As metaloproteases AAA/FtsH são componentes chave do controle da qualidade das proteínas inseridas nas membranas de mitocôndrias e cloroplastos. Em Arabidopsis thaliana, as proteases FtsH presentes nas membranas dos tilacóides formam um complexo heterohexamérico composto pelas subunidades FtsH1/FtsH5 (tipo A) e FtsH2/FtsH8 (tipo B). Este complexo está envolvido na reciclagem de proteínas foto-danificadas, especialmente da proteína D1, centro de reação do PSII. Algumas linhas de evidências indicam ainda que existe um limiar de concentração das proteases FtsH, necessário para a correta formação e desenvolvimento dos cloroplastos. Apesar da extensiva caracterização genética e molecular das proteases FtsH, o mecanismo regulatório do complexo FtsH dos cloroplastos não foi totalmente elucidado até o momento, contudo existem evidências de que a sua ativação pode estar relacionada a alta incidência luminosa e a outras condições de estresse. A presença de fatores proteicos auxiliares, foi testada como hipótese alternativa por nosso grupo, através do uso da protease FtsH5 como isca em um ensaio de duplo híbrido de leveduras. Este ensaio identificou uma proteína interagente putativa, nomeada FIP (FtsH5 Interacting Protein), a qual comprovadamente interage com FtsH5 e está localizada nas membranas dos tilacóides. De modo a investigar o papel regulatório putativo de FIP sobre a atividade do complexo FtsH, nós analisamos os padrões de expressão em uma ampla gama de condições de estresse a partir de dados públicos de microarranjos de DNA. Os perfis de expressão indicam que FIP pode ser um regulador negativo da atividade do complexo. Os resultados também sugerem que o complexo pode estar envolvido na resposta do cloroplasto a diferentes tipos de condições de estresse. O estudo da história evolutiva das proteínas interagentes FtsH5 e FIP evidenciou que as sequências homólogas a FIP são encontradas exclusivamente em musgos e plantas superiores, sugerindo assim que a origem de FIP pode estar relacionada a colonização terrestre. Todos os genes codificantes das proteases FtsH do complexo foram usados como \"query\" na busca por sequências homólogas, permitindo a classificação das proteases FtsH nos tipos A e B por inferência filogenética Bayesiana. Análises filogenéticas Bayesianas também foram feitas para FIP e as proteases FtsH tipos A e B, independentemente. A análise Mirrortree suportou a existência de coevolução entre FIP e as proteases FtsH tipo A. Por outro lado, nenhuma correlação foi encontrada entre FIP e as proteases FtsH tipo B, o que corrobora nossas observações experimentais anteriores. Além disso, o agrupamento portador de homólogos FIP pôde ser recuperado em uma filogenia mais completa das proteases FtsH do tipo A. Análises subsequentes mostraram que ambas as proteínas interagentes estão extensivamente sobre seleção negativa e que proteases FtsH tipo A são bastante conservadas, principalmente nos seus domínios internos. / Eukaryotic AAA/FtsH metalloproteases display a key role in the protein quality control of membrane-inserted proteins in mitochondria and chloroplasts. In Arabidopsis thaliana, chloroplast thylakoidal membranes FtsH proteases form a heterohexameric complex made by FtsH1/FtsH5 (type A) and FtsH2/FtsH8 (type B) subunits. This complex is involved in protein turnover of photo-damaged proteins, in particular the D1 protein at the PSII reaction center. Several lines of evidence also indicate that a FtsH threshold level is necessary for the proper formation and development of chloroplasts. Despite extensive genetic and molecular characterization of the FtsH proteases, the regulatory mechanism of the FtsH complex in chloroplasts has not yet been fully elucidated, however, there are evidences that its activation might be related to high light incidence and other stress conditions. The presence of auxiliary protein factors, as an alternative hypothesis, was tested by our group, through the use of the protease FtsH5 as bait in a yeast two-hybrid assay. This essay identified a putative interacting protein named FIP (FtsH5 Interacting Protein), which has been proved to interact with FtsH5 and be located at the thylakoid membranes. In order to investigate a putative regulatory role of FIP on FtsH complex activity, we analyzed gene expression patterns in a wide range of stress conditions from public DNA microarray data. The expression profiles indicate that FIP could be a negative regulator of the FtsH complex activity. The results also suggest that the complex may be involved in the chloroplast response to different types of stress conditions. In order to shed some light on the evolutionary history of FtsH5 and FIP interacting proteins, we have shown that FIP\'s homologous sequences were exclusively found in mosses and higher plants, suggesting that FIP origin might be related to the plant terrestrial colonization. All Arabidopsis FtsH complex-encoding genes were used as \"query\" sequences in search for homologous sequences, allowing us to classify the FtsH proteases in type A and B by Bayesian phylogenetic inference. Bayesian phylogenetic analyses were also run for FIP and FtsH types A and B proteases, independently. Mirrortree analysis supported coevolution between FIP and type A FtsH proteases. On the other hand, no correlation was found between FIP and type B FtsH homologues, which support our previous experimental observations. In addition, the FIP bearing cluster could be recovered in a more complete type A FtsH phylogeny. Subsequent analyzes have shown that both interacting proteins are extensively under negative selection and that type A FtsH are very conserved, mainly in its inner domains.