A via de Reparo por Excisão de Nucleotídeos (NER) é responsável pelo reparo das lesões causadas pela luz ultravioleta (UV) e de outras lesões capazes de distorcer a dupla hélice, bloqueando a replicação e a transcrição. Os pacientes que apresentam as síndromes recessivas raras Xeroderma Pigmentosum (XP), tricotiodistrofia (TTD) e síndrome de Cockayne (CS) possuem mutações em algum dos 11 genes relacionados ao NER e à transcrição basal. Mutações na proteína XPD levam ao surgimento de diferentes fenótipos: XP, TTD, XP/CS ou COFS (Cerebro-Oculo-Facio-Skeletal Syndrome), uma forma rara de CS. Os pacientes XP apresentam alta incidência de câncer de pele, o que não ocorre com os pacientes TTD e CS, além de poderem apresentar perda neuronal progressiva, enquanto todos os CS e TTD apresentam uma diminuição na mielinização do cérebro. As neuropatologias são provavelmente associadas a problemas no reparo de danos endógenos no DNA das células nervosas. Diversos trabalhos mostraram o envolvimento do NER no reparo desses danos, os quais pensava-se serem reparados apenas por outro mecanismo, o Reparo por Excisão de Base. Neste trabalho mostramos que fibroblastos de pacientes XP-D, XP-D/CS e TTD, portadores de mutações em XPD, são sensíveis ao estresse oxidativo induzido pelo tratamento com azul de metileno fotoativado, apresentando bloqueio prolongado no ciclo celular e permanência da sinalização de danos ao DNA. A complementação das diferentes linhagens com o gene XPD/ERCC2 foi capaz de restaurar a sobrevivência celular. Foram detectadas diferenças importantes na capacidade de reparo/retomada da transcrição após danos gerados por estresse oxidativo em DNA plasmidial, além da ativação de vias diferentes de morte celular: fibroblastos XP-D apresentam maior capacidade de reparo e apresentam morte por apoptose após estresse oxidativo, enquanto os fibroblastos XP-D/CS e TTD apresentam menor capacidade de reparo ativação de mais de uma via de morte celular (apoptose e necrose), diferenças que podem estar ligadas ao fenótipo dos pacientes. Mutações no gene codificante para a DNA polimerase n, POLH, estão associadas à forma variante de XP (XP-V). Pol n é uma polimerase especializada na síntese translesão (TLS) de fotoprodutos, além de estar implicada na TLS de outros tipos de lesões como bases oxidadas, e em vias não relacionadas à TLS como a hipermutação somática e à replicação de regiões de DNA com arquiteturas não-canônicas. Neste trabalho mostramos que os fibroblastos de pacientes XP-V apresentam sensibilidade ao estresse oxidativo. Mostramos uma indução da proteína pol n em fibroblastos primários após danos genotóxicos, associada ao aumento da capacidade de lidar com a parada na forquilha de replicação, possibilitando a continuidade da replicação do DNA e ao aumento da sobrevivência celular. Mostramos uma diferença na estabilidade genômica nos genes das imunoglobulinas dos pacientes XP-V idosos em comparação com os pacientes jovens e controles de idade pareada, mostrando que a ausência dessa polimerase pode estar ligada ao aumento da instabilidade genômica nesses genes / The Nucleotide Excision Repair (NER) pathway is responsible for the repair of UV photoproducts and other bulky lesions that block both replication and transcription. Patients with the rare recessive disorders Xeroderma Pigmentosum (XP), trichothiodystrophy (TTD) and Cockayne Syndrome (CS) carry mutations in one of the 11 NER genes, linked to repair and basal transcription. Mutations in XPD lead to different phenotypes: XP, TTD, XP/CS or COFS (Cerebro-Oculo-Facio-Skeletal Syndrome), a rare form of CS. XP patients have high incidence of skin cancer, which does not occur in TTD or CS patients, although ther may present neurodegeneration, while all CS and TTD patients have neurodevelopmental symptoms linked to dysmielynation. The pathology of these neurological diseases is probably associated with deficient repair of DNA lesions in nervous cells, generated by endogenous processes. Many groups including ours have demonstrated the involvement of NER in the repair of these lesions, previously thought to be exclusively repaired by Base Excision Repair. In this work we show high sensitivity