La propagation de bactéries à Gram négatif multirésistantes aux antibiotiques représente un problème de santé publique majeur urgent à résoudre car le risque d’un retour à l’ère pré-antibiotique est réel. Parmi les modes de résistance existant, la production de métallo-B-lactamases (MBLs) responsables de l’inactivation des B-lactamines, la famille d’antibiotiques la plus utilisée, représente un challenge thérapeutique.Les travaux décrits dans ce manuscrit concernent la synthèse, la caractérisation et l’évaluation biologique de composés construits autour d’un cœur 2,4-dihydro-3H-1,2,4-triazole-3-thione substitués en deux positions. En se basant sur des études de criblage in silico et des études cristallographiques ayant permis d’identifier ce noyau comme un bon candidat dans le développement d’inhibiteurs de MBLs, la synthèse de différentes séries d’analogues a été entreprise afin d’identifier de nouveaux inhibiteurs pouvant potentiellement atteindre les tests cliniques.Dans un premier temps, une série de composés 4-amino-1,2,4-triazole-3-thione substitués en position 5 a été préparée en suivant des voies de synthèse classiques. Différentes séries ont ensuite été développées en introduisant une diversité structurale et fonctionnelle en position 4. Ces composés ont ensuite été testés sur des enzymes représentatives des 3 sous-classes de MBLs et les plus intéressants ont été évalués sur bactéries résistantes recombinantes.Afin de réaliser une évaluation rapide des produits synthétisés au sein du laboratoire, une méthode de criblage à moyen débit en plaque 96 puits sur cinq MBLs représentatives a été mise au point et validée grâce à l’appui de nos collaborateurs spécialistes des MBLs. / The spread of multiresistant Gram negative bacteria is a growing threat to public health and the risk of return to the pre-antibiotic era is real. Among existing resistance modes, the production of metallo-B-lactamases (MBLs) responsible of the inactivation of B-lactams, the most used family of antibiotics, represents a therapeutical challenge.This manuscript describes the synthesis, characterization and biological evaluation of compounds built on a 2,4-dihydro-3H-1,2,4-triazole-3-thione scaffold substituted on two positions. Based on previous in silico screening and crystallographic studies, which identified this structure as a good candidate for MBLs inhibition, several series have been developed to found new inhibitors that could potentially be amenable to clinical development.First, 1,2,4-triazole-3-thione compounds substituted at position 5 have been prepared following classical pathways. Then, several series have been developed where the structural and functional diversity was introduced at position 4. Compounds have been tested on representative MBLs of the three sub-classes and the most interesting ones on recombinant resistant bacteria.To perform a rapid screening of compounds in the laboratory, a method of medium throughput screening inhibition tests on five MBLs performed in 96-wells plate has also been developed and validated during this study with the help of our collaborators specialists of MBLs

Le récepteur activateur de NF-κB (RANK), membre de la famille des récepteurs au TNF, est connu pour son rôle dans l’homéostasie de l’os, mais joue aussi un rôle important dans le système immunitaire. J’ai tout d’abord étudié des outils permettant de cibler RANK/RANKL. J’ai caractérisé et comparé l’activité biologique de deux anticorps anti-RANK. J’ai également criblé une librairie de petites molécules pour identifier des inhibiteurs de l’interaction RANK/RANKL. Dans une deuxième partie, je me suis intéressée au rôle du ligand de RANK (RANKL) dans l’homéostasie du ganglion lymphatique. RANKL joue un rôle dans la différenciation des ostéoclastes mais son rôle dans la différenciation d’autres macrophages n’a pas été étudié. Nous avons étudié des souris déficientes pour RANKL dans les cellules marginales réticulaires (MRC) qui expriment RANKL de manière constitutive dans le ganglion adulte. Nous avons observé une diminution de la population de macrophages sous-capsulaires (SSM). Nous avons également montré que les cellules endothéliales lymphatiques (LEC) expriment l’intégrine alpha 2b (ITGA2b) et que cette expression est sensible à la présence de RANKL. / The TNF-family member Receptor Activator of NF-κB (RANK) is known for its role in bone homeostasis and is increasingly recognized as a central player in immune regulation. Firstly I looked for new molecular tools to target RANK/RANKL axis. I characterized and compared the biological activity of two anti-RANK antibodies. Moreover, I screened the Prestwick Chemical Library® of small molecules in order to identify inhibitors of RANK/RANKL interaction. Secondly, I studied the effect of the RANK/RANKL axis in lymph node homeostasis. RANKL is known to promote osteoclast differentiation but whether it also plays a role in the differentiation of other macrophage subsets is not known. We addressed this question by conditionally deleting RANKL from marginal reticular stromal cells (MRCs) that constitutively express RANKL in the lymph node. We observed impaired differentiation of the subcapsular sinus macrophages (SSMs). We also studied lymph node lymphatic endothelial cells (LECs) and showed that integrin alpha 2b (ITGA2b) is expressed by a lymph node subset of LECs and its expression is sensitive to RANKL.

