Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La potentialisation synaptique dans les neurones d'hippocampes repose sur l'activation du récepteur NMDA (NMDAR) et l'influx de Ca²⁺. Des changements dans le Ca²⁺ cytosolique sont détectés par des effecteurs tels que la calpaïne et la protéine kinase II Ca²⁺/calmoduline-dépendante (CaMKII), transformant ces informations en signaux qui induisent une potentialisation synaptique. Une fois activée par l'influx de Ca²⁺, la calpaïne clive de nombreuses protéines cytosoliques, récepteurs et protéines d'échafaudage, remodelant ainsi la structure synaptique, ainsi que l'activité et/ou la dynamique de nombreuses protéines. Le rôle de la calpaïne au cours du processus de plasticité synaptique a été documenté, mais le mécanisme moléculaire est loin d'être clair. Dans cette étude, nous avons examiné le lien possible entre la calpaïne et CaMKII dans la médiation de la potentialisation à long terme (LTP). Nous avons utilisé des inhibiteurs pharmacologiques de la calpaïne pour interférer avec son activation lors de la potentialisation synaptique induite chimiquement dans des cultures dissociées d'hippocampe de rat. Nous avons d'abord confirmé que l'activité de la calpaïne est essentielle pour l'induction de la LTP dans les cultures neuronales dissociées. Nous montrons que l'activité de la calpaïne est essentielle pour de nombreux processus moléculaires importants pour la LTP. L'inhibition de l'activité de la calpaïne a bloqué la phosphorylation de ERK et l'insertion des récepteurs synaptiques AMPA; deux processus régulés par CaMKII impliqués dans la potentialisation synaptique. De plus, nous montrons que la calpaïne est essentielle pour l'autophosphorylation de CaMKII en utilisant un anticorps contre pCaMKII (Thr286). En mesurant le temps de vie par fluorescence (FLIM) avec un capteur basé sur le transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET) (Camui) de l'activation de CaMKII, nous montrons que l'inhibition de la calpaïne empêche le changement dépendant de l'activité de la conformation de l'holoenzyme CaMKII et donc l'activation de la kinase. Nous avons aussi utilisé l'imagerie time-lapse et avons découvert que la translocation CaMKII post-synaptique dépendante de l'activité est diminuée par les inhibiteurs de la calpaïne. De plus, nous avons mesuré les taux de diffusion de CaMKII par SPT-PALM en utilisant CaMKII-meos2 et les résultats indiquent que l'inhibition de la calpaïne empêche la diminution dépendante de l'activité de la mobilité de l'holoenzyme. Nos résultats montrent clairement que les inhibiteurs de la calpaïne affectent la dynamique de CaMKII. Cela suggère que la calpaïne affecte directement CaMKII ou agit en amont de CaMKII. En effectuant des expériences dans des cellules HEK qui n'ont pas de CaMKII endogène, nous avons démontré que la calpaïne n'affecte pas directement CaMKII. Nous avons émis l'hypothèse que la calpaïne joue un rôle dans le processus de plasticité en amont de CaMKII. Nous avons étudié l'influx Ca²⁺ dépendant de l'activité en utilisant l'imagerie GCaMP6 et nos résultats indiquent que l'activité de la calpaïne est essentielle pour cette l'augmentation de Ca²⁺. En disséquant davantage la voie de signalisation, utilisant différents protocoles de stimulation (dépolarisation synaptique ou globale), nous montrons que la calpaïne affecte l'afflux de Ca²⁺ dépendant de NMDA et non l'influx de Ca²⁺ dépendant de la dépolarisation. Ainsi, notre étude montre que la calpaïne joue un rôle essentiel dans la LTP d'une manière dépendante du NMDAR et que l'inhibition de la calpaïne interfère dans les premières étapes de la signalisation médiée par le Ca²⁺ conduisant à l'induction du LTP. En discutant de ces résultats, nous fournissons des résultats préliminaires qui peuvent nous éclairer au niveau de l'impact de l'inhibition pharmacologique de la calpaïne sur la fonction des récepteurs NMDA. / Synaptic potentiation in hippocampal neurons relies on NMDA receptor (NMDAR) activation and Ca²⁺ influx. Changes in cytosolic Ca²⁺ are detected by effectors such as calpain and Ca²⁺/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII), transforming this information into signals inducing synaptic potentiation. Once activated by Ca²⁺ influx, calpain cleaves many cytosolic proteins, receptors, and scaffolding proteins, thereby remodeling the synaptic structure, as well as the activity and/or dynamics