons que ces inhibiteurs de NF-ĸB sont considérés comme des traitements potentiels pour les troubles neurodégénératifs avec protéinopathies TDP-43. / Cytoplasmic mis localisation and aggregation of TDP-43, commonly known as TDP-43 pathology is a characteristic hallmark of many neurodegenerative diseases including Amyotrophic lateral Sclerosis and Frontotemporal Dementia (FTD). TDP-43 is a DNA/RNA binding protein majorly located in the nucleus of the cells and plays a crucial role in RNA metabolism, chromatin condensation and translational regulation. Increased cytoplasmic TDP-43 in ALS/FTD has been shown to suppress global translation by binding with RACK1 on polyribosome. However, the impact of TDP-43 pathology on brain neuronal translational profile in vivo remains unknown. Many groups have generated various transgenic mice expressing TDP-43 mutations and showed pathological changes reminiscent of human ALS and FTD in these mice. Previously, it was reported that in ALS cases, TDP-43 binds with p65 NF-κB subunit and enhance its signalling activity in the central nervous system (CNS). Further, a root extract of herbal medicinal plant named Withania somnifera and its active withanolide Withaferin-A (WFA), a potent NF-ĸB inhibitors has reduced inflammation and shown beneficial effects when administered in ALS/FTD mouse models. A study has shown that WFA treatment protected the dopaminergic neurons and motor function in aging rats. WFA has been reported to disrupt the NF-κB essential modulator (NEMO) reorganization by covalently modifying Cysteine-397, and as a result damages IKKβ signalling. In the present thesis, we have tested the therapeutic potential of two NF-ĸB inhibitors WFA and a novel semisynthetic analog of WFA named IMS-088 using transgenic mouse models of FTD/ALS expressing hTDP-43 mutants. In addition, we also aimed to identify neuronal RNA translational profile underlying disease associated changes in FTD/ALS. Treatment of mutant hTDP-43 expressing mice with these NF-ĸB inhibitors ameliorated cognitive deficits, reduced NF-ĸB activity, reduced cytoplasmic TDP-43 aggregates and enhanced levels of autophagy markers. Using mass spectrometry of newly synthesized peptides of ribosomes, we also studied the impact of IMS-088 treatment on neuronal translational profile using a double transgenic RiboTag;hTDP-43ᴬ³¹⁵ᵀ mice. We identified and report for the first time that TDP-43 proteinopathy causes neuronal cytoskeletal disorganization including translational repression of neurofilament mRNAs. Further, our study revealed that induction of autophagy reduces TDP-43 pathology and improves the translational defect seen in mice models of ALS/FTD. Based on these finding, we suggest that these NF-ĸB inhibitors should be considered as potential therapeutics for neurodegenerative disorders with TDP-43 proteinopathies.

La calcification de la valve aortique (CVA) est l’un des plus importants types de maladies cardiovasculaires dans les pays industrialisés. Il s’agit notamment de la condition la plus fréquente de valvulopathie cardiaque aux États-Unis et en Europe de l’Ouest. À ce jour, il n’existe aucun agent thérapeutique pour guérir ou prévenir la progression de la maladie et le remplacement chirurgical de la valve aortique est réalisé uniquement pour les patients ayant atteint un stade sévère de la maladie. Un facteur clé dans le processus de calcification est le pyrophosphate inorganique extracellulaire (PPi) qui agit en tant qu’inhibiteur de calcification. Il est donc nécessaire de maintenir les niveaux de PPi à une certaine concentration pour contrôler les dépôts de calcium dans les tissus afin d’éviter la minéralisation pathologique. Des études récentes, réalisées dans le laboratoire du Dr Patrick Mathieu (Faculté de médecine, U. Laval), ont montré qu’une enzyme régulant les niveaux de PPi était impliquée dans la maladie. En effet, une augmentation de l'expression et de l'activité d'une ectonucléotide pyrophosphatase/phosphodiestérase de type 1 (NPP1) favorise le processus de minéralisation dans la valve aortique. L’inhibition de cette enzyme représente donc un enjeu majeur dans le développement de médicaments, d’où la naissance de mon projet dans le design et la synthèse d’inhibiteurs de NPP1. Dans la présente thèse, une librairie de molécules a été développée. Dans un premier temps, la littérature nous a guidés quant au choix d’une structure phare d’inhibiteur. Par la suite, des modifications structurales de cette dernière appuyées par la modélisation moléculaire et les résultats biologiques ont permis d’établir des relations structure-activité pour l’inhibition de NPP1. Enfin, parmi les nombreux inhibiteurs synthétisés, il sera possible de réaliser une étude in vivo pour l’un des composés afin de mieux évaluer le potentiel thérapeutique de ce dernier. / Calcific aortic valve