La leucémie myéloïde chronique (LMC) est une transformation maligne d'une cellule souche hématopoïétique, caractérisée par une anomalie génétique acquise : le chromosome Philadelphie (Ph), résultant de la translocation réciproque t(9 ;22)(q34 ;q11), et son équivalent moléculaire, l'oncogène BCR-ABL. La protéine BCR-ABL présente une activité tyrosine kinase constitutive qui agit sur les voies de survie et de prolifération. La progression de la maladie vers la phase accélérée puis blastique s'accompagne d'anomalies génétiques additionnelles marqueurs d'une instabilité génomique croissante. La responsabilité de BCR-ABL dans la genèse de cette instabilité génomique est fortement suspectée. Dérivé de 2-phénylamino-pyrimidines, l'Imatinib inhibe l'activité tyrosine kinase de BCR-ABL ainsi que la prolifération de lignées cellulaires BCR-ABL positives et induit leur apoptose. Les échecs du traitement par l'Imatinib sont dus à des mécanismes de résistance qui ne sont pas tous entièrement caractérisés. Des nouveaux inhibiteurs de tyrosine kinases (ITKs) ou des associations avec l'Imatinib ont été développés afin de la surmonter. Cependant, une résistance croisée et multiple demeure difficile à traiter et nécessite une meilleure compréhension des mécanismes de résistance afin d'éradiquer la maladie dans un avenir proche. Les travaux réalisés au cours de cette thèse ont montré que la présence de microremaniements génétiques (traduisant une instabilité) au sein de progéniteurs leucémiques CD34+ de patients traités par l'Imatinib corrélait avec la perte de réponse à l'Imatinib chez les patients diagnostiqués en phase chronique, suggérant que la résistance à l'Imatinib pourrait être corrélée aux altérations génétiques survenant précocement dans la physiopathologie de la maladie. 113 gènes affectés ont été détectés dont certains sont localisés dans des régions connues pour être hypervariables (CNV) suggérant un rôle de ces régions dans le développement de la LMC ou la résistance à l'Imatinib. Nous avons mis en évidence la présence d'une anomalie acquise récurrente dans telle région localisée en 8p23.1 qui groupe les gènes de la famille de la Défensine B. Ce microremaniement n'est pas lié à la résistance à l'Imatinib car il est retrouvé dans les populations cellulaires CD34+ Ph+ et Ph-, il peut donc être considéré comme un marqueur de l'instabilité d'une sous-population cellulaire clonale de CD34+ présentant une grande prédisposition à acquérir des altérations génétiques additionnelles, comme la fusion BCR-ABL. Nos études montrent que des altérations secondaires pourraient être le support d'une résistance à l'Imatinib. La résistance à l'Imatinib peut alors être liée à la dérégulation des voies de signalisation en amont ou en aval de BCR-ABL, affectant ainsi la prolifération, la survie, la différenciation et l'intégrité du génome. Il semble donc que le traitement par l'Imatinib seul ne soit pas suffisant pour éradiquer la maladie. Pour cette raison, de nouvelles molécules à associer avec l'Imatinib sont actuellement en cours d'évaluation. Parmi ces associations, les inhibiteurs de la voie Ras ont montré une certaine efficacité dans la restauration de l'activité proapoptotique de l'Imatinib. Il était donc intéressant de chercher une cible thérapeutique régulant négativement cette voie afin de surmonter cette résistance. GILZ (Glucocorticoid-Induced Leucine Zipper) inhibe la voie Ras/Raf par une interaction directe. Il inhibe également la voie NFκB dont certains antagonistes sont capables de surmonter la résistance à l'Imatinib. Nos résultats montrent, pour la première fois, que l'expression de GILZ est diminuée dans des lignées humaines ou murines exprimant BCR-ABL sensibles ou résistantes aux ITKs ainsi que dans les cellules dormantes résiduelles isolées d'un modèle cellulaire murin développé au laboratoire. L'expression forcée de GILZ dans ces lignées résistantes restaure la sensibilité à l'Imatinib. Nos résultats montrent que le mécanisme passe par une inhibition de la voie mTORC2/Akt Ser473. Elle est due à une interaction directe de GILZ avec mTORC2 permettant l'activation de FoxO3a et l'induction de l'expression de la protéine proapoptotique Bim. Dans ce système, GILZ augmente l'expression de Bim tandis qu'Imatinib, par ses effets "Off-target", diminue celle de Mcl-1 inversant ainsi le rapport des membres antiapoptotiques/proapoptotiques de la famille Bcl-2 et entrainant l'apoptose. Le traitement séquentiel par les glucocorticoïdes puis l'Imatinib induit l'apoptose de cellules souches de patients résistants par le même mécanisme, suggérant que la modulation de l'expression de GILZ pourrait représenter une nouvelle stratégie thérapeutique pour cibler les cellules leucémiques résistantes ou résiduelles. La régulation de la voie mTORC2/Akt Ser473 semble être d'une importance cruciale dans la survie des cellules BCR-ABL+, ainsi que dans la résistance aux ITKs. Parmi les gènes méthylés dans notre étude, on retrouve un gène impliqué dans la régulation de cette voie et qui code pour la phosphatase PHLPP (PH domain and Leucine rich repeat Protein Phosphatase) dont l'activité est de déphosphoryler la sérine 473 d'Akt favorisant son inactivation. Nos résultats montrent que la réexpression du variant 1 de cette phosphatase (PHLPP1) dans notre modèle murin de résistance restaure la sensibilité à l'Imatinib et que la répression de celui-ci n'est pas exclusivement due à l'activité tyrosine kinase de BCR-ABL, mais aussi à des modifications épigénétiques. Nos études ont permis d'identifier des gènes impliqués dans la résistance des LMC aux ITKs et de proposer de nouveaux traitements pour surmonter cette résistance en inhibant la voie Akt Ser473