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-05-11T15:54:37Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1901797 bytes, checksum: e289fb49d5428280315e56aaa1136a67 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-11T15:54:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1901797 bytes, checksum: e289fb49d5428280315e56aaa1136a67 (MD5) Previous issue date: 2002-10-08 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A família Geminiviridae é uma família de vírus de planta constituída por vírus compostos por genoma circular de DNA fita simples que utilizam fatores do hospedeiro tanto para sua replicação quanto para a translocação do genoma viral no hospedeiro. Com a finalidade de identificar fatores do tomateiro que interagem com as proteínas virais do geminivírus TGMV (Tomato golden mosaic virus), foi utilizado o sistema duplo híbrido para escrutínio de proteínas positivas quanto à interação. As regiões codificadoras das proteínas MP, NSP e REn foram amplificadas e inseridas, individualmente, no vetor pBDGAL4 Cam, fusionadas ao domínio de ligação ao DNA do gene GAL4. Paralelamente foi construída uma biblioteca de cDNA de tomateiro, propagada em vetor de S. cerevisae derivados de lambda ZAPII. O escrutínio da biblioteca de cDNA assim como os ensaios funcionais de identificação de interação entre proteínas geminivirais foram conduzidos no sistema duplo-híbrido de leveduras. Ao contrário das proteínas MP e NSP, a proteína viral REn apresentou a capacidade de ativar a transcrição quando fusionada ao domínio de ligação ao DNA, o que impossibilitou seu uso como isca em ensaios de interação proteína-proteína por esse sistema. A expressão correta das proteínas de movimento MP e NSP, direcionada pelos vetores do sistema duplo-híbrido, foi comprovada pela capacidade das proteínas recombinantes em interagirem ativando os genes repórteres. A interação entre MP e NSP, identificada no presente trabalho, está coerente com os modelos propostos para movimento de geminivírus no hospedeiro, os quais sugerem a interação entre essas duas proteínas durante o processo de translocação do genoma viral. A proteína NSP foi então utilizada como isca nos ensaios de interação proteína-proteína, utilizando como alvo as proteínas codificadas pela biblioteca de cDNA de tomateiro. Como resultado do escrutínio da biblioteca de cDNA de tomateiro, foram identificados cinco cDNAs que codificam proteínas capazes de interagir com NSP com diferentes intensidades, conforme demonstrado em ensaios quantitativos da atividade do gene repórter β-galactosidase. A análise de seqüência e do padrão de restrição desses clones demonstraram que quatro deles eram idênticos e codificavam um domínio conservado de quinase serina/treonina, sendo denominado NIK (NSP - Interacting Kinase). Evidências indicam que, provavelmente, a interação entre NIK e NSP seja funcional. Análise da estrutura primária de NSP demonstrou a presença de resíduos de serina e treonina em contexto favorável para fosforilação. Além disso, NIK não foi capaz de interagir com outras proteínas virais e com controles, pelo sistema duplo híbrido, confirmando a especificidade da interação NSP-NIK. A análise comparativa da seqüência parcial do cDNA de NIK com seqüências de cDNAs de uma biblioteca de semente de soja mostrou que a proteina NIK possui cerca de 92% de similaridade de seqüência, na região carboxiterminal, com uma proteína quinase de soja. A quinase identificada em soja, denominada GmNIK (Glicine max NIK), contém 623 resíduos de aminoácidos e uma massa molecular estimada em 68586,10 kDa e foi capaz de interagir com NSP por meio do sistema duplo híbrido. GmNIK possui, além do domínio de quinase um domínio de ligação a ATP 309 419 IIHRDVKAANILL 431 , LGKGFGNVYKKGVFPDGTLVAVKK 332 , uma hélice transmembrana, provavelmente responsável pela inserção da proteína na 96 membrana plasmática, e regiões ricas em leucina, LTNQIVLLQNNNISGPIPSELGKLKLTQLDLSNNFFSGGIPPSLGHL 167 como 144 e 192 MTQLNFLDLSYNNLSGPVPRILAKS . Os domínios encontrados em GmNIK são característicos de proteínas codificadas por genes de resistência e de receptores de membrana envolvidos em programas de desenvolvimento. A predição do modelo topológico de GmNIK baseado em sua estrutura modular, similar `aquela da proteína codificada pelo gene de resistência Xa21, sugere a posição intracelular do domínio de quinase e do domínio de ligação a nucleotídeo, enquanto que as regiões ricas em leucina são voltadas para o meio extracelular. A posição intracelular do domínio de quinase está coerente com a hipótese de interação funcional entre GmNIK e NSP, uma vez que NSP localiza- se no meio celular interno. Ensaios adicionais deverão ser conduzidos para confirmar se a proteína viral NSP é fosforilada por NIK in vitro e in vivo. / Geminiviridae is a family of plant viruses comprised by viruses with a circular single stranded DNA genome that utilizes host factors for replication and viral genome translocation. In order to identify factors in tomato plants which interact with viral proteins of the geminivirus TGMV (Tomato golden mosaic virus), the yeast two-hybrid system was used to screen for proteins with a positive interaction. Coding regions of the proteins MP, NSP and REn were amplified and inserted, individually, within the vector pBDGAL4 Cam, and merged to the DNA binding domain of the GAL4 gene. Additionally, a library of tomato cDNA was obtained and propagated in a S. cerevisae vector derived from lambda ZAPII. The cDNA library screening and all functional assays developed to identify the interaction among geminiviral proteins were carried out in the yeast two-hybrid system. Differently from the MP and NSP proteins, the REn viral protein was able to activate the transcription when merged to the DNA binding domain. Therefore, it was impossible to use the REn viral protein as an bait in protein-protein interaction assays by this system. The correct expression of the movement proteins MP and NSP, directed by the two-hybrid vectors, was demonstraded by the interaction capacity of recombinant proteins, activating its reporting genes. The interaction between MP and NSP, identified in the present work, is consistent with the models that describe the geminivirus movement within the host, which suggest the interaction between these two proteins during the viral genome