disease (CAVD) is one of the most important types of cardiovascular diseases in industrialized countries. In particular, CAVD is the most common heart valve disorder in the United States and Western Europe. So far, there are no therapeutic agents available to cure or prevent progression of aortic valve mineralization and valve replacements are performed only when the disease stage is advanced. Extracellular inorganic pyrophosphate (PPi) acting as an inhibitor of calcification is a key factor in the calcification process. Therefore, PPi levels must be maintained at certain concentration which control calcium deposits in tissues in order to avoid pathological mineralization. Recent studies from Mathieu group (Faculty of medicine, U. Laval) have shown that an enzyme which regulates PPi levels was involved in CAVD. Indeed, an increase of the ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1 (NPP1) enzymatic activity promotes mineralization process in the aortic valve. Therefore, NPP1 inhibition represents a major challenge in drug development, hence the origin of my research project for the design and the synthesis of NPP1 inhibitors. In this thesis, a library of compounds has been developed. First, literature was very helpful for choosing a lead compound. Then, structure diversification of this compound supported by molecular modelling and biological results allowed us to establish a structure-activity relationship for NPP1 inhibition. Among the synthesized inhibitors, it will be possible to realize an in vivo study for one of them in order to evaluate its therapeutic potential.

L'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie rare caractérisée par une obstruction progressive et un remodelage vasculaire des artères pulmonaires distales, conduisant à une pression artérielle pulmonaire moyenne supérieure à 20mmHg. L'augmentation de la pression aboutit à une dysfonction du ventricule droit et la mort. À l'heure actuelle, il n'existe pas de traitement curatif pour l'HTAP. Il est donc primordial d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Comme dans le cancer, les cellules musculaires lisses de l'artère pulmonaire des patients atteints d'HTAP présentent un phénotype hyper-prolifératif et résistant à l'apoptose, entraînant un remodelage vasculaire pulmonaire. Ainsi, plusieurs stratégies thérapeutiques anti cancéreuses pourraient être utiles pour le traitement de l'HTAP. Compte tenu de l'expression altérée des récepteurs tyrosines kinases dans l'HTAP ainsi que dans le cancer, les inhibiteurs de tyrosine-kinases (ITK) ont été mise sur le marché pour le traitement de différents types de cancers et ont été envisagées dans le cadre de l'HTAP. Ainsi, l'ITK, Imatinib, a été capable de régresser l'HTAP induite dans des modèles expérimentaux, tandis que l'administration d'un autre inhibiteur, le Dasatinib, était associée au développement de l'HTAP. Récemment, plusieurs études observationnelles ont démontré le développement de l'HTAP chez des patients atteints d'un cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) présentant des réarrangements de la kinase lymphocytaire anaplasique (ALK) et qui ont reçu des ITK ALK/cMET, notamment Xalkori (R-Crizotinib), Ceritinib, Brigatinib et Lorlatinib. Étant donné que l'hypertension pulmonaire peut être associée à plusieurs maladies, y compris le cancer du poumon, la question demeure de savoir si le développement de l'HTAP chez les patients atteints d'un cancer du poumon recevant l'ITK ALK/c-MET représente un événement indésirable du médicament ou un résultat de la propagation de la maladie. Ainsi, l'objectif principal de chapitre 1 est de déterminer si le R-Crizotinib (connu sous le nom de Xalkori et qui est une première ligne de traitement des patients ayant un CPNPC-ALK positif) exacerbe l'HTAP et/ou prédispose à l'HTAP dans des modèles animaux. In vivo, le traitement par R-Crizotinib a entraîné une élévation marquée de la pression systolique du ventricule droit et de la pression artérielle pulmonaire moyenne associée à une augmentation de l'épaisseur de la paroi médiale des artères pulmonaires distales. De plus, R-Crizotinib, administré avant l'exposition à une faible dose de monocrotaline (MCT), induit une réponse hypertensive pulmonaire exagérée, comme en témoigne une augmentation de la pression systolique du ventricule droit et de la pression artérielle pulmonaire moyenne, de l'épaisseur de la paroi médiale et une diminution du débit cardiaque. In vitro, nous avons démontré que le traitement avec R-Crizotinib réduit la prolifération des cellules endothéliales contrôles de l'artère pulmonaire, effet associé à la formation de cellules multinucléées, ce qui est généralement observée dans les cellules qui meurent d'une une catastrophe mitotique. En conclusion, nous avons démontré que l'agent anticancéreux R-Crizotinib