Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6077.pdf: 10672804 bytes, checksum: 8a7ba5e1820e96664e3cbb7f872f6f3e (MD5) Previous issue date: 2013-10-28 / Financiadora de Estudos e Projetos / Over the recent years, the incidence of human fungal infections has shown a significant increase. Aspergillus fumigatus is a filamentous fungus opportunistic pathogen responsible for many human respiratory diseases, including invasive pulmonary aspergillosis, which is the most serious form of infection . Studies show that A. fumigatus virulence has a multifactorial process associated with its structure, capacity for growth, adaptation to stress conditions, evasion mechanisms of the immune system and ability to cause harm to the host. CWI (via cell wall integrity ) is a signaling cascade activated in yeast cells under conditions of cell wall stress and plays a role in the adaptation of various fungal pathogens in the human host . In many fungi , CWI is triggered by activation of protein kinase C ( PKC ) and that this pathway is associated with the transcription of genes related to maintaining the integrity of the cell wall and its redevelopment. In this work, a mutant Gly579Arg (G579R) was constructed by transformation mediated by inserting a gene replacement cassette comprising a G2044C transversion located in the cysteine-rich domain controller C1B pkcA of A. fumigatus. From the phenotypic analysis of the mutant strain was observed in the involvement of pkcAG579R CWI since the mutant showed high sensitivity to agents such as CR (congo red) and CFW (calcofluor white) . Furthermore, pkcA is also involved in tolerance to oxidative stress caused by paraquat and menadione. Additionally it was found to increase the sensitivity of the mutant pkcAG579R temperature variations as well as the inhibitor of Hsp90 radicicol. Como CWI is related to the transcriptional activation of biosynthetic genes and rugged cell wall (such as glucan synthase, glucanosil chitin synthases and transferases) the abundance of major genes coding for these enzymes was analyzed by RT-PCR in real time. Based on the tests can be α -1 ,3 glucan synthase ( agsA-C ) dependent signaling mediated PkcA for correct expression. Furthermore, genes such as β-1,3 glucan synthase (fksA) glucanosyltransferase (gelA-C) and some chitin synthases (chsB-E-C) appear not to be dependent function and CWI PkcA . These data demonstrated the role of pkcA signaling cascade in the maintenance of cell wall and thermotolerance in A. fumigatus. This work was the first in which a systematic analysis of gene pkcA was conducted in the human opportunistic fungal pathogen A. fumigatus. / Ao longo dos últimos anos, a ocorrência de infecções fúngicas humanas vem apresentando um aumento expressivo. Aspergillus fumigatus é um fungo filamentoso patógeno oportunista responsável por diversas doenças respiratórias humanas, incluindo aspergilose pulmonar invasiva, que é a forma de infecção mais grave. Estudos demonstram que o A. fumigatus possui um processo de virulência multifatorial associado a sua estrutura, capacidade de crescimento, adaptação em condições de estresse, mecânismos de evasão do sistema imune e capacidade de causar danos ao hospedeiro. A CWI (via de integridade da parede celular) é uma cascata de sinalização ativada nas células fúngicas sob condições de estresse de parede celular e desempenha um papel na adaptação de vários fungos patogênicos no hospedeiro humano. Em muitos fungos, CWI é desencadeada através da ativação da proteína quinase C (PKC) sendo que esta via está associada à transcrição de genes relacionados com a manutenção da integridade da parede celular e sua remodelação. Neste trabalho o mutante Gly579Arg (G579R) foi construído através da transformação mediada pela inserção de um cassete de substituição gênica que compreende uma transversão G2044C localizado no domínio regulador rico em cisteína C1B da pkcA de A. fumigatus. A partir da análise fenotípica desse mutante foi possível observar o envolvimento de pkcAG579R na CWI uma vez que a linhagem mutante mostrou alta sensibilidade a agentes como o CR (congo red) e CFW (calcofluor white). Além disso, pkcA está envolvido também na tolerância ao estresse oxidativo causado por menadiona e paraquat. Adicionalmente verificou-se o aumento da sensibilidade da linhagem mutante pkcAG579R à variações de temperatura bem como ao inibidor de Hsp90, radicicol. Como a CWI está relacionada à ativação transcricional de genes de biossíntese e reforço de parede celular (como por exemplo glucanas sintases, quitinas sintases e glucanosil transferases), a abundância dos principais genes que codificam essas enzimas foi analisada através de RTPCR em tempo real. Baseado nos testes pode-se verificar que as α-1,3 glucana sintase (agsA-C) dependem da sinalização mediada por PkcA para sua expressão. Por outro lado, genes como a β-1,3 glucana sintase (fksA), glucanosiltransferases (gelA-C) e algumas quitinas sintases (chsB-C-E) parecem não ser dependente da CWI e da função de PkcA. Esses dados demostraram parte do papel de pkcA na cascata de sinalização da manutenção da parede celular e termotolerância em A. fumigatus. Este trabalho foi o primeiro no qual uma análise sistemática do gene pkcA foi conduzida no fungo patógeno oportunista humano A. fumigatus.