translocation. The NSP protein was utilized as bait in the protein-protein interaction assays, using as target proteins codified by the tomato cDNA library. The screeninf of the library resulted in the identification of five cDNAs that code for proteins capable of interacting with NSP with different intensities, according to the quantitative assays of the reporter gene β-galactosidase. Analyses of the sequence and the restriction patterns of these clones demonstrated that four of them were identical and code for a conserved serine/threonine kinase domain, named NIK (NSP - Interacting Kinase). Evidence indicates that the interaction between NIK and NSP is probably functional. The analysis of the NSP primary structure showed the presence of serine and threonine residues suitable to phosphorylation. Besides, NIK was not able to interact with other viral proteins and with controls using the two-hybrid system, corroborating the specificity of the NSP-NIK interaction. The comparative analysis of the NIK s cDNA partial sequence with cDNAs provided from a soybean library showed that the NIK protein has a sequence similarity of about 92% with a kinase protein from soybean, in the carboxy-terminal region. The kinase identified in soybean, named GmNIK (Glicine max NIK), has 623 amino acid residues, a molecular mass around 68586.10 kDa and showed the ability of interact with NSP using the two-hybrid system. The GmNIK has a kinase domain 309 419 IIHRDVKAANILL 431 , an ATP binding domain LGKGFGNVYKKGVFPDGTLVAVKK 332 , a transmembrane helix, which is probably responsible for the introduction of the protein in the plasmatic 96 membrane, and leucine-rich regions, such as LTNQIVLLQNNNISGPIPSELGKLKLTQLDLSNNFFSGGIPPSLGHL 144 and 167 MTQLNFLDLSYNNLSGPVPRILAKS 192 . Domains found in GmNIK are characteristic of proteins encoded by resistance genes and of membrane receptors involved in developmental programing. The prediction of a topological model of GmNIK based on its modular structure, similar to the protein encoded by the resistance gene Xa21, suggests an intracellular position of the kinase and nucleotide biding domain, while the leucine-rich regions are located in the extracellular environment. The intracellular position of the kinase domain is consistent to the hypothesis of functional interaction between GmNIK and NSP, since NSP is located inside the cell. Additional assays will be carried out in order to confirm whether the NSP viral protein is phosphorylated by NIK in vitro and in vivo. / Tese importada do Alexandria

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-21Bitstream added on 2014-06-13T21:03:46Z : No. of bitstreams: 1 000741895.pdf: 15459081 bytes, checksum: d63bdd273032427c5d062ded87237abe (MD5) / Atualmente os sistemas biológicos vem sendo abordados por diversas áreas de pesquisas, dentre elas a biologia de sistemas. Essa área tem centrado esforços para descrever e compreender as relações entre os componentes bióticos e abióticos desses sistemas, utilizando para isso a teoria de grafos. Uma forma de estudar esses sistemas, é avaliar as interações entre proteínas, que são as interações biomoleculares mais abundantes nas células. Nesse contexto, a presente tese focou no desenvolvimento de um algoritmo computacional capaz de predizer interações entre proteínas de qualquer espécie ou conjunto protéico. Para isso, foram utilizadas técnicas de aprendizado de máquina (sub-área da inteligência artificial) para a construção e aplicação desse preditor, o qual mostrou-se eficaz em predizer interações entre proteínas de mais de 80 espécies diferentes, incluindo interações entre proteínas de parasita e hospedeiro. Esse novo preditor foi aplicado no proteoma de zebrafish (Danio rerio) e humanos (Homo sapiens), gerando assim redes de interações proteicas para ambas as espécies. As interações obtidas foram avaliadas em um contexto geral e o foco das análises foi direcionado para a sub-rede relacionada com as vias de determinação e diferenciação sexual em vertebrados. Os resultados demonstraram uma relativa baixa conservação desses grafos ao longo da evolução dos vertebrados, tanto do ponto de vista global quanto da sub-rede relacionada com a determinação e diferenciação sexual em vertebrados. Além disso, foi possível observar ao menos um hub conservado entre as duas sub-redes, o qual representa um novo alvo a ser avaliado por pesquisas experimentais. Contudo, os dados demonstram que o preditor gerado possui um grande potencial para diversas áreas de estudos e é bastante útil para predição de interações em larga-escala. Além disso, os aspectos evolutivos aqui... / Nowadays the biological systems have been analyzed under several research foci, including the system biology. This area focus to describe and understand the relationship between biotic and abiotic factors using the graph theory. The protein interactions are target interactions to the system biology because they are the most abundant biomolecular interactions within a cell. Thus, this thesis reported the development of a computational algorithm to predict proteinprotein interactions for all species or protein sets. The machine learning technique (sub-area of artificial intelligence) were used to develop and apply this method, giving effective results to predict protein-protein interaction for more than 80 different species, including parasitehost associations. This new predictor was applied to the proteome set of zebrafish (Danio rerio) and humans (Homo sapiens), generating the protein-protein interactions for both species. Evolutionary aspects of the protein interactions were studied in a broad context and the focus was directed to the sub-network involved in the vertebrate sex determination and differentiation. The results reported a low conservation of those graphs across the evolution in a general view or for the sub-network related to the vertebrate sex determination and differentiation. Moreover, it was reported at least one conserved hub between both subnetworks, to be further evaluated by experimental procedures. Anyway, the data showed that the predictor here reported may be very useful for several research areas and it is desirable for large-scale prediction procedures. Furthermore, the evolutionary aspects discussed in this thesis open new perspectives concerning system biology and evolutionary pathways of vertebrate sex determination and differentiation