of both primary and transformed XP-D, XP-D/CS and TTD human fibroblasts in response to oxidative stress generated by photoactivated methylene blue, with prolonged cell cycle arrest and DNA damage signaling. The complementation of the three different cell lines with the XPD/ERCC2 gene was able to restore cell survival. We detected important differences in repair capacity/transcription resumption after damage generated by oxidative stress in plasmid DNA, besides the activation of different cell death pathways: XP-D cells have higher repair capacity and die by apoptosis, while XP-D/CS and TTD cells have little repair capacity and activate more than one death pathway (apoptosis and necrosis). We believe these differences can be related to the patients\' phenotypes. Mutations in DNA polymerase n coding gene, POLH, are associated with the variant form of XP (XP-V). Pol n is a translesion synthesis (TLS) polymerase specialized in the TLS past CPD photoproducts, besides other lesions like oxidized bases, and in other processes like somatic hypermutation and DNA replication in structured regions. In this work we show XP-V human fibroblasts are sensitive to oxidative stress. We detected an induction of pol n after genotoxic stress in primary cells, associated with increased ability to deal with the stalled replication fork, and consequently to DNA replication restart and cell survival. In addition, we detected a difference in genomic stability in immunoglobulin genes in aged XP-V patients in comparison to both young patients and age-matched controls, showing the absence of this polymerase may be linked to increased genomic instability in these genes

A variação do número de cópias (CNV) de genes e cromossomos é uma característica comum do genoma plástico de Leishmania major, que pode estar associada à resistência do parasita à quimioterapia das leishmanioses. Em outros eucariotos, alterações na replicação do DNA ou na resposta a danos no DNA (DDR) pode levar à CNV. Nestes organismos, o complexo de checkpoint 9-1-1 (RAD9, RAD1 e HUS1) é essencial para a detecção e a sinalização do estresse de replicação e para o recrutamento de uma apropriada DDR. Já demonstramos que L. major expressa um homólogo 9-1-1 funcional. Aqui, avaliamos a deficiência de subunidades de 9-1-1 na variação do número de cópias em células selecionadas em metotrexato (MTX), um inibidor da enzima diidrofolato redutase timidilato sintetase (DHFR-TS). A seleção em MTX facilita o isolamento de células que carregam amplificações contendo o locus da DHFR-TS. Assim, selecionamos células deficientes de HUS1 ou RAD9 para resistência ao MTX sem e com exposição previa a hidroxiureia (HU), uma droga que causa estresse de replicação por inibição da ribonucleotídeo redutase, e avaliamos o efeito da deficiência destas proteínas na CNV e no tipo de amplificação gerada. Avaliamos também o efeito da deficiência destas proteínas no processo de síntese do DNA medido pela incorporação de IdU e observamos que a deficiência destas proteínas levou a um incremento na síntese do DNA na ausência de estresse de replicação e a perfis opostos de síntese do DNA após a remoção do estresse replicativo. Análises da detecção de simples fita do DNA (ssDNA) e da histona H2A fosforilada (?H2A) como indicadores do processo de estresse de replicação e dano no DNA também foram conduzidas. Em conjunto, nossos resultados indicam que (i) os níveis alterados das proteínas HUS1 e RAD9 afetam o padrão da CNV após a seleção no MTX, assim como a natureza da amplificação; (ii) HUS1 e RAD9 parecem possuir mecanismos distintos para mediar a CNV; (iii) a função destas proteínas na CNV deve envolver o processo de replicação e (iv) HUS1 e RAD9 são requeridas para a manutenção da estabilidade genômica em Leishmania. Estes resultados contribuem para uma melhor compreensão não só da evolução da via de sinalização mediada pelo complexo de checkpoint 9-1-1 nos eucariotos, mas também da bases moleculares da plasticidade genômica e do fenômeno de amplificação gênica em Leishmania. / The copy number variation (CNV) of genes and chromosomes is a common feature of the plastic genome of Leishmania major, which is normally associated