favorise le dysfonctionnement des cellules endothéliales, conduisant à la prédisposition et à l'exacerbation de l'HTAP dans des modèles animaux. Les dernières années de recherche ont approuvé l'importance des marques épigénétiques dans le développement de l'HTAP. En effet, nous nous sommes intéressés, dans le deuxième volet de la thèse, au facteur épigénétique « G9a », qui s'est révélé surexprimé dans différents types de cancers, favorisant la survie et la prolifération des cellules. Compte tenu de l'analogie cancer/HTAP, G9a fut un candidat idéal pour l'étude de son potentiel rôle dans le développement de l'HTAP. Ainsi, l'objectif principal du chapitre 2 est de déterminer si G9a est impliqué dans la progression et la pathogenèse de l'HTAP et de déterminer si son inhibition est bénéfique dans les modèles animaux. Nous avons démontré que G9a est surexprimé dans les artères pulmonaires de patients HTAP et dans les modèles expérimentaux. In vitro, l'inhibition pharmacologique de G9a à l'aide de BIX01294 diminue drastiquement la capacité d'hyper prolifération et la résistance à l'apoptose des cellules musculaires lisses HTAP. Grâce au séquençage d'ARN, nous avons démontré que l'inhibition de G9a s'accompagnait d'une altération du flux d'autophagie et d'une accumulation de lipides. Enfin, le traitement thérapeutique avec BIX01294 a réduit le remodelage vasculaire pulmonaire et la pression artérielle pulmonaire moyenne dans un modèle expérimentale de rat et a également amélioré l'hémodynamique pulmonaire et la fonction ventriculaire droite dans un autre modèle de souris. Ces résultats suggèrent que l'inhibition de G9a pourrait représenter une nouvelle approche thérapeutique dans l'HTAP. / Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a rare and fatal disease characterized by "a progressive loss and obstructive remodeling of pulmonary arteries (PAs) leading to a mean pulmonary arterial pressure (mPAP) greater than 20mmHg. The persistent elevation of pulmonary pressures leads to right ventricular dysfunction and death. Currently, there is no cure for patients with PAH, which increases the need to develop new and effective therapeutic strategies. Pulmonary artery smooth muscle cells (PASMCs) from PAH patients exhibit a "cancer-like" hyperproliferative and apoptosis-resistant phenotype leading to pulmonary vascular remodeling. Therefore, several anti-cancer therapies could be useful for the treatment of PAH. Given the altered expression of receptor tyrosine kinases and their ligands in PAH as well as in cancer, tyrosine kinase inhibitors (TKIs) have been marketed for the treatment of different types of cancers and have been in the spotlight for anti-PAH drug research. Indeed, the tyrosine kinase inhibitor, Imatinib, was able to regress established PAH in experimental models, while the administration of another inhibitor, Dasatinib, was associated with the development of PAH. Recently, several observational studies have highlighted the development of PAH in patients with non-small cell lung cancer (NSCLC) with anaplastic lymphocyte kinase (ALK) rearrangements who received ALK/cMET TKIs, including Xalkori (R-crizotinib), Ceritinib, Brigatinib, and Lorlatinib. Since pulmonary hypertension can be associated with several diseases, including lung cancer, the question remains whether the development of PAH in lung cancer patients receiving cMET/ALK TKIs represents an adverse drug event or a result of disease spread. Thus, the main objective of Chapter 1 is to determine whether R-Crizotinib (known as Xalkori and which is the first-line treatment for patients with advanced ALK-positive NSCLC) exacerbates PAH and/or predisposes to PAH in experimental animal models. In vivo, R-Crizotinib treatment resulted in a marked elevation of the right ventricular systolic pressure (RVSP) and mPAP which was associated with an increased medial wall thickness of the distal PAs. Additionally, we found that pretreatment of rats with R-Crizotinib, induced an exaggerated pulmonary hypertensive response, as evidenced by the increased RVSP, mPAP, medial wall thickness, and decreased cardiac output. In vitro, we have demonstrated that treatment with R-Crizotinib reduces the proliferation of control pulmonary artery endothelial cells, which was accompanied by the appearance of multinucleated cells, a feature commonly seen in cells dying from mitotic catastrophe. In conclusion, we have demonstrated for the first time that the anticancer agent R-Crizotinib promotes endothelial cell dysfunction, leading to susceptibility and exacerbation of PAH in animal models. Previous studies have demonstrated the importance of epigenetic marks in the development and progression of PAH. Indeed, we were interested in the second part of the thesis, in the epigenetic factor "G9a", which was found to be overexpressed in different types