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-05-23Bitstream added on 2014-11-10T11:57:42Z : No. of bitstreams: 1 000790896.pdf: 1624782 bytes, checksum: 86f691c9d97bad42fa2588df159f183a (MD5) / O Vírus da Febre amarela (YFV) causa doença com considerável morbidade e mortalidade nas regiões tropicais. Diversos vírus possuem estratégias para a alteração dos processos celulares. Mecanismos de splicing celulares são essenciais para diversificar a expressão dos genes e podem aumentar seu potencial de gerar proteínas. A replicação de YFV e as interações entre proteínas virais e celulares não são totalmente conhecidas. A proteína celular hSlu7 possui sinal de localização nuclear e tem um papel importante nas reações catalíticas do segundo passo do splicing. Estudos demonstram que sob infecção de YFV hSlu7 transloca para o citoplasma. A translocação de proteínas entre o citoplasma e o núcleo pode representar um mecanismo viral da regulação da expressão gênica. Este estudo teve como objetivo a caracterização da interação entre a proteína hSlu7 e NS5 viral, bem como estudar os efeitos de interações sobre os mecanismos de splicing alternativo após a infecção de YFV. Para identificar interação de NS5 de YFV com hSlu7 foi realizado ensaio de co-imunoprecipitação. Para verificar alteração de splicing celular foram utilizados replicons pEGFP-ADAR, pI12-IL7R, pEFGP-FGFR2, bem como a alteração de isoformas de XBP-1 endógenos. Os resultados indicam que NS5 de YFV interage com proteína hSlu7 e que sua interação pode influenciar no metabolismo RNA celular. YFV demonstrou exercer modulação no splicing celular, a avaliação de replicons sugerem que em splicing dependente de hSlu7, bem como a independente ocorre uma regulação viral atuando sobre sítios de splicing fraco e que a interação hSlu7-NS5 pode alterar direta e indiretamente a regulação trans-acting / Yellow fever virus (YFV) causes disease with significant morbidity and mortality in tropical regions. Several viral strategies are avail for recruitment and alteration of the biochemical cellular processes. Cellular splicing mechanisms are essential to diversify the gene expression and increase it’s proteomic potential. Replication of YFV and the interactions between viral and cellular proteins are unknown. The cellular protein hSlu7 has an nuclear localization and an important role in the second catalytic reaction step of the alternative splicing. In our study group demonstrated that under YFV infection hSlu7 translocates to the cytoplasm. The translocation of proteins between nucleus and cytoplasm may represent a viral mechanism of cellular gene expression regulation, interference in the protein availability of the alternative splicing and viral replication control. This study aimed to characterize the interaction between the viral protein hSlu7 and NS5, as well as studying the effects of interactions on the mechanisms of alternative splicing after YFV infection. To identify interaction with YFV NS5 hSlu7 was conducted co-immunoprecipitation assay. To verify changes in cellular splicing replicons were used pEGFP-ADAR, PI12-IL7R, pEFGP-FGFR2 as well as the change of isoforms of XBP-1 endogenous.The results indicated that YFV NS5 protein interacts with hSlu7 and that their interaction may influence cellular metabolism RNA. YFV perform modulation on cellular splicing, the evaluation of replicons suggest that in hSlu7 splicing dependent and independent regulation occurs viral acting on weak splice sites and that the interaction hSlu7-NS5 can change directly or indirectly to regulate trans- acting

Orientador: Maurício Lacerda Nogueira / Banca: Carlos Eduardo Calzavara Silva / Banca: Fátima Pereira de Souza / Resumo: O Vírus da Febre amarela (YFV) causa doença com considerável morbidade e mortalidade nas regiões tropicais. Diversos vírus possuem estratégias para a alteração dos processos celulares. Mecanismos de splicing celulares são essenciais para diversificar a expressão dos genes e podem aumentar seu potencial de gerar proteínas. A replicação de YFV e as interações entre proteínas virais e celulares não são totalmente conhecidas. A proteína celular hSlu7 possui sinal de localização nuclear e tem um papel importante nas reações catalíticas do segundo passo do splicing. Estudos demonstram que sob infecção de YFV hSlu7 transloca para o citoplasma. A translocação de proteínas entre o citoplasma e o núcleo pode representar um mecanismo viral da regulação da expressão gênica. Este estudo teve como objetivo a caracterização da interação entre a proteína hSlu7 e NS5 viral, bem como estudar os efeitos de interações sobre os mecanismos de splicing alternativo após a infecção de YFV. Para identificar interação de NS5 de YFV com hSlu7 foi realizado ensaio de co-imunoprecipitação. Para verificar alteração de splicing celular foram utilizados replicons pEGFP-ADAR, pI12-IL7R, pEFGP-FGFR2, bem como a alteração de isoformas de XBP-1 endógenos. Os resultados indicam que NS5 de YFV interage com proteína hSlu7 e que sua interação pode influenciar no metabolismo RNA celular. YFV demonstrou exercer modulação no splicing celular, a avaliação de replicons sugerem que em splicing dependente de hSlu7, bem como a independente ocorre uma regulação viral atuando sobre sítios de splicing fraco e que a interação hSlu7-NS5 pode alterar direta e indiretamente a regulação trans-acting / Abstract: Yellow fever virus (YFV) causes disease with significant morbidity and mortality in tropical regions. Several viral strategies are avail for recruitment and alteration of the biochemical cellular processes. Cellular splicing mechanisms are