of many proteins. The role of calpain during the synaptic plasticity process has been documented, but the molecular mechanism is far from clear. In this study, we examined the possible link between calpain and CaMKII in the mediation of Long Term Potentiation (LTP). We used pharmacological inhibitors of calpain to interfere with its activation during chemically induced synaptic potentiation in rat hippocampal dissociated cultures. We first confirmed that calpain activity is essential for LTP induction in dissociated neuronal cultures. We show that calpain activity is essential for many molecular processes important for LTP. Inhibition of calpain activity blocked ERK phosphorylation and insertion of synaptic AMPA receptors - two CaMKII-regulated processes involved in synaptic potentiation. Further, we show that calpain is essential for CaMKII autophosphorylation by using an antibody against pCaMKII (Thr286). By performing Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based sensor (Camui) of CaMKII activation, we show that calpain inhibition prevents activity-dependent change in the conformation of the CaMKII holoenzyme and thus the activation of the kinase. We further used time-lapse imaging and found that activity-dependent post-synaptic CaMKII translocation is decreased by calpain inhibitors. Furthermore, we measured diffusion rates of CaMKII by SPT-PALM using CaMKII-meos2 and the results indicate that calpain inhibition prevents the activity-dependent decrease in the mobility of the holoenzyme. Our results clearly show that calpain inhibitors affect CaMKII dynamics. This suggests that either calpain affects CaMKII directly or is upstream to CaMKII. By performing experiments in HEK cells that do not have endogenous CaMKII, we demonstrated that calpain does not affect CaMKII directly. We hypothesized that calpain plays a role in the plasticity process at an upstream level to CaMKII. We investigated activity-dependent Ca²⁺ influx using GCaMP6 imaging and our results indicate that calpain activity is essential for this increase in Ca²⁺. Further dissecting the pathway, using different stimulation protocols (synaptic or global depolarisation), we show that calpain affects NMDA-dependent Ca²⁺ influx and not the depolarisation dependent Ca²⁺ influx. Thus, our study shows that calpain plays an essential role in LTP in an NMDAR dependent manner and that inhibiting calpain interferes in the early steps of Ca²⁺- mediated signaling leading to LTP induction. In discussing these results, we provide preliminary results that may shed light on the impact of pharmacological inhibition of calpain on NMDA receptor function.

En insuffisance rénale chronique (IRC), on observe un déséquilibre minéral qui est associé au développement d’un remodelage osseux anormal et de calcification vasculaire, un processus qui est semblable à la formation osseuse car il implique une trans-différenciation de cellules musculaires lisses vasculaires en cellules ostéoblastiques semblables à celles retrouvées dans l’os. Un lien a été rapporté entre le remodelage osseux ralenti et la calcification vasculaire en IRC mais la cause de ce lien demeure mal comprise. Nous avons étudié l’implication des inhibiteurs de la voie Wnt dans ce lien dans un modèle d’IRC chez le rat avec calcification vasculaire induite par un supplément de calcium, phosphore et vitamine D (Ca/P/vitD). Les animaux IRC+Ca/P/vitD présentaient de la calcification vasculaire, un remodelage osseux ralenti, un défaut de minéralisation et des niveaux sériques et vasculaires d’inhibiteurs de la voie Wnt élevés. La présence dans le vaisseau calcifié d’un inhibiteur de la voie Wnt de source ostéocytaire, la sclérostine, suggère que les cellules ostéoblastiques acquièrent un phénotype ostéocytaire. De plus, les inhibiteurs de la voie Wnt produits par le vaisseau pourraient avoir des conséquences sur l’os, ce qui cadrerait avec la formation ralentie et le défaut de minéralisation observés. Les inhibiteurs de la voie Wnt en circulation pourraient aussi avoir des effets vasculaires puisque les vaisseaux calcifiés présentaient des signes d’inhibition de la voie Wnt/β-caténine, les niveaux d’inhibiteurs de la voie Wnt ne semblant toutefois pas associés à un ralentissement de la calcification. Nos résultats mettent donc en lumière une implication potentielle des inhibiteurs de la voie Wnt dans le lien entre l’os et le vaisseau en