of cancers, promoting cell survival and proliferation. Given the similarities between PAH and cancer, G9a was the ideal candidate to study in PAH. Thus, the main objective of Chapter 2 is to determine if G9a is involved in the progression and pathogenesis of PAH and to determine if its inhibition is beneficial in PAH animal models. We demonstrated that G9a is overexpressed in PAs of PAH patients and in experimental models. In vitro, we found that pharmacological inhibition of G9a using BIX01294 drastically reduces the PAH-PASMC proliferation and survival. Through RNA sequencing analysis, we demonstrated that G9a inhibition is accompanied by an impaired autophagy flux and lipid accumulation. Finally, therapeutic treatment with BIX01294 reduced pulmonary vascular remodeling as well as mPAP in an experimental rat model and also improved pulmonary hemodynamics and right ventricular function in another PAH mouse model. These results suggest that G9a inhibition could represent a new therapeutic approach in PAH.

Malgré 40 années de recherche sur le VIH, il n'existe toujours pas de traitement curatif ou de vaccin contre ce virus. Bien que les traitements antirétroviraux aient transformé la vie des personnes vivant avec le VIH en diminuant la mortalité et la morbidité, et en améliorant la qualité de vie, plusieurs problèmes y sont associés, comme des effets indésirables, une incapacité d'éradiquer les cellules réservoirs et une persistance de l'état inflammatoire. Donc, pour tenter d'atteindre l'objectif fixé par l'ONUSIDA de mettre fin à l'épidémie du SIDA d'ici 2030, il est primordial de développer de nouvelles molécules contre le VIH. Puisque ces nouveaux traitements ne peuvent pas être testés sur des humains pour des considérations éthiques, des modèles animaux doivent être utilisés. Les souris NSG sont des souris immunodéficientes qui peuvent accepter un greffon. L'injection de cellules souches hématopoïétiques humaines à ces souris permet le développement d'un système immunitaire humain. En effet, les souris NSG humanisées développent plusieurs types de cellules hématopoïétiques humaines comme des lymphocytes T, des lymphocytes B et des cellules myéloïdes dans le sang et dans plusieurs organes comme la rate, la moelle osseuse, les poumons et le thymus. Cependant, il y a plusieurs facteurs qui influencent le développement du greffon, comme la source des cellules hématopoïétiques injectées et le sexe des souris. Les souris NSG humanisées peuvent être infectées par le VIH par voie vaginale ou rectale, ce qui permet d'étudier l'efficacité de traitements contre ce virus. Le DCIR est une nouvelle cible proposée pour combattre l'infection par le VIH, puisque ce récepteur joue plusieurs rôles dans l'infection. Des inhibiteurs du DCIR diminuent l'infection par le VIH in vitro, mais pas in vivo chez des souris NSG humanisées infectées. Des études de relation structure-activité seraient nécessaire pour améliorer l'efficacité de ces inhibiteurs in vivo. / Despite 40 years of research on HIV, there are still no cures or vaccines that exist against this virus. Still, some major advancements were made, such as the introduction of antiretroviral therapies, which greatly reduced the mortality and the morbidity associated with the infection. Even though antiretroviral therapies changed the life of people living with HIV for the better, there are still issues with these treatments, such as side effects, inability to eradicate viral reservoirs, viral resistance, and persistence of the inflammatory state. Therefore, in order to reach UNAIDS' objective of ending the AIDS pandemic by 2030, new treatments against HIV must be developed. Since these new treatments cannot be tested on humans for ethical considerations, animal models such as humanized NSG mice must be used. NSG mice are immunodeficient mice that can accept a graft. Hence, the injection of human hematopoietic stem cells to these mice results in the development of a human immune system in these animals. Indeed, multiple human hematopoietic cell types, such as T cells, B cells and myeloid cells, are detected in the blood, the spleen, the bone marrow, the lungs and the thymus of humanized NSG mice. However, there are multiple factors that can influence the development of the human hematopoietic graft in NSG mice, such as the source of hematopoietic stem cell injected and the sex of the mice. Humanized NSG mice can be infected with HIV by vaginal and rectal routes, which allows for the study of treatments against this virus. The DCIR is a new proposed target against HIV infection since this receptor plays multiple roles during HIV infection. DCIR inhibitors limit HIV infection in vitro, but not in vivo in humanized NSG mice. Structure-activity relationship studies must be conducted in order to improve the efficacy of DCIR inhibitors in vivo.