essential to diversify the gene expression and increase it's proteomic potential. Replication of YFV and the interactions between viral and cellular proteins are unknown. The cellular protein hSlu7 has an nuclear localization and an important role in the second catalytic reaction step of the alternative splicing. In our study group demonstrated that under YFV infection hSlu7 translocates to the cytoplasm. The translocation of proteins between nucleus and cytoplasm may represent a viral mechanism of cellular gene expression regulation, interference in the protein availability of the alternative splicing and viral replication control. This study aimed to characterize the interaction between the viral protein hSlu7 and NS5, as well as studying the effects of interactions on the mechanisms of alternative splicing after YFV infection. To identify interaction with YFV NS5 hSlu7 was conducted co-immunoprecipitation assay. To verify changes in cellular splicing replicons were used pEGFP-ADAR, PI12-IL7R, pEFGP-FGFR2 as well as the change of isoforms of XBP-1 endogenous.The results indicated that YFV NS5 protein interacts with hSlu7 and that their interaction may influence cellular metabolism RNA. YFV perform modulation on cellular splicing, the evaluation of replicons suggest that in hSlu7 splicing dependent and independent regulation occurs viral acting on weak splice sites and that the interaction hSlu7-NS5 can change directly or indirectly to regulate trans- acting / Mestre

O estudo de processos de tradução do código genético em proteínas desperta o interesse pelo seu papel central no metabolismo celular, em particular, o estudo da via de síntese de novos aminoácidos, como a selenocisteína e a pirrolisina, que resultam na expansão do código genético dos 20 aminoácidos canônicos para um total de 22 aminoácidos. A selenocisteína (Sec, U) é um aminoácido que representa a principal forma biológica do elemento selênio e sua incorporação ocorre através de um processo cotraducional em selenoproteínas como resposta ao códon UGA em fase, usualmente interpretado como códon de parada. Essa incorporação requer uma complexa maquinaria molecular distinta entre os três domínios da vida em que as selenoproteínas estão presentes: Bactéria, Arquéia e Eucária. Em Escherichia coli, a via se inicia com a aminoacilação do tRNA específico para a incorporação de selenocisteínas (SelC, tRNASec) com um resíduo de L-serina pela seril-tRNA sintetase (SerRS) formando o tRNA carregado Ser-tRNA[Ser]Sec que é entregue ao complexo homodecamérico selenocisteína sintase (SelA) responsável pela conversão Ser-Sec utilizando a forma biológica de selênio entregue pela enzima selenofosfato sintetase (SelD). Uma vez carregado com L-selenocisteína, o Sec-tRNASec é então carreado pelo fator de elongação específico para selenocisteínas (SelB) para a sua incorporação na cadeia polipeptídica nascente na posição UGA adjunta ao elemento SECIS (SElenoCysteine Insertion Sequence), uma estrutura em grampo presente no RNA mensageiro que indica o códon de inserção de selenocisteínas. Uma vez que elementos contendo selênio são tóxicos para o ambiente celular, interações entre as enzimas da via se fazem necessárias, onde as enzimas participantes em procariotos são conhecidas e caracterizadas individualmente, no entanto, suas interações macromoleculares nas diferentes etapas ainda não foram caracterizadas. Este projeto visa à caracterização macromolecular e estrutural das interações entre as enzimas SelA e SelB com os RNAs participantes tRNASec e SECIS além do ribossomo de E. coli. Para isso, amostras de SelA, SelB, tRNASec, SECIS e ribossomo foram obtidas através de diferentes metodologias. Para SelA e tRNASec foram utilizados protocolos já estabelecidos enquanto que, para SelB, fez-se necessário a otimização do protocolo previamente publicado e, consequentemente, nova caracterização biofísica através de metodologias como dicroísmo dircular (CD) e fluorescência intrínseca (IFS). Para análise das interações, medidas de espectroscopia de anisotropia de fluorescência (FAS), ultracentrifugação analítica (AUC) e calorimetria de varredura diferencial (DSC) foram utilizadas para determinação dos parâmetros de interação dos diferentes complexos estudados. Somado a isso, experimentos de cinética GTPásica foram realizados na formação dos complexos e, além disso, foram gerados modelos estruturais utilizando diferentes metodologias como espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) além de estudos por microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Os estudos propostos irão auxiliar no entendimento do mecanismo de incorporação deste aminoácido em bactérias bem como nos demais domínios da vida além de elucidar o mecanismo sequencial de eventos, provendo conhecimento e desenvolvendo metodologias para sistemas complexos de interação proteína-proteína e proteína-RNA. / The study of genetic code processes in proteins is a central role in cell metabolism, in particular the study of the synthesis pathway of new amino acids, such as selenocysteine and pyrrolisine, which resulted in the expansion of the genetic code of the 20 canonical amino acids for 22 amino acids. Selenocysteine (Sec, U) is an amino acid that represents a major biological form of selenium element and its incorporation through a co-translational process in selenoproteins in response to the in-phase UGA-codon, usually interpreted as stop-codon. This incorporation requires a complex molecular machinery distinct between the three domains of life in which, as selenoprotein has present: Bacteria, Archaea and Eukaria. In Escherichia coli, an initiation pathway with an aminoacylation of the tRNA specific for the incorporation of selenocysteines (SelC, tRNASec) with an L-serine residue by seril-tRNA synthetase (SerRS) resulting in the charged tRNA Ser-tRNA[Ser] Sec that is delivered to the homodecameric complex selenocysteine synthase (SelA), responsible for Ser-Sec conversion using the biological form of selenium delivered