with resistance of the parasite to the chemotherapy of leishmaniasis. In other eukaryotes, alteration in DNA replication and DNA damage response (DDR) causes CNV. In these organisms, the RAD9-RAD1-HUS1 (9-1-1) checkpoint complex is essential for detection and signaling of replication stress and recruitment of an appropriate DDR. We have already demonstrated that L. major expresses a functional 9-1-1 homolog. Here we evaluated the effect of 9-1-1 subunit deficiency in CNV of cells selected in methotrexate (MTX), an inhibitor of the dihydrofolate reductase thymidylate synthetase (DHFR-TS) enzyme. Selection in MTX facilitates the isolation of cells that carry amplicons containing the DHFR-TS locus. Thus, we selected HUS1 or RAD9 deficient cells for MTX resistance without and prior exposure to hydroxyurea (HU), a drug that causes replication stress due to inhibition of ribonucleotide reductase, and evaluated not only CNV, but also the nature of the amplification generated. We also evaluated the effect of deficiency of these proteins in the DNA synthesis process measured by IdU incorporation and observed that the deficiency of these proteins led to an increase in DNA synthesis in the absence of replication stress, and to opposite profiles of DNA synthesis after removal of replicative stress. Analyzes of single-stranded DNA (ssDNA) and phosphorylated histone H2A (?H2A) as indicators of replication stress and DNA damage were also conducted in both presence and absence of replicative stress. Taken together, our results indicate that (i) altered levels of HUS1 and RAD9 proteins affect the CNV pattern after selection in MTX, as well as the nature of amplification; (ii) HUS1 and RAD9 possibly have different mechanisms to mediate CNV; (iii) the function of these proteins in CNV seems to involve replication process and (iv) HUS1 and RAD9 are required for the maintenance of genomic stability in Leishmania. These findings contribute to a better understanding not only of the evolution of the signaling pathway mediated by 9-1-1 checkpoint complex in eukaryotes, but also of the molecular basis of the genome plasticity and the gene amplification phenomenon in Leishmania.

A estabilidade genômica é condição essencial à sobrevivência e ao funcionamento dos organismos vivos. No entanto, várias situações podem provocar danos no DNA. Por exemplo, cerca de 104 lesões podem ocorrer no material genético de uma célula de mamífero a cada dia. No intuito de preservar a integridade genômica e contornar os efeitos deletérios destas modificações, uma maquinaria constituída de proteínas especializadas em reconhecer e reparar estes danos foi selecionada ao longo do curso evolutivo. Defeitos em proteínas destas maquinarias causam instabilidade genômica e pode resultar em elevada taxa de mutações e quebras do DNA que resultam em eventos de amplificação gênica, como em células cancerosas. De uma maneira aparentemente contrária ao requerimento de estabilidade genômica como condição primordial para a perpetuação da vida, Leishmania apresenta um genoma notavelmente maleável e explora a amplificação gênica como recurso de sobrevivência. Ainda que a plasticidade genômica em Leishmania seja facilmente demonstrada, nós não conhecemos os mecanismos precisos pelos quais este parasita coordena a ação da maquinaria de detecção de danos no DNA e a consumação dos eventos de amplificação gênica. No intuito de contribuir para a compreensão deste processo, nós identificamos proteínas homólogas do complexo 9-1-1 (Rad9-Hus1-Rad1) em Leishmania major. As proteínas LmHus1 e LmRad9 apresentam marcada divergência estrutural em relação aos seus homólogos em outros eucariotos e nenhuma proteína obviamente homóloga a Rad1 foi identificada neste parasita. Análises filogenéticas indicam que LmHus1 e LmRad9 são relacionadas ao complexos heterotriméricos envolvidos na detecção de danos no DNA. Em acordo com isso, nossos experimentos demonstram que alteração nos níveis destas proteínas interfere na capacidade do parasita em lidar com estresse genotóxico. LmHus1 localiza-se no núcleo, é requerida para o crescimento normal deste parasita e a diminuição de sua expressão compromete mecanismos de controle de ciclo celular e manutenção de telômeros. LmRad9 também localiza-se no núcleo e sua superexpressão causa defeito de crescimento e de resposta ao estresse genotóxico em L. major. Nós observamos que LmHus1 e LmRad9 formam um complexo responsivo ao dano no DNA in vivo, uma forte indicação de que o complexo 9-1-1 tenha sido conservado em L. major. As peculiaridades estruturais destas proteínas sugerem que o complexo 9-1-1 de L. major possua uma arquitetura distinta em comparação aos eucariotos superiores. Em adição a isto, outras proteínas, tais como a LmRpa1, também apresentam uma marcante divergência estrutural. Isso sugere que a via de sinalização de danos no DNA envolvendo o complexo 9-1-1 e Rpa1 de L. major possua mecanismos peculiares de ação. Estas observações podem permitir entender como ocorreu o processo evolutivo da sinalização mediada pelo complexo 9-1-1 nos eucariotos, além de ajudar para o entendimento das bases moleculares de como este parasito conduz os eventos de amplificação gênica. / Genome stability is a essential condition for survival and proper functioning of living organisms. However, a broad range of elements may lead to DNA damage. For instance, about 104 DNA lesions may be inflicted upon any given mammalian cell everyday. In order to maintain the genome integrity and circumvent the deleterious effects of these lesions, a molecular machinery composed of proteins specialized in detecting and repairing DNA damage has been selected in evolution. Defects of the proteins that constitute such machineries may result not only in a high mutation rate, but also in breaks in the DNA structure that can mediate gene amplification as observed in cancer cells. In an apparent opposition to such requirement for stability as an essential condition to life, the protozoan Leishmania presents a highly malleable genome and explores genome amplification as a survival and adaptation tool. Despite of the fact that the Leishmania genome plasticity can be easily demonstrated, the precise mechanisms that coordinate the molecular machineries involved in the detection and signaling of DNA damage, and in the regulation of gene amplification is still largely unknown. In order to contribute to a better understanding of these processes, we identified and studied the Leishmania major proteins that are homologues of those proteins that compose the 9-1-1 complex (Rad9-Hus1-Rad1). The proteins LmHus1 and LmRad9 present a high structural divergence when compared to its homologues from other eukaryotes and no obvious homologue of Rad1 was identified in the parasite genome. Phylogeny analysis indicated that LmHus1 and LmRad9 are closely related to heterotrimeric complexes involved in the detection of DNA damage. In accordance to that, our experiments demonstrated that altered levels of these proteins interfere with the parasite ability to deal with genotoxic stress. Moreover, LmHus1 was localized to the parasite nucleus and is a required protein for normal parasite proliferation. Besides, we showed that decreased levels of LmHus1 compromise cell cycle regulation and the maintenance of telomeres. LmRad9 was also shown to be localized to the cell nucleus and its overexpression led to growth defects and affected the L. major response to genotoxic stress. We also observed that LmHus1 and LmRad9 interact with each other to for a protein complex that is responsive to DNA damage in vivo, which strongly suggested that the 9-1-1 complex was conserved in L. major. The structural peculiarities of these proteins indicate that the possible L. major 9-1-1 complex has a different architecture when compared to the complex found in higher eukaryotes. In addition to that, other proteins, such as LmRpa1, also present a marked structural divergence. Altogether, these findings suggest that the DNA damage signaling pathway involving the 9-1-1 complex and LmRpa1 in L. major, may present a peculiar mode of action. These observations may contribute to a better understanding not only of the evolution of the signaling pathway mediated by the 9-1-1 complex in eukaryotes, but also of the molecular basis of the genome plasticity and the gene amplification phenomenon.

A variação do número de cópias (CNV) de genes e cromossomos é uma característica comum do genoma plástico de Leishmania major, que pode estar associada à resistência do parasita à quimioterapia das leishmanioses. Em outros eucariotos, alterações na replicação do DNA ou na resposta a danos no DNA (DDR) pode levar à CNV. Nestes organismos, o complexo de checkpoint 9-1-1 (RAD9, RAD1 e HUS1) é essencial para a detecção e a sinalização do estresse de replicação e para o recrutamento de uma apropriada DDR. Já demonstramos que L. major expressa um homólogo 9-1-1 funcional. Aqui, avaliamos a deficiência de subunidades de 9-1-1 na variação do número de cópias em células selecionadas em metotrexato (MTX), um inibidor da enzima diidrofolato redutase timidilato sintetase (DHFR-TS). A seleção em MTX facilita o isolamento de células que carregam amplificações contendo o locus da DHFR-TS. Assim, selecionamos células deficientes de HUS1 ou RAD9 para resistência ao MTX sem e com exposição previa a hidroxiureia (HU), uma droga que causa estresse de replicação por inibição da ribonucleotídeo redutase, e avaliamos o efeito da deficiência destas proteínas na CNV e no tipo de amplificação gerada. Avaliamos também o efeito da deficiência destas proteínas no processo de síntese do DNA medido pela incorporação de IdU e observamos que a deficiência destas proteínas levou a um incremento na síntese do DNA na ausência de estresse de replicação e a perfis opostos de síntese do DNA após a remoção do estresse replicativo. Análises da detecção de simples fita do DNA (ssDNA) e da histona H2A fosforilada (?H2A) como indicadores do processo de estresse de replicação e dano no DNA também foram conduzidas. Em conjunto, nossos resultados indicam que (i) os níveis alterados das proteínas HUS1 e RAD9 afetam o padrão da CNV após a seleção no MTX, assim como a natureza da amplificação; (ii) HUS1 e RAD9 parecem possuir mecanismos distintos para mediar a CNV; (iii) a função destas proteínas na CNV deve envolver o processo de replicação e (iv) HUS1 e RAD9 são requeridas para a manutenção da estabilidade genômica em Leishmania. Estes resultados contribuem para uma melhor compreensão não só da evolução da via de sinalização mediada pelo complexo de checkpoint 9-1-1 nos eucariotos, mas também da bases moleculares da plasticidade genômica e do fenômeno de amplificação gênica em Leishmania. / The copy number variation (CNV) of genes and chromosomes is a common feature of the plastic genome of Leishmania major, which is normally associated with resistance of the parasite to the chemotherapy of leishmaniasis. In other eukaryotes, alteration in DNA replication and DNA damage response (DDR) causes CNV. In these organisms, the RAD9-RAD1-HUS1 (9-1-1) checkpoint complex is essential for detection and signaling of replication stress and recruitment of an appropriate DDR. We have already demonstrated that L. major expresses a functional 9-1-1 homolog. Here we evaluated the effect of 9-1-1 subunit deficiency in CNV of cells selected in methotrexate (MTX), an inhibitor of the dihydrofolate reductase thymidylate synthetase (DHFR-TS) enzyme. Selection in MTX facilitates the isolation of cells that carry amplicons containing the DHFR-TS locus. Thus, we selected HUS1 or RAD9 deficient cells for MTX resistance without and prior exposure to hydroxyurea (HU), a drug that causes replication stress due to inhibition of ribonucleotide reductase, and evaluated not only CNV, but also the nature of the amplification generated. We also evaluated the effect of deficiency of these proteins in the DNA synthesis process measured by IdU incorporation and observed that the deficiency of these proteins led to an increase in DNA synthesis in the absence of replication stress, and to opposite profiles of DNA synthesis after removal of replicative stress. Analyzes of single-stranded DNA (ssDNA) and phosphorylated histone H2A (?H2A) as indicators of replication stress and DNA damage were also conducted in both presence and absence of replicative stress. Taken together, our results indicate that (i) altered levels of HUS1 and RAD9 proteins affect the CNV pattern after selection in MTX, as well as the nature of amplification; (ii) HUS1 and RAD9 possibly have different mechanisms to mediate CNV; (iii) the function of these proteins in CNV seems to involve replication process and (iv) HUS1 and RAD9 are required for the maintenance of genomic stability in Leishmania. These findings contribute to a better understanding not only of the evolution of the signaling pathway mediated by 9-1-1 checkpoint complex in eukaryotes, but also of the molecular basis of the genome plasticity and the gene amplification phenomenon in Leishmania.

A estabilidade genômica é condição essencial à sobrevivência e ao funcionamento dos organismos vivos. No entanto, várias situações podem provocar danos no DNA. Por exemplo, cerca de 104 lesões podem ocorrer no material genético de uma célula de mamífero a cada dia. No intuito de preservar a integridade genômica e contornar os efeitos deletérios destas modificações, uma maquinaria constituída de proteínas especializadas em reconhecer e reparar estes danos foi selecionada ao longo do curso evolutivo. Defeitos em proteínas destas maquinarias causam instabilidade genômica e pode resultar em elevada taxa de mutações e quebras do DNA que resultam em eventos de amplificação gênica, como em células cancerosas. De uma maneira aparentemente contrária ao requerimento de estabilidade genômica como condição primordial para a perpetuação da vida, Leishmania apresenta um genoma notavelmente maleável e explora a amplificação gênica como recurso de sobrevivência. Ainda que a plasticidade genômica em Leishmania seja facilmente demonstrada, nós não conhecemos os mecanismos precisos pelos quais este parasita coordena a ação da maquinaria de detecção de danos no DNA e a consumação dos eventos de amplificação gênica. No intuito de contribuir para a compreensão deste processo, nós identificamos proteínas homólogas do complexo 9-1-1 (Rad9-Hus1-Rad1) em Leishmania major. As proteínas LmHus1 e LmRad9 apresentam marcada divergência estrutural em relação aos seus homólogos em outros eucariotos e nenhuma proteína obviamente homóloga a Rad1 foi identificada neste parasita. Análises filogenéticas indicam que LmHus1 e LmRad9 são relacionadas ao complexos heterotriméricos envolvidos na detecção de danos no DNA. Em acordo com isso, nossos experimentos demonstram que alteração nos níveis destas proteínas interfere na capacidade do parasita em lidar com estresse genotóxico. LmHus1 localiza-se no núcleo, é requerida para o crescimento normal deste parasita e a diminuição de sua expressão compromete mecanismos de controle de ciclo celular e manutenção de telômeros. LmRad9 também localiza-se no núcleo e sua superexpressão causa defeito de crescimento e de resposta ao estresse genotóxico em L. major. Nós observamos que LmHus1 e LmRad9 formam um complexo responsivo ao dano no DNA in vivo, uma forte indicação de que o complexo 9-1-1 tenha sido conservado em L. major. As peculiaridades estruturais destas proteínas sugerem que o complexo 9-1-1 de L. major possua uma arquitetura distinta em comparação aos eucariotos superiores. Em adição a isto, outras proteínas, tais como a LmRpa1, também apresentam uma marcante divergência estrutural. Isso sugere que a via de sinalização de danos no DNA envolvendo o complexo 9-1-1 e Rpa1 de L. major possua mecanismos peculiares de ação. Estas observações podem permitir entender como ocorreu o processo evolutivo da sinalização mediada pelo complexo 9-1-1 nos eucariotos, além de ajudar para o entendimento das bases moleculares de como este parasito conduz os eventos de amplificação gênica. / Genome stability is a essential condition for survival and proper functioning of living organisms. However, a broad range of elements may lead to DNA damage. For instance, about 104 DNA lesions may be inflicted upon any given mammalian cell everyday. In order to maintain the genome integrity and circumvent the deleterious effects of these lesions, a molecular machinery composed of proteins specialized in detecting and repairing DNA damage has been selected in evolution. Defects of the proteins that constitute such machineries may result not only in a high mutation rate, but also in breaks in the DNA structure that can mediate gene amplification as observed in cancer cells. In an apparent opposition to such requirement for stability as an essential condition to life, the protozoan Leishmania presents a highly malleable genome and explores genome amplification as a survival and adaptation tool. Despite of the fact that the Leishmania genome plasticity can be easily demonstrated, the precise mechanisms that coordinate the molecular machineries involved in the detection and signaling of DNA damage, and in the regulation of gene amplification is still largely unknown. In order to contribute to a better understanding of these processes, we identified and studied the Leishmania major proteins that are homologues of those proteins that compose the 9-1-1 complex (Rad9-Hus1-Rad1). The proteins LmHus1 and LmRad9 present a high structural divergence when compared to its homologues from other eukaryotes and no obvious homologue of Rad1 was identified in the parasite genome. Phylogeny analysis indicated that LmHus1 and LmRad9 are closely related to heterotrimeric complexes involved in the detection of DNA damage. In accordance to that, our experiments demonstrated that altered levels of these proteins interfere with the parasite ability to deal with genotoxic stress. Moreover, LmHus1 was localized to the parasite nucleus and is a required protein for normal parasite proliferation. Besides, we showed that decreased levels of LmHus1 compromise cell cycle regulation and the maintenance of telomeres. LmRad9 was also shown to be localized to the cell nucleus and its overexpression led to growth defects and affected the L. major response to genotoxic stress. We also observed that LmHus1 and LmRad9 interact with each other to for a protein complex that is responsive to DNA damage in vivo, which strongly suggested that the 9-1-1 complex was conserved in L. major. The structural peculiarities of these proteins indicate that the possible L. major 9-1-1 complex has a different architecture when compared to the complex found in higher eukaryotes. In addition to that, other proteins, such as LmRpa1, also present a marked structural divergence. Altogether, these findings suggest that the DNA damage signaling pathway involving the 9-1-1 complex and LmRpa1 in L. major, may present a peculiar mode of action. These observations may contribute to a better understanding not only of the evolution of the signaling pathway mediated by the 9-1-1 complex in eukaryotes, but also of the molecular basis of the genome plasticity and the gene amplification phenomenon.

A via de Reparo por Excisão de Nucleotídeos (NER) é responsável pelo reparo das lesões causadas pela luz ultravioleta (UV) e de outras lesões capazes de distorcer a dupla hélice, bloqueando a replicação e a transcrição. Os pacientes que apresentam as síndromes recessivas raras Xeroderma Pigmentosum (XP), tricotiodistrofia (TTD) e síndrome de Cockayne (CS) possuem mutações em algum dos 11 genes relacionados ao NER e à transcrição basal. Mutações na proteína XPD levam ao surgimento de diferentes fenótipos: XP, TTD, XP/CS ou COFS (Cerebro-Oculo-Facio-Skeletal Syndrome), uma forma rara de CS. Os pacientes XP apresentam alta incidência de câncer de pele, o que não ocorre com os pacientes TTD e CS, além de poderem apresentar perda neuronal progressiva, enquanto todos os CS e TTD apresentam uma diminuição na mielinização do cérebro. As neuropatologias são provavelmente associadas a problemas no reparo de danos endógenos no DNA das células nervosas. Diversos trabalhos mostraram o envolvimento do NER no reparo desses danos, os quais pensava-se serem reparados apenas por outro mecanismo, o Reparo por Excisão de Base. Neste trabalho mostramos que fibroblastos de pacientes XP-D, XP-D/CS e TTD, portadores de mutações em XPD, são sensíveis ao estresse oxidativo induzido pelo tratamento com azul de metileno fotoativado, apresentando bloqueio prolongado no ciclo celular e permanência da sinalização de danos ao DNA. A complementação das diferentes linhagens com o gene XPD/ERCC2 foi capaz de restaurar a sobrevivência celular. Foram detectadas diferenças importantes na capacidade de reparo/retomada da transcrição após danos gerados por estresse oxidativo em DNA plasmidial, além da ativação de vias diferentes de morte celular: fibroblastos XP-D apresentam maior capacidade de reparo e apresentam morte por apoptose após estresse oxidativo, enquanto os fibroblastos XP-D/CS e TTD apresentam menor capacidade de reparo ativação de mais de uma via de morte celular (apoptose e necrose), diferenças que podem estar ligadas ao fenótipo dos pacientes. Mutações no gene codificante para a DNA polimerase n, POLH, estão associadas à forma variante de XP (XP-V). Pol n é uma polimerase especializada na síntese translesão (TLS) de fotoprodutos, além de estar implicada na TLS de outros tipos de lesões como bases oxidadas, e em vias não relacionadas à TLS como a hipermutação somática e à replicação de regiões de DNA com arquiteturas não-canônicas. Neste trabalho mostramos que os fibroblastos de pacientes XP-V apresentam sensibilidade ao estresse oxidativo. Mostramos uma indução da proteína pol n em fibroblastos primários após danos genotóxicos, associada ao aumento da capacidade de lidar com a parada na forquilha de replicação, possibilitando a continuidade da replicação do DNA e ao aumento da sobrevivência celular. Mostramos uma diferença na estabilidade genômica nos genes das imunoglobulinas dos pacientes XP-V idosos em comparação com os pacientes jovens e controles de idade pareada, mostrando que a ausência dessa polimerase pode estar ligada ao aumento da instabilidade genômica nesses genes / The Nucleotide Excision Repair (NER) pathway is responsible for the repair of UV photoproducts and other bulky lesions that block both replication and transcription. Patients with the rare recessive disorders Xeroderma Pigmentosum (XP), trichothiodystrophy (TTD) and Cockayne Syndrome (CS) carry mutations in one of the 11 NER genes, linked to repair and basal transcription. Mutations in XPD lead to different phenotypes: XP, TTD, XP/CS or COFS (Cerebro-Oculo-Facio-Skeletal Syndrome), a rare form of CS. XP patients have high incidence of skin cancer, which does not occur in TTD or CS patients, although ther may present neurodegeneration, while all CS and TTD patients have neurodevelopmental symptoms linked to dysmielynation. The pathology of these neurological diseases is probably associated with deficient repair of DNA lesions in nervous cells, generated by endogenous processes. Many groups including ours have demonstrated the involvement of NER in the repair of these lesions, previously thought to be exclusively repaired by Base Excision Repair. In this work we show high sensitivity of both primary and transformed XP-D, XP-D/CS and TTD human fibroblasts in response to oxidative stress generated by photoactivated methylene blue, with prolonged cell cycle arrest and DNA damage signaling. The complementation of the three different cell lines with the XPD/ERCC2 gene was able to restore cell survival. We detected important differences in repair capacity/transcription resumption after damage generated by oxidative stress in plasmid DNA, besides the activation of different cell death pathways: XP-D cells have higher repair capacity and die by apoptosis, while XP-D/CS and TTD cells have little repair capacity and activate more than one death pathway (apoptosis and necrosis). We believe these differences can be related to the patients\' phenotypes. Mutations in DNA polymerase n coding gene, POLH, are associated with the variant form of XP (XP-V). Pol n is a translesion synthesis (TLS) polymerase specialized in the TLS past CPD photoproducts, besides other lesions like oxidized bases, and in other processes like somatic hypermutation and DNA replication in structured regions. In this work we show XP-V human fibroblasts are sensitive to oxidative stress. We detected an induction of pol n after genotoxic stress in primary cells, associated with increased ability to deal with the stalled replication fork, and consequently to DNA replication restart and cell survival. In addition, we detected a difference in genomic stability in immunoglobulin genes in aged XP-V patients in comparison to both young patients and age-matched controls, showing the absence of this polymerase may be linked to increased genomic instability in these genes