Avec le développement récent des variétés végétales transgéniques, la mise au point et l'application d'approches adaptées à l'étude de leur innocuité apparaît importante. L'intégration de nouveaux caractères montrant un impact réel ou possible sur les caractéristiques de la plante modifiée, en particulier, rendent impératif la mise au point de stratégies à la fois exhaustives et efficaces pour une prise en compte correcte de leurs impacts éventuels sur la santé humaine. À titre d'exemple, des lignées de pomme de terre transgéniques exprimant un inhibiteur de protéases de type aspartate, l'inhibiteur CDI (pour Cathepsin D lnhibitor) de tomate, ont été développées dans notre laboratoire dans le double but de protéger la plante contre les insectes et de stabiliser les protéines recombinantes éventuellement exprimées dans ses tissus. Suite à des démonstrations diverses quant à leur efficacité (Brunelle et al., 2004, Rivard et al., 2006), il est apparu clair rapidement que l'expression du transgène cdi avait un impact marqué sur le métabolisme de la plante, avec des effets éventuels possibles sur les caractéristiques de ses tissus comestibles. Afin d'évaluer l'innocuité de ces lignées pour la santé humaine, une étude en plusieurs volets a été réalisée ici, basée sur les normes définies par les agences internationales de sécurité alimentaire. L'évaluation sanitaire des OGM repose en général sur un principe de base appelé équivalence en substance, qui consiste à comparer les teneurs en macronutriments, en micronutriments et en composés anti-nutritionnels et toxiques dans les lignées transgéniques à l'étude et dans leur contrepartie conventionelle. Dans le cadre du présent projet, une analyse compositionnelle de base a été faite pour les composantes majeures, mineures et toxiques de tubercules produits à partir de lignées de pomme de terre CDI et de lignées témoins transgéniques et conventionnels. Toutes les composantes analysées n'ont montré aucune variation significative quant à leur teneur dans les lignées analysées (ANOVA; P < 0.05), à l'exception de variations mineures pour le magnésium. Afin d'obtenir une image plus générale (ou "holistique") et pour augmenter les chances de détecter d'éventuels effets pléiotropiques suite à l'insertion du transgene cdi dans le génome de plante, une analyse protéomique basée sur l'électrophorèse bidimensionnelle (2-DE) a été réalisée pour le suivi comparatif de nombreuses protéines en simultané. Les données obtenues indiquent que les pommes de terre CDI étaient équivalentes aux pommes de terre conventionnelles obtenues de la lignée-mère, exception faite de la protéine recombinante CDI. Etant donné les liens de parenté entre l'inhibiteur CDI et un ensemble de protéines potentiellement allergènes retrouvés naturellement dans les tubercules, il convenait ensuite d'effectuer une évaluation spécifique des risques d'allergénicité associés aux tubercules modifiés. L'évaluation du potentiel allergène des OGM, effectuée généralement selon des normes établies par l'OMS et la FAO, tient compte de l'origine du transgène inséré, de l'homologie de séquence entre la protéine recombinante et les protéines connues comme étant allergènes, des phénomènes de réactivité croisée avec des allergènes connus, des propriétés physico-chimiques de la même protéine et de son immunogénicité potentielle évaluée in vivo dans des modèles animaux. In silico, l'inbiteur CDI de tomate s'est avéré partager un haut degré de similarité avec son équivalent structural de la pomme de terre, et avec d'autres protéines de type Kunitz de la pomme de terre reconnues comme étant allergènes. Ces données nous suggéraient alors d'évaluer plus à fond le comportement de ces différentes protéines dans les différentes lignées testées. Des tests de digestibilité in vitro ont d'abord été réalisés pour étudier la stabilité relative de ces différentes protéines en conditions de pH extrêmes et en présence de protéases de type pepsique et pancréatique. En bref, nous avons observé que les protéines de type Kunitz dans le tubercule cru étaient résistantes à l'hydrolyse pepsique et pancréatique sur une période d'au moins 60 min. Tenant compte des procédés de transformation auxquels la pomme de terre est généralement soumise, des pommes de terre cuites dans l'eau, des pommes de terre cuites au four à micro-ondes et des frites ont été préparées pour estimer la stabilité des protéines endogènes à la chaleur. Toutes les protéines de type Kunitz se sont avérées relativement stables mais néanmoins digérées complètement et en quelques minutes (par les protéases) après un traitement à 100 °C pendant 5 min, ce qui suggère que la protéine CDI et ses homologues de type Kunitz pourraient montrer un potentiel allergène à l'état cru, mais pas après cuisson. Afin de compléter cette évaluation des lignées CDI, des splénocytes isolés de la rate de souris BALB/c naïves ont été mis en culture pour déterminer leur taux de prolifération in vitro et leur profil en cytokines en réponse aux protéines de pomme de terre. Les résultats ont montré une prolifération élevée pour les protéines natives (non dénaturées), en comparaison à celles traitées à la pepsine ou à la chaleur. Une induction plus élevée de l'interféron gamma (IFN-y), au détriment de l'interleukine-4 (IL-4), a aussi été notée. Un autre groupe de souris BALB/c a été administrée oralement des protéines solubles de la plante afin de distinguer 1' immunogénicité des protéines de leurs effets allergènes. Il a été démontré, en bref, que les protéines de pomme de terre sont immunogènes plutôt qu'allergènes chez les souris. Étant donné que la protéine CDI montre une homologie de 30% avec l'inihibeur de trypsine de soya SBTI et que les deux protéines appartiennent à la même famille, la famille Kunitz, un test complémentaire avec le sérum de patients humains allergiques au soya a finalement été réalisé in vitro. En résumé, aucune activité croisée n'a été démontrée, nous suggérant à nouveau que les pommes de terre CDI étudiées dans cette étude n'étaient pas plus (ou moins) allergènes que leur équivalents conventionnels analysés en parallèle. L'ensemble de données obtenues dans le cadre de ce projet suggèrent, en somme, que les tubercules issus de lignées CDI sont équivalents aux tubercules conventionels correspondants, et que le transgène cdi exprimé dans les lignées modifiées n'est à l'origine d'aucun effet immunogène ou allergène particulier à l'inverse des effets parfois observables pour les protéines endogènes de même famille retrouvées dans le tubercule.