by the enzyme selenophosphate synthetase (SelD). Once loaded with L-selenocysteine, Sec-tRNASec is then carried by the selenocysteine-specific elongation factor (SelB) for incorporation into the nascent polypeptide chain at the UGA position attached to the SECIS (SElenoCysteine Insertion Sequence) element, staple structure that indicates the insertion codon of selenocysteines. Since elements containing selenium are toxic to the cell, interactions between how pathway enzymes are made, where the enzymes participating in concepts are known and characterized individually, however, their macromolecular interactions in the different steps have not yet been characterized. This project aims at the macromolecular and structural characterization of the interactions between SelA and SelB enzymes with the RNAS tRNASec and SECIS participants in addition to the E. coli ribosome. For this, as samples of SelA, SelB, tRNASec, SECIS and ribosome were obtained through different methodologies. For SelA and tRNASec, protocols were used to determine parameters for SelB, it was necessary to optimize a previously published protocol and, consequently, a new biophysical characterization through methodologies such as circular dichroism (CD) and intrinsic fluorescence spectroscopy (IFS). To analyze the interactions, measurements of fluorescence anisotropy spectroscopy (FAS), analytical ultracentrifugation (AUC) and differential scanning calorimetry (DSC) were used to determine the interaction parameters of different complexes studied. In addition, GTPases activity experiments were carried out in the formation of the complexesand, in addition, we have generated models that characterize different methodologies such as small angles X-ray scattering (SAXS) and transmission electron microscopy (TEM). The proposed studies will aid in understanding the mechanism of incorporation of this amino acid into bacteria as well as the other domains of life besides elucidating the sequential mechanism of events, providing knowledge and development of methodologies for complex protein-protein and RNA-protein interaction systems.

A existência de uma maior variedade de aminoácidos codificados pelo código genético tem estimado estudos sobre os mecanismos de síntese, reconhecimento e incorporação desses resíduos nas cadeias polipeptídicas nascentes. Um exemplo é a via de incorporação de selenocisteína evento cotraducional dirigido pelo códon UGA. Em bactérias, essa via conta com uma complexa maquinaria molecular composta por: Selenocisteína Sintase (SelA), Fator de Elongação Específico de Reconhecimento (SelB), Selenofosfato Sintetase (SelD), tRNA específico (SelC ou tRNAsec), sequência específica no mRNA (Sequência de Inserção de Selenocisteínas - SECIS) e Aminoacil tRNA Sintetase (aaRS). Pelo fato do selênio ter uma toxicidade elevada em ambientes celulares, é fundamental a compreensão do mecanismo catalítico e razão estequiométrica na formação dos complexos da via na etapa de incorporação junto ao tRNAsec, bem como sua caracterização estrutural foram os objetivos deste trabalho. A proteína SelA foi expressa e purificada para utilização em análises envolvendo microscopia de força atômica, microscopia eletrônica de transmissão com contraste negativo e em gelo vítreo foram realizadas nos complexos SelA e SelA-tRNAsec, visando obter um modelo estrutural e a razão estequiométrica dos complexos. A fim de compreender o mecanismo de passagem do selênio, ensaios de anisotropia de fluorescência e de microcalorimetria, corroborados pelas análises de troca de hidrogênio-deutério acoplado a espectrometria de massa e espectroscopia de infravermelho, elucidaram a formação e estequiometria do complexo ternário SelAtRNA sec-SelD. Tentativas de cristalização e análises cristalográficas também foram realizadas, no entanto, sem sucesso. Com os resultados obtidos foi possível propor que o reconhecimento de SelD e, consequentemente, a entrega do selenofosfato, seja uma etapa crucial da via de incorporação de selenocisteínas. / The existence of a greate variety of amino acids encoded by the genetic code has stimulated the study of the mechanisms of synthesis, recognition and incorporation of these residues in the nascent polypeptide chains. An example of genetic code expansion is the selenocysteine incorporation pathway an event cotraducional by the UGA codon. In bacteria, this pathway has a complex molecular machinery comprised: Selenocysteine Synthase (SelA), Specific Elongation Factor (SelB), Selenophosphate Synthetase (SelD), tRNA-specific (SelC or tRNAsec), Specific mRNA Sequence (SElenocysteine Insertion Sequence - SECIS) and Aminoacyl tRNA Synthetase (aaRS). Because selenium has high toxicity in cellular environments; it is essential for cell survival the association of this compound with proteins, in this case, selenoprotens and the associated proteins involved in the selenocysteine synthesis. Therfore the understanding of the catalytic mechanism, stoichiometric ratio, protein complex formation with the tRNAsec, and its structural characterization were the objectives of this work. The SelA protein was expressed and purified to used in analyzes involving atomic force microscopy, transmission electron microscopy with negative stain and in vitreous ice were performed in the complex SelA and SelA-tRNAsec in order to obtain a structural model of the complex and the stoichiometric ratio of its components. To study the selenium association with protein of the synthesis pathway, fluorescence anisotropy assays and isothermal titration calorimetry corroborated by the analysis hydrogen-deuterium exchange coupled to mass spectrometry and infrared spectroscopy were employed.Crystallization attempts were made and preliminary crystallographic analyzes were also performed, however, so far unsuccessfuly. The results obtained were possible to develop the hypothesis about the SelD recognition and, consenquently, the selenophosphate delivery, a crucial stage of the selenocysteine incorporation pathway.