Les inhibiteurs de la protéase (PI) du virus de l'immunodéficience humain (VIH) doivent, pour être actifs, pénétrer à l'intérieur des cellules cibles du VIH, comme les lymphocytes et être présents à des concentrations suffisantes au niveau de la protéase virale.<br /> <br />Certaines protéines d'efflux pourraient diminuer les concentrations intracellulaires d'IP. Ce travail étudie la pharmacocinétique intracellulaire des IP et leurs mécanismes de transfert à travers la membrane cellulaire à l'aide de modèles cellulaires.<br /> <br />Les IP pénètrent dans la cellule par diffusion passive et s'accumulent par fixation aux protéines cytosoliques.<br />Nous avons également étudié l'expression de la P-glycoprotéine à l'aide de cellules mononucléées du sang périphérique de patients infectés par le VIH et traités par des multithérapies antivirales à base d'IP.

Les glycosidases sont des enzymes impliquées dans un grand nombre de processus biologiques. Leurs inhibiteurs présentent un potentiel thérapeutique en tant qu'agents antidiabétiques, agents antiviraux ou agents pour traiter des maladies génétiques. Au cours de ce travail, nous nous sommes attachés à développer une voie de synthèse chimioenzymatique permettant d'accéder à des analogues de la valiolamine, puissant inhibiteurs d'alpha-glucosidases. Les aminocyclitols que nous avions pour objectif de préparer diffèrent de la valiolamine par la position du groupement amino et des stéréochimies des hydroxyles. Nous avons synthétisé ces aminocyclitols selon une méthode originale, basée sur un procédé en un seul pot mettant en jeu deux enzymes et trois réactions : une aldolisation catalysée par la fructose-1,6- biphosphate aldolase, une déphosphorylation catalysée par une phytase et une nitroaldolisation intramoléculaire. Ainsi deux liaisons C-C sont formées de façon hautement stéréosélective en une seule étape. Nous avons synthétisé neuf nouveaux aminocyclitols et deux nouveaux zwitterions et dérivé N-alkylé. Quelque aminocyclitols se sont révélés des inhibiteurs sélectifs de la béta-glucosidase d'amandes douces et de la béta-galactosidase d'Aspergillus oryzae.

Trois dérivés d'amino acides sont reconnus d'une manière stéréo sélective par l'albumine du sérum bovin. Cette propriété a été observée dans le cas de la phosphatase alcaline de tissu non spécifique, (TNAP). Des inhibiteurs agissant à trois niveaux distincts sur les processus de minéralisation ont été cherchés: 1) TNAP ; 2) Formation de l'hydroxyapatite (HA); 3) Vésicules maticielles (VMs). Nous avons trouvé que des dérivés de benzothiophènes et de tétramisoles, solubles dans l'eau, sont des inhibiteurs spécifiques de TNAP. Un modèle qui permet de produire du HA, a été développé et a confirmé que les nucléotides sont des inhibiteurs de formation de HA. Nous avons montré que le médicament anti-rhumatisme sinomenine, n'ayant aucun effet sur le TNAP, ainsi que la théophylline ralentissaient tous les deux la formation de HA induits par les VMs. Ces modèles de minéralisation présentent un grand potentiel lors du criblage de médicaments pour le traitement de l'ostéoarthrose