OBJECTIF: Déterminer si un régime de Bicalutamide et de Dutasteride est d’efficacité similaire à un régime standard pour la cytoréduction prostatique avant une curiethérapie prostatique par implants permanents et comparer la toxicité de ces deux régimes. MÉTHODE Les patients avec un adénocarcinome de la prostate traités par curiethérapie prostatique ayant un volume prostatique initial de plus de 50 cc ont été randomisés soit à un régime de Bicalutamide 50 mg die, de Dutasteride 0.5 mg die et de tamoxifen 10 mg die pour prévenir la gynécomastie (Groupe expérimental = GE) versus un agoniste de la LHRH (dose de 3 mois) avec du Bicalutamide 50 mg die pour 1 mois (Groupe contrôle = GC). Le volume prostatique total (VPT) a été mesuré à la randomisation (t1) et environ 2.5 mois après le début du traitement de cytoréduction (t2). La curiethérapie par implant permanent d’I-125 à été réalisé environ 3 mois après la randomisation. Le changement de VPT relatif en % à été comparé entre les groupes. Des questionnaires EPIC (Expanded Prostate Index Composite) ont été complétés au t1, t2, ainsi qu’à 6 semaines (t3), 3 mois (t4) et 6 mois (t5) post-curiethérapie. Le profil de changement des scores sexuels et hormonaux du questionnaire EPIC a été évalué de façon qualitative. RÉSULTATS Les premiers 11 patients randomisés dans l’étude ont été analysés (GE n=5, GC ; n=6). Les caractéristiques de base entre les deux groups étaient similaires. Tous les patients présentaient des caractéristiques de cancer de prostate de bas risque (APS&lt; 10, Stade clinique ≤T2a et un score de Gleason ≤6). Le VPT médian au t1 était de 51,00 cc dans le GE et de 55,56 cc dans le GC. Les diminutions médianes entre le volume t1 et le volume t2 en absolu étaient de 18,46 cc dans le GE et de 24,61 cc dans le GC (valeur-p au test exact de Wilcoxon 0,03). Pour ce qui est de la médiane de changement relatif de volume entre t1 et le volume au t2, celles-ci étaient de 36,44 % dans le GE et de 40,83 % dans le GC (valeur-p 0,25). Tous les 11 patients ont pu subir la curiethérapie sans interférence de l’arche pubienne et avec des paramètres dosimétriques acceptables. Les médianes de scores de fonction sexuelle et de sommaire hormonal semblent qualitativement démontrer un meilleur profil au sein du GE. DISCUSSION Cette analyse exploratoire n’a pas la puissance suffisante pour permettre de rejeter ou d’affirmer une hypothèse de non-infériorité du régime expérimental du point de vue de la cytoréduction prostatique. Toutefois, ce régime a permis à tous les patients de subir la curiethérapie sans interférence de l’arche pubienne et avec des paramètres dosimétriques acceptables. Le Bicalutamide et le Dutasteride ont aussi démontré un profil de toxicité favorable. Les résultats de cette analyse précoce justifient donc de continuer à randomiser des patients au sein de cette étude mais ne permettent pas de tirer des conclusions définitives en raison de la petite taille d’échantillon. / OBJECTIVE: To determine if a regimen of Bicalutamide and Dutasteride is of similar efficacy compared to a standard regimen for prostate cytoreduction prior to permanent implant prostate brachytherapy and to compare toxicity for both of these regimens MATERIALS AND METHODS Patients with an adenocarcinoma of the prostate treated with permanent implant brachytherapy having an initial total prostate volume of 50 cc or more were randomized to either Bicalutamide 50 mg daily, Dutasteride 0.5 mg daily and Tamoxifen 10 mg daily (Experimental group = EG) or an LHRH agonist (3 month dose) and Bicalutamide 50 mg daily for one month (Control Group = CG). Total prostate volume (TPV) was evaluated at time of randomization (t1) and approximately 2.5 months after the start of cytoreductive therapy (t2). Permanent implant I-125 brachytherapy was completed 3 months after randomization. Relative TPV change in % and absolute TPV change in cc were compared between groups. Expanded Prostate Index Composite questionnaires were completed by patients at t1, t2, as well as at 6 weeks (t3), 3 months (t4), and 6 months (t5). Profile changes in EPIC sexual and hormonal domains were evaluated qualitatively. RESULTS The first 11 patients registered for the study were analyzed (EG n=5; CG n=6) Baseline parameters were similar between groups. All patients had low risk characteristics (PSA &lt; 10, Clinical stage ≤T2a and Gleason score ≤6). Median baseline TPV was 51.00 cc in EG and 55.56 in CG. Median reduction in absolute TPV was 18.46 cc in EG and 24.61 in CG (Wilcoxon exact test p=0.03). As for median relative change in TPV, this was 36.44 % in EG and 24.61 cc in CG (p=0.25). All 11 patients were able to undergo brachytherapy without pubic arch interference and with acceptable dosimetric parameters. Median EPIC of both sexual and hormonal domains of the EPIC questionnaire seemed to favor the EG over time. DISCUSSION This early exploratory analysis does not have sufficient power to reject or accept the hypothesis of non-inferiority the experimental regimen for prostate volume reduction. Nonetheless, this regimen allowed brachytherapy without pubic arch interference and with acceptable dosimetric parameters. The experimental regimen of Bicalutamide and Dutasteride also seemed to show a favorable toxicity profile. The results of this early analysis thus justify continued randomization for the study but do not allow definitive conclusions due to small sample size.