Evidence suggests that root cell walls are a target of low pH stress. Severe low pH stress causes cell death in the root tip. The walls of these cells are highly dynamic. Our hypothesis is that in these cells low pH causes stress in the cell wall due to excessive loosening. Thus, a certain level of turgor pressure should be required to cause cell death. Here, we aimed to investigate the role of the cell wall in low pH stress leading to cell death. We looked for the possible involvement of players such as class III peroxidases and ethylene signaling, which could promote changes in the cell wall and cause differential sensitivity to low pH. Arabidopsis thaliana and mutants in the genetic background of Col-0 were grown in a medium containing agar (0.8%) and half the concentration of Hoagland\'s nutrient medium. Five-day-old seedlings were exposed to low pH in a solution composed of 0.5 mM CaCl2 and 0.6 mM Homopipes buffer. Treatment of roots at pH 4.6 caused death of cells in the transition zone (TZ) and meristematic zone (MZ). However, cell death was negligible when plants were treated at pH 4.6 in an hyperosmotic solution (Ψs = -0.37 MPa), thereby decreasing cell wall tension. Also, an hypoosmotic treatment (HO) caused cell death at pH 5.8 in TZ. Cell death was accelerated when HO was performed in a low pH solution. The mutant of a cell wall integrity sensor protein, wak-1, displayed reduced cell death when exposed to low pH. Also, cell death seems to occur through a programmed cell death mechanism. Thus, low-pH induced cell death appears to be triggered by perception of cell wall stress. We examined published data to search for class III peroxidases possibly involved in cell death due to low pH. The gene for AtPrx62 is induced 8.37-fold in low pH exposed roots. The atprx62 KO mutant was less sensitive to low pH than Col-0 roots. The mRNA of AtPRX62 accumulated in the same zone that cell death occurred due to low pH. This strongly suggests that AtPRX62 is positive regulator of low-pH induced cell death. Also, ethylene pretreatment induced subsequent tolerance of roots to low pH and this was dependent of its receptor ETR1. Together we show that a cell wall stress caused by low pH causes cell death. This death was in part due AtPRX62 activity and was also suppressed by ethylene. / Evidencias recentes sugerem que a parede celular é um alvo direto do estresse por baixo pH em raízes. Estresse severo por baixo pH rapidamente causa a morte de células do ápice radicular, onde a parede é altamente dinâmica. Nossa hipótese é de que nessas células, o baixo pH cause mudanças na parede celular, como afrouxamento excessivo. Assim, a pressão de turgor sobre a parede deve ser necessária para causar danos que levam à morte das células. Neste trabalho, nós investigamos o papel da parede celular no estresse por baixo pH e na consequente morte de células radiculares. Além disso, tambem foi investigado o papel de peroxidases de classe III e sinalização por etileno, que promovem mudanças na parede celular as quais podem gerar sensibilidade diferenciada a baixo pH. Plântulas de Arabidopsis thaliana e mutantes no background de Col-0 foram crescidas em meio contendo ágar (0.8%) e metade da concentração dos nutirentes do meio de Hoagland. Plântulas com 5 dias de idade foram expostas a baixo pH em uma solução composta por 0.5 mM de CaCl2 e 0.6 mM de tampão Homopipes. O tratamento de raízes a pH 4.6 causou morte em células da zona de transição (TZ) e zona meristemática (MZ). Entretanto, a morte celular foi negligível quando as plantas foram tratadas a pH 4.6 simultaneamente com a diminuição da tensão na parede celular, através de solução com potencial de - 0.37 MPa. Além disso, um choque repentino na pressão de tugor por intermédio de tratamento hiposmótico (HO) causou morte celular a pH 5.8 na TZ. A morte celular foi acelerada quando HO foi realizado em uma solução a baixo pH. A morte celular foi reduzida no mutante wak-1 exposto a baixo pH. WAK-1 é um receptor de parede que atua no sistema de monitoramento de integridade da parede celular. A morte das células provavelmente ocorreu por meio de morte celular programada. Juntos, esses dados trazem evidências que a parede celular é crucial para percepção do estresse causado por baixo pH e essa percepção possivelmente está envolvida em repostas que causam a morte celular. Nós examinamos dados publicados procurando por peroxidases classe III possivelmente envolvidas com a morte celular devido baixo pH. O gene codante para AtPRX62 foi induzido 8.37 vezes em raízes expostas a baixo pH. O mutante KO atprx62 foi menos sensível a baixo pH que raízes de Col-0. O mRNA de AtPRX62 acumulou-se na mesma zona de morte celular devido baixo pH em raízes de Col-0. Isso sugere que a atividade de AtPRX62 está relacionada com a morte celular devido baixo pH. Além disso, o pré-tratamento com etileno induziu tolerância de raízes à exposição subsequente a baixo pH. Esta indução foi dependente de sinalização via ETR1. No conjunto, nós mostramos que um estresse causado na parede celular pelo baixo pH causa a morte celular. Essa morte é em parte devido a atividade de AtPRX62 mas pode ser aliviada por etileno.