Le cancer médullaire de la thyroïde (CMT), qui représente 5 à 8% des cancers de la thyroïde, estissu de la transformation maligne des cellules C du parenchyme thyroïdien. Ce cancer, sporadiquedans 70 à 80% des cas et familial pour les 20 à 30% restants, est essentiellement lié à desanomalies du proto-oncogène RET, codant un récepteur à activité tyrosine kinase. La fréquenceélevée des mutations activatrices de RET ont permis d'identifier ce récepteur comme une ciblethérapeutique majeure. Si la chirurgie est le traitement de référence pour les formes localisées, lesformes localement avancées ou métastatiques, de pronostic plus péjoratif étaient avant ledéveloppement des thérapies moléculaires ciblées, dans une impasse thérapeutique. La meilleurecompréhension de la biologie des tumeurs a permis le développement de ces thérapies plusrationnelles et plus spécifiques, en particulier des inhibiteurs d'activité tyrosine kinase (ITK).L'optimisation de leur utilisation en clinique nécessite de mieux comprendre leurs mécanismesd'action.Dans ce contexte, les objectifs de cette thèse ont été à la fois cognitifs et cliniques, visant àaméliorer la compréhension de la réponse moléculaire à deux ITKs, le sunitinib et la vandetanib,dans le CMT, et à identifier de nouveaux biomarqueurs de suivi thérapeutique. Dans un premiertemps, nous avons montré les effets antiprolifératifs, antitumoraux et antiangiogéniques dusunitinib et du vandetanib dans un modèle de CMT muté RETC634W, mettant en évidence desprofils d'activité proches entre les deux inhibiteurs. Puis, les principales voies de signalisationmises en jeu lors de la réponse à ces ITKs ont été explorées par Reverse-Phase Protein Array(RPPA). Par une approche transcriptomique haut-débit menée sur des modèles précliniques, lesprincipales fonctions cellulaires impliquées dans la réponse au sunitinib et au vandetanib ont étéidentifiées. Le rôle de gènes participant à l'invasion tissulaire et au pouvoir métastatique a été misen évidence. De nouveaux biomarqueurs potentiels de réponse au vandetanib et au sunitinib, telsque l'IL-8 et le TGF-2 dont les taux sériques sont significativement plus élevés chez les patientsatteints de CMT, ont été identifiés. Enfin, l'intérêt de trois approches méthodologiques dans lesuivi de la réponse antitumorale chez les patients a été évalué. Ainsi, le développement d'uneméthode de dosage du vandetanib par spectrométrie de masse a permis de suggérer un lien entredes taux sériques élevés et l'apparition de toxicités sévères. L'évaluation de biomarqueurs dans lesérum de patients traités par le vandetanib a souligné l'intérêt de l'IL-8 comme marqueurpronostic potentiel dans cette pathologie. Enfin les résultats préliminaires, évaluant la réponse ausunitinib par échographie doppler sur un modèle préclinique de souris xénogreffées, ontconfirmé l'intérêt de l'imagerie fonctionnelle dans ce domaine.

Le cancer de l'endomètre est le cancer gynécologique le plus fréquemment diagnostiqué chez les femmes en Europe, aux USA et au Japon. Les mécanismes de carcinogenèse endométriale sont encore mal appréhendés et les facteurs histopronostiques classiques ne permettent pas toujours de prédire le risque évolutif. Dans ce travail, l'étude de l'expression des métalloprotéases (MMP-2,-7 et -9) et des inhibiteurs tissulaires des métalloprotéases (TIMP-1 et -2) suggère l'implication de ce système enzymatique dans le processus de carcinogenèse endométriale avec un profil d'expression différent dans l'endomètre normal, l'hyperplasie et le cancer de l'endomètre. Nous avons par ailleurs pu montrer que l'analyse de l'expression de MMP-2 (gélatinase A) et de TIMP-2 permettait de définir un sous-groupe de cancer de l'endomètre qui était particulièrement à risque d'extension locale et à distance. Nos résultats ont également permis de confirmer le rôle prépondérant de la perte d'hétérozygotie (LOH) de TP53 dans la genèse des cancers de l'endomètre de type II et la survenue plus tardive de cet évènement dans les cancers de l'endomètre de type I (hormonodépendants). En terme de pronostic, l'analyse du gène TP53 par FISH (hybridation par fluorescence in situ) n'est pas supérieure à celle obtenue par IHC (immunohistochimie). Enfin, l'étude des corrélations histopronostiques réalisée dans ce travail suggère que l'évaluation conjointe de la ploïdie, de MMP-2 et TIMP-2, de p53, du Ki67 et des récepteurs hormonaux (E et P) sur les prélèvements tissulaires pourrait mieux définir une population à haut risque évolutif pouvant bénéficier de thérapeutique ciblée.

Thèse de doctorat : Sciences du vivant. Neurosciences : Strasbourg 1 : 2007. / Thèse soutenue sur un ensemble de travaux. Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 17 p.

Reproduction de : Thèse d'exercice : Médecine : Nancy 1 : 2006. / Titre provenant de l'écran-titre.