As septinas compõem o quarto componente do citoesqueleto das células eucarióticas, atrás da actina, miosina e filamentos intermediários. São proteínas filamentosas que se arranjam em forma de fibras e anéis, desempenhando um papel estrutural na célula. Os seres humanos expressam 13 septinas, que são divididas em 4 grupos diferentes de acordo com sua estrutura primária: grupo I (SEPT3, SEPT9, SEPT12); grupo II (SEPT6, SEPT8, SEPT10, SEPT11, SEPT14); grupo III (SEPT1, SEPT2, SEPT4, SEPT5) e grupo IV (SEPT7), sendo que SEPT13 foi caracterizada como um pseudogene de SEPT7. O filamento fisiológico mais bem estudado é composto por SEPT2-SEPT6-SEPT7-SEPT9 (nesta exata sequência), e é usado como a base para a descrição da formação canônica, onde se acredita que septinas do mesmo grupo ocupam o mesmo lugar no filamento. Entretanto, ensaios de duplo-híbrido identificaram muitas interações não canônicas inesperadas entre septinas como SEPT9-SEPT6 e SEPT9-SEPT8, sugerindo estes também possam existir in vivo. Além destes, estudos mostraram a existência de interações entre septinas do grupo I e grupo II, e especialmente no caso SEPT11-SEPT12, a interação deixa de existir ao inserir uma mutação sítio-dirigida na interface G destas proteínas. O presente trabalho investiga a interação entre SEPT3, uma septina do grupo I, com todas aquelas do grupo II. Esta interação foi estudada por análises de coexpressão e copurificação em resina de afinidade ao cobalto, onde apenas a SEPT3 possuía uma extensão de seis histidinas em seu N-terminal. Esta primeira análise mostrou que SEPT3 não foi copurificada com todos os membros do grupo II dando uma clara evidência de variação de afinidade dentro do grupo. Usando esta abordagem, SEPT6, SEPT10 e SEPT14 não mostraram interação com SEPT3, enquanto SEPT8 e SEPT11 copurificaram com SEPT3, mas não em concentrações estequiométricas. Para os complexos SEPT3-SEPT8 e SEPT3-SEPT11, uma segunda etapa de purificação foi realizada por meio de cromatografia de exclusão molecular, onde um pico de grande variância em relação à média indicou um valor de massa molecular entre monômeros e dímeros. Os mesmos, quando avaliados por espalhamento de luz a múltiplos ângulos mostraram variação na massa molecular ao longo do pico de eluição conforme ele era eluído. Tal variação era compatível com a eluição de dímeros no início até monômeros no final. Os estudos da interação entre SEPT3-SEPT8 por ultracentrifugação analítica indicou uma tendência de associação em altas concentrações das proteínas, compatível com a constante de dissociação determinada por termoforese em microescala, na ordem de dezenas de micromolar. Tais resultados levantaram questões acerca da relevância fisiológica destes complexos e reforçam a importância de um estudo mais aprofundado na formação dos complexos não canônicos de septinas para o desenvolvimento celular. / The septins are accepted to be the fourth cytoskeleton component of the eukaryotic cells, after actin, myosin and intermediate filaments. They are filament forming proteins that are organized in fibers and rings, having a structural role in the cell. Humans express 13 septins, which are divided into 4 different groups according to their primary structure: group I (SEPT3, SEPT9, SEPT12); group II (SEPT6, SEPT8, SEPT10, SEPT11, SEPT14); group III (SEPT1, SEPT2, SEPT4, SEPT5) e group IV (SEPT7). SEPT13 was later characterized as a SEPT7 pseudogene. The best characterized filament is built up from SEPT2-SEPT6-SEPT7-SEPT9 (in this exact sequence), and is used as a basis for the description of the so-called canonical arrangement, which accepts that septins from the same group can occupy the same position within the filament. However yeast two-hybrid assays identified several unexpected interactions such as SEPT9-SEPT6 and SEPT9-SEPT8, raising the possibility that these could also exist in vivo. Furthermore, studies have shown the existence of interactions between group I and group II, and especially in the SEPT11-SEPT12, the interaction dissolves when a mutation in the G interface is inserted. The present work investigates the interaction between SEPT3, a group I septin, with all of those from group II. This interaction was studied through co-expression and co-purification methods using metal affinity chromatography, where only the SEPT3 contained the six histidines extention. This initial analysis showed that SEPT3 did not co-purify with all group II members, clearly pointing to variability in the affinity within group. Using this approach SEPT6, SEPT10 e SEPT14 showed no interaction with SEPT3, whilst SEPT8 and SEPT11 co-purified with SEPT3, but not in stoichiometric concentrations. For the SEPT3-SEPT8 and SEPT3-SEPT11 complexes, a second purification stage was performed using size exclusion chromatography, where a broad peak was observed corresponding to a molecular mass value which was intermediate between a dimer and a monomer. The same complexes, when evaluated by multiple angle light scattering revealed a variation in the molecular mass across the peak as it eluted. Such variation was compatible with elution of dimers at the beginning and monomers at the end. Studies for the SEPT3-SEPT8 interaction via analytical ultracentrifugation suggested a trend to associate in high protein concentration, consistent with the dissociation constant found by microscale thermophoresis, which was of the order of ten micromolar. The results raise questions concerning the physiological relevance of these complexes and reinforce the importance of further studies on the non-canonical assembly of septin complexes for cellular development.