IRC. / Chronic kidney disease (CKD) patients suffer from a dysregulation of minerals levels which is associated with abnormal bone remodeling and vascular calcification, a process similar to bone formation in that it implies the trans-differentiation of vascular smooth muscle cells into osteoblast-like cells. A link was reported between decreased bone formation and vascular calcification in CKD, but the cause of this link remains unclear. We have studied the involvement of Wnt pathway inhibitors in this process in a rat model of CKD with vascular calcification induced by a calcium, phosphorus and vitamin D supplement (Ca/P/vitD). CKD+Ca/P/vitD rats presented with vascular calcification, decreased bone turnover, defective mineralization and increased levels of circulating and vascular Wnt inhibitors. The expression by the calcified vessel of sclerostin, a Wnt inhibitor typically produced by osteocytes, suggests that vascular osteoblast-like cells could acquire an osteocytic phenotype as osteoblasts do in bone. Moreover, vascular Wnt inhibitors could have consequences on bone and contribute to the decrease in bone formation and the mineralization defect. The high circulating levels of Wnt inhibitors could also have vascular effects, which is supported by the fact that the Wnt/β-catenin pathway appears to be inhibited in the calcified vessels despite the fact that high levels of Wnt inhibitors were not correlated with a decrease in the severity of vascular calcification. Our results therefore suggest an implication of Wnt pathway inhibitors in the bone-vessels link that is frequently observed in CKD.

L’infection par HIV-1 représente un des problèmes de santé publique majeurs de notre société actuelle. Le traitement HAART (Highly Active AntiRetroviral Therapy) inhibe le cycle réplicatif viral mais ne permet pas l’éradication du HIV-1. La principale cause de cet échec thérapeutique est la persistance de réservoirs cellulaires infectés de manière latente par HIV-1, qui, lors de l’arrêt du traitement HAART, sont à l’origine d’un rebond de la charge plasmatique virale. Le défi actuel est donc de découvrir de nouvelles méthodes d’élimination des cellules réservoirs. Une des stratégies envisagées est de forcer l’expression virale dans les cellules infectées de manière latente afin d’entraîner leur destruction suite à leur détection par le système immunitaire ou suite aux effets cytopathiques viraux. Parallèlement, le traitement HAART serait maintenu afin de limiter la propagation des virions néo-synthétisés. Plusieurs éléments sont impliqués dans la répression transcriptionnelle associée à la latence post-intégrationnelle du virus HIV-1 :la nature du site d’intégration ;l’absence de facteurs cellulaires inductibles tels que NF-κB ;la structure chromatinienne du provirus et les modifications post-traductionnelles des histones ;l’absence de niveaux suffisants de la protéine trans-activatrice Tat. De plus, notre laboratoire a précédemment mis en évidence un lien entre deux de ces éléments, en démontrant, dans une lignée modèle de latence post-intégrationnelle, que la cytokine pro-inflammatoire TNFα, un activateur de la voie de signalisation NF-κB, permet une réactivation synergique de l’expression virale combinée à l’inhibiteur d’histone-désacétylases (HDACI) TSA. Cependant, l’utilisation thérapeutique du TNFα et de la TSA est inenvisageable en raison de leurs toxicités.<p>\ / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Organic nitrates, such as nitroglycerine (NTG), are widely used for their potent vasodilator capacity in the management of coronary artery disease and heart failure. Unfortunately, their beneficial effect is rapidly lost due to the development of nitrate tolerance, which is translated by an impaired vasorelaxation to NTG and an increased oxidative stress production. Although the mechanisms of the development of nitrate tolerance are still not fully elucidated, much interest has been focused in treating nitrate-receiving patients together with other drugs in order to overcome the development of nitrate tolerance. The Nitric Oxide generating enzyme, eNOS, and the superoxide anion generating enzyme, NAD(P)H oxidase, have been suggested to play a role in the development of nitrate tolerance. The aim of this study was to analyse the underlying mechanism by which ramipril, an ACE inhibitor and rosuvastatin, a new molecule of the statin class, are able to protect against the development of nitrate tolerance in the aortas isolated from rats, wild-type (wt) and eNOS-/- mice. <p>These results show that ramipril as well as rosuvastatin are able to protect against the development of nitrate tolerance in the wt and eNOS-/- mice aortas suggesting that eNOS is not necessary for their protective effect. The aortas from nitrate tolerant rats and mice showed a significant increase in the NAD(P)H oxidase activation compared to the aortas from the control and from the co-treated ramipril+NTG or rosuvastatin+NTG animals. In line with these findings were the results obtained by RT-PCR analysis: the mRNA expression of the different subunits of the NAD(P)H oxidase, such as gp91phox, p22phox, were significantly decreased after rosuvastatin or ramipril treatment in wt and eNOS-/- mice aortas. Apocynin, the NAD(P)H oxidase inhibitor was also able to inhibit the development of nitrate tolerance in the rat and mouse aortas. <p>In conclusion, these results suggest that rosuvastatin and ramipril are able to protect against the development of nitrate tolerance by counteracting the nitrate-induced oxidative stress. The mechanism of protection involves a direct interaction with the NAD(P)H oxidase pathway and seems to be completely independent of the eNOS pathway. <p> / Doctorat en sciences pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Co-mentorship / Le cancer de l’ovaire est le cancer gynécologique le plus létal, et cinquième cause de mort attribuable au cancer chez les femmes nord-américaines. La létalité de cette maladie est due notamment à sa détection tardive, à sa forte hétérogénéité, et à sa résistance au traitement. L’amélioration du sort des patientes atteintes du cancer de l’ovaire passera donc par une meilleure caractérisation de la maladie, ce qui inclut la découverte de biomarqueurs et le développement de voies de traitement efficaces. Pour ce faire, des modèles d’étude représentatifs et bien caractérisés sont nécessaires, et la nature hétérogène du cancer de l’ovaire souligne le besoin d’un grand nombre de modèles diversifiés sous plusieurs aspects. Les modèles cellulaires sont une option peu dispendieuse et facile à entretenir, avec lesquels il est possible d’effectuer des expériences à haut débit. La fiabilité des modèles cellulaires se base sur l’abondance et la diversité, où un grand nombre de lignées cellulaires issues de contextes cliniques et moléculaires variés sont requises pour dresser un portrait représentatif de la maladie. Dans le cadre de cette thèse, dix nouveaux modèles de cancer épithélial de l’ovaire, incluant des lignées de deux sous-types rares, sont décrits et caractérisés rigoureusement. Ces modèles sont diversifiés en phénotypes et en génotypes, et sont démontrés comme représentatifs de la maladie de laquelle ils sont issus. Ces nouvelles lignées, s’ajoutant à plusieurs autres dérivées dans notre laboratoire, pourront servir à étudier le cancer de l’ovaire sous plusieurs aspects. Notamment, un nombre de ces lignées ont servi à l’étude de la résistance au traitement aux inhibiteurs de la polymérase de poly(ADP-ribose) (PARP), une voie thérapeutique émergente des dix dernières années. Malgré des études prometteuses, plusieurs patientes ne répondent pas au traitement initial, ou cessent de répondre après une durée de traitement, menant à une rechute. Ces deux phénomènes, dits résistance intrinsèque et résistance acquise respectivement, nuisent grandement à la survie des patientes. À l’aide de lignées cellulaires initialement sensibles, nous avons développés des modèles de résistance acquise aux inhibiteurs de PARP par exposition prolongée. Ces lignées dérivées, en combinaison avec des lignées intrinsèquement résistantes, ont mené à la découverte d’un traitement combiné synergique entre les inhibiteurs de PARP et une autre classe de molécule, les inhibiteurs de la nicotinamide phosphoribosyltransférase (NAMPT). Cette enzyme étant responsable de la synthèse du substrat de PARP, la combinaison de ces deux thérapies éradique de façon efficace les modèles résistants, autant à résistance acquise qu’intrinsèque, et ralentit la croissance tumorale en modèle murin. Les inhibiteurs de PARP étant déjà approuvés, et les inhibiteurs de NAMPT étant déjà en essais cliniques, la combinaison de ces voies thérapeutiques serait facilement envisageable en clinique, et l’universalité de son efficacité pourrait drastiquement améliorer le sort de patientes atteintes du cancer de l’ovaire, n’ayant aucun autre recours efficace. / Ovarian cancer is the most lethal gynecological cancer, and fifth leading cause of cancer-related deaths in North American women. The lethality of this disease is notably due to its late detection, its strong heterogeneity, and its resistance to treatment. Improving the fate of ovarian cancer patients will require a better characterization of the disease, which includes discovering biomarkers and effective treatment options. To this effect, representative and well characterized study models are required, and the heterogeneous nature of ovarian cancer underlines the need for a vast number of models with diverse characteristics. Cellular models are an inexpensive and easy to maintain option, with which high throughput experiments are possible. The reliability of cellular models depends on their abundance and diversity, where a large number of cell lines from various clinical and molecular contexts are required to accurately represent the disease. In the context of this thesis, ten new models of epithelial ovarian cancer, including cell lines of two rare subtypes, are described and rigorously characterized. These models are diverse in phenotype and genotype, and are shown to accurately represent the disease from which they are derived. These new cell lines, in addition to many others described in our laboratory, will serve to better study ovarian cancer and its many facets. Notably, a number of these cell lines were used to study resistance to poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitor treatment, an emerging therapy of the past ten years. Despite encouraging studies, a number of patients do not respond initially, or cease to respond after a length of treatment, leading to relapse. These two phenomena, dubbed intrinsic and acquired resistance respectively, greatly hinder patient survival. Using initially sensitive cell lines, we developed models of acquired PARP inhibitor resistance by prolonged exposure. These derived cell lines, along with intrinsically resistant cell lines, served to discover a synergistic combination treatment between PARP inhibitors and another class of drugs, nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) inhibitors. NAMPT as an enzyme is mainly responsible for synthesizing PARP’s substrate, and the combination of these two therapies effectively inhibits models of both intrinsic and acquired resistance, and slows tumor growth in mice. PARP inhibitors are already routinely used in the clinic, and NAMPT inhibitors are currently undergoing clinical trials, making this combination of therapeutic options easily conceivable for clinical use in the future, and the universality of its efficacy could drastically improve the fate of ovarian cancer patients who are out of options.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Le travail décrit dans ce manuscrit vise à caractériser les voies de résistance aux inhibiteurs de CCR5. Lors d’une première étape, nous avons développé un test phénotypique clonal nous permettant d’une part d’identifier le tropisme viral et d’autre part de mesurer la résistance aux inhibiteurs des CCR5. Des virus à tropisme R5 ou X4 représentant aussi peu que 0,4% d’un mélange de populations virales sont détectables par ce test, démontrant ainsi sa sensibilité. De plus, grâce à son approche clonale, cette technique permet de différencier les virus à tropisme double de populations virales mixtes. Par la suite, nous avons étudié l’impact des mutations dans les régions variables de la protéine gp120 de l’enveloppe du virus VIH-1 sur la résistance aux inhibiteurs de CCR5. Pour ce faire, nous avons généré des virus résistants par passage des isolats CC1/85 et BAL, en présence de concentrations sous-inhibitrices de maraviroc (MVC) et vicriviroc (VCV). Après quelques passages du virus CC1/85 en présence de MVC, certaines sont apparues dans differentes régions de la gp120. Par la suite, nous avons sélectionné trois mutations dans les domaines variables de la gp 120, V169M en V2, L317W en V3 et I408T en V4 pour construire des virus contenant des mutations simples, doubles et triples afin d’évaluer la contribution des mutations individuelles ou combinées au phénotype de résistance. Nous avons déterminé la sensibilité de chaque mutant à MVC et VCV, le pourcentage d’infectivité et le tropisme viral par rapport au phénotype sauvage. Tous les mutants ont conservé le tropisme R5 et ont montré une diminution d’infectivité par rapport au contrôle. Nos résultats ont montré que les mutants qui portent des mutations en V4 (I408T) ont eu le plus d'impact sur la susceptibilité au MVC. Finalement, nous avons voulu évaluer l’activité antivirale d’un nouvel inhibiteur de CCR5, VCH-286 avec d’autres inhibiteurs de CCR5 tels que MVC et VVC ainsi que ses interactions avec des médicaments représentatifs de différentes classes d’antirétroviraux ARV employés en clinique pour traiter le HIV/SIDA., afin d’évaluer si ces médicaments pourraient être utilisés dans un même régime thérapeutique. Nous avons tout d’abord évalué indépendamment l’activité antivirale des trois inhibiteurs de CCR5 : VCH-286, MVC et VVC. Par la suite nous avons évalué les interactions de VCH-286 avec MVC et VVC. Finalement nous avons évalué les interactions de VCH-286 avec d’autres médicaments antirétroviraux. Ces études ont montré que VCH-286 est un inhibiteur puissant de CCR5 avec une activité antivirale in vitro de l’ordre du nanomolaire et des interactions médicamenteuses favorables avec la majorité des ARV tels que les inhibiteurs de transcriptase inverse, de protéase, d’intégrase, et de fusion employés en clinique pour traiter le VIH/SIDA et des interactions allant de synergie à l'antagonisme avec les inhibiteurs de CCR5. Nos résultats montrent que la plasticité de l’enveloppe virale du VIH-1 a des répercussions sur la résistance aux inhibiteurs de CCR5, le tropisme et la possible utilisation de ces molécules en combinaison avec d’autres molécules appartenant à la même classe. / The work described in this manuscript aimed to characterize the resistance pathways to CCR5 inhibitors. We first developed a phenotypic assay to identify viral tropism and to measure the resistance to CCR5 inhibitors. This assay detects R5 tropic viruses or X4 when they represent as little as 0.4% in a mixture of viral populations, demonstrating its robustness and sensitivity. Based on its clonal approach, this assay can differentiate the truly dual-tropic viruses from mixed viral populations. We then studied the impact of mutations in the variable regions of gp120 envelope protein of HIV-1 virus on resistance to CCR5 inhibitors. To do this, resistant viruses were generated by passage of CC1/85 and BAL isolates in the presence of sub-inhibitory concentrations of maraviroc (MVC) and vicriviroc (VCV). Following some passages of the CC1/85 virus in the presence of MVC, some mutations were identified in differents regions of the gp120. We further selected three mutations in the variable domains of gp120, V169M in V2, L317W in V3 and I408T in V4 to construct viruses containing single, double and triple mutations to assess the contribution of individual or combined mutations in the resistance phenotype to MVC and VCV. We determined the sensitivity of each mutant to MVC and VCV, the tropism and the percentage of infectivity compared to wild type. Our results showed that the sequences that carry mutations in the V4 domain I408T, had the most impact on susceptibility to MVC. Finally, we aimed to evaluate the antiviral activity of a new CCR5 inhibitor, VCH-286 and its interaction with representative drugs from different classes of antiretroviral (ARVs) such as reverse transcriptase inhibitors, protease inhibitors, integrase inhibitors and fusion inhibitors used in clinic to treat HIV/AIDS and other CCR5 inhibitors such as MVC and VVC to assess whether these drugs could be used together within the same treatment regimen. To answer this question, we first evaluated the antiviral activity of the three CCR5 inhibitors: VCH-286, MVC, and VVC. We then evaluated the interactions of VCH -286 with MVC VVC. We finally evaluated the interactions of VCH -286 with other ARV drugs These studies showed that VCH-286 is a potent inhibitor of R5 viruses with antiviral activity at the nanomolar range and favorable drug interactions with the majority of ARVs such as reverse transcriptase, protease, integrase and fusion inhibitors employed clinically to treat HIV/AIDS. The combinations of CCR5 inhibitors have interactions ranging from synergy to antagonism. Our results show that the plasticity of the viral envelope of HIV-1 affects resistance to CCR5 inhibitors, its tropism and the potential combination of these drugs.

ADP-ribosylation factor-1 (ARF1) est une petite GTPase principalement connue pour son rôle dans la formation de vésicules au niveau de l’appareil de Golgi. Récemment, dans des cellules de cancer du sein, nous avons démontré qu’ARF1 est aussi un médiateur important de la signalisation du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) contrôlant la prolifération, la migration et l'invasion cellulaire. Cependant, le mécanisme par lequel l’EGFR active la GTPase ainsi que le rôle de cette dernière dans la régulation de la fonction du récepteur demeure inconnue. Dans cette thèse, nous avions comme objectifs de définir le mécanisme d'activation de ARF1 dans les cellules de cancer du sein hautement invasif et démontrer que l’activation de cette isoforme de ARF joue un rôle essentiel dans la résistance de ces cellules aux inhibiteurs de l'EGFR. Nos études démontrent que les protéines d’adaptatrices Grb2 et p66Shc jouent un rôle important dans l'activation de ARF1. Alors que Grb2 favorise le recrutement d’ARF1 à l'EGFR ainsi que l'activation de cette petite GTPase, p66Shc inhibe le recrutement du complexe Grb2-ARF1 au récepteur et donc contribue à limiter l’activation d’ARF1. De plus, nous démontrons que ARF1 favorise la résistance aux inhibiteurs des tyrosines kinases dans les cellules de cancer du sein hautement invasif. En effet, une diminution de l’expression de ARF1 a augmenté la sensibilité descellules aux inhibiteurs de l'EGFR. Nous montrons également que de hauts niveaux de ARF1 contribuent à la résistance des cellules à ces médicaments en améliorant la survie et les signaux prolifératifs à travers ERK1/2, Src et AKT, tout en bloquant les voies apoptotiques (p38MAPK et JNK). Enfin, nous mettons en évidence le rôle de la protéine ARF1 dans l’apoptose en réponse aux traitements des inhibiteurs de l’EGFR. Nos résultats indiquent que la dépletion d’ARF1 promeut la mort cellulaire induite par gefitinib, en augmentant l'expression de facteurs pro-apoptotiques (p66shc, Bax), en altérant le potentiel de la membrane mitochondriale et la libération du cytochrome C. Ensemble, nos résultats délimitent un nouveau mécanisme d'activation de ARF1 dans les cellules du cancer du sein hautement invasif et impliquent l’activité d’ARF1 comme un médiateur important de la résistance aux inhibiteurs EGFR. / The small GTPase ADP-ribosylation factor-1 (ARF1) has been well described for its role in regulating transport within the Golgi. Recently, in breast cancer cells, we have characterized ARF1 as important mediator of epidermal growth factor receptor (EGFR) signals leading to cell proliferation, migration and invasion. However, the mechanisms regulating ARF1 activity downstream of the EGFR had yet to be defined. Here, we aim to characterize these mechanisms of ARF1 activation in invasive breast cancer cells and demonstrate that activated ARF1 plays an essential role in mediating the resistance of breast cancer cells to EGFR tyrosine kinase inhibitors. We show that the adaptor proteins Grb2 and p66Shc regulate EGF-dependent ARF1 activation. While Grb2 was shown to be essential in the recruitment of ARF1 to the EGFR as well as the activation of this small GTPase, p66Shc blocked the recruitment of this Grb2-ARF1 complex to the receptor and thus suppressed EGF-induced ARF1 activation. Additionally, we demonstrate that ARF1 promotes EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance in invasive breast cancer cells. Indeed, the depletion of ARF1 was associated with an increased sensitivity to EGFR inhibition. We show that ARF1 promotes resistance by enhancing survival and proliferative signals through Erk1/2, Src and AKT, while blocking the apoptotic p38MAPK and JNK pathways. Furthermore, ARF1 was shown to stabilize EGFR dynamics (Expression, activation, dimerization and down-regulation) in response to treatment with EGFR inhibitors. Finally, we highlight the role of ARF1 in mediating mitochondrial-dependent apoptosis in response to EGFR tyrosine kinase inhibitor treatment. The depletion of ARF1 was shown to promote gefitinib-induced cell death as measured by increase expression of pro-apoptotic factors(p66Shc, Bax), altered mitochondrial membrane potential and cytochrome C release. Together, our results delineate a novel mechanism of ARF1 activation in breast cancer cells and implicate ARF1 activity as an important mediator of EGFR inhibitor resistance further supporting the importance of targeting this GTPase in breast cancer patients.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.