As metaloproteases AAA/FtsH são componentes chave do controle da qualidade das proteínas inseridas nas membranas de mitocôndrias e cloroplastos. Em Arabidopsis thaliana, as proteases FtsH presentes nas membranas dos tilacóides formam um complexo heterohexamérico composto pelas subunidades FtsH1/FtsH5 (tipo A) e FtsH2/FtsH8 (tipo B). Este complexo está envolvido na reciclagem de proteínas foto-danificadas, especialmente da proteína D1, centro de reação do PSII. Algumas linhas de evidências indicam ainda que existe um limiar de concentração das proteases FtsH, necessário para a correta formação e desenvolvimento dos cloroplastos. Apesar da extensiva caracterização genética e molecular das proteases FtsH, o mecanismo regulatório do complexo FtsH dos cloroplastos não foi totalmente elucidado até o momento, contudo existem evidências de que a sua ativação pode estar relacionada a alta incidência luminosa e a outras condições de estresse. A presença de fatores proteicos auxiliares, foi testada como hipótese alternativa por nosso grupo, através do uso da protease FtsH5 como isca em um ensaio de duplo híbrido de leveduras. Este ensaio identificou uma proteína interagente putativa, nomeada FIP (FtsH5 Interacting Protein), a qual comprovadamente interage com FtsH5 e está localizada nas membranas dos tilacóides. De modo a investigar o papel regulatório putativo de FIP sobre a atividade do complexo FtsH, nós analisamos os padrões de expressão em uma ampla gama de condições de estresse a partir de dados públicos de microarranjos de DNA. Os perfis de expressão indicam que FIP pode ser um regulador negativo da atividade do complexo. Os resultados também sugerem que o complexo pode estar envolvido na resposta do cloroplasto a diferentes tipos de condições de estresse. O estudo da história evolutiva das proteínas interagentes FtsH5 e FIP evidenciou que as sequências homólogas a FIP são encontradas exclusivamente em musgos e plantas superiores, sugerindo assim que a origem de FIP pode estar relacionada a colonização terrestre. Todos os genes codificantes das proteases FtsH do complexo foram usados como \"query\" na busca por sequências homólogas, permitindo a classificação das proteases FtsH nos tipos A e B por inferência filogenética Bayesiana. Análises filogenéticas Bayesianas também foram feitas para FIP e as proteases FtsH tipos A e B, independentemente. A análise Mirrortree suportou a existência de coevolução entre FIP e as proteases FtsH tipo A. Por outro lado, nenhuma correlação foi encontrada entre FIP e as proteases FtsH tipo B, o que corrobora nossas observações experimentais anteriores. Além disso, o agrupamento portador de homólogos FIP pôde ser recuperado em uma filogenia mais completa das proteases FtsH do tipo A. Análises subsequentes mostraram que ambas as proteínas interagentes estão extensivamente sobre seleção negativa e que proteases FtsH tipo A são bastante conservadas, principalmente nos seus domínios internos. / Eukaryotic AAA/FtsH metalloproteases display a key role in the protein quality control of membrane-inserted proteins in mitochondria and chloroplasts. In Arabidopsis thaliana, chloroplast thylakoidal membranes FtsH proteases form a heterohexameric complex made by FtsH1/FtsH5 (type A) and FtsH2/FtsH8 (type B) subunits. This complex is involved in protein turnover of photo-damaged proteins, in particular the D1 protein at the PSII reaction center. Several lines of evidence also indicate that a FtsH threshold level is necessary for the proper formation and development of chloroplasts. Despite extensive genetic and molecular characterization of the FtsH proteases, the regulatory mechanism of the FtsH complex in chloroplasts has not yet been fully elucidated, however, there are evidences that its activation might be related to high light incidence and other stress conditions. The presence of auxiliary protein factors, as an alternative hypothesis, was tested by our group, through the use of the protease FtsH5 as bait in a yeast two-hybrid assay. This essay identified a putative interacting protein named FIP (FtsH5 Interacting Protein), which has been proved to interact with FtsH5 and be located at the thylakoid membranes. In order to investigate a putative regulatory role of FIP on FtsH complex activity, we analyzed gene expression patterns in a wide range of stress conditions from public DNA microarray data. The expression profiles indicate that FIP could be a negative regulator of the FtsH complex activity. The results also suggest that the complex may be involved in the chloroplast response to different types of stress conditions. In order to shed some light on the evolutionary history of FtsH5 and FIP interacting proteins, we have shown that FIP\'s homologous sequences were exclusively found in mosses and higher plants, suggesting that FIP origin might be related to the plant terrestrial colonization. All Arabidopsis FtsH complex-encoding genes were used as \"query\" sequences in search for homologous sequences, allowing us to classify the FtsH proteases in type A and B by Bayesian phylogenetic inference. Bayesian phylogenetic analyses were also run for FIP and FtsH types A and B proteases, independently. Mirrortree analysis supported coevolution between FIP and type A FtsH proteases. On the other hand, no correlation was found between FIP and type B FtsH homologues, which support our previous experimental observations. In addition, the FIP bearing cluster could be recovered in a more complete type A FtsH phylogeny. Subsequent analyzes have shown that both interacting proteins are extensively under negative selection and that type A FtsH are very conserved, mainly in its inner domains.

Orientador: Orientador : Kleber Gomes Franchini / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T12:58:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cardoso_AlissonCampos_D.pdf: 4487510 bytes, checksum: eec48cf16c52d89f7324a6a56476ca59 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Durante os primeiros dias do desenvolvimento pós-natal, os miócitos cardíacos perdem a capacidade de proliferação, sendo o crescimento adicional do coração decorrente de hipertrofia e não hiperplasia dos miócitos cardíacos. No entanto, em situações de estresse os miócitos cardíacos diferenciados podem apresentar desdiferenciação e reestabelecimento do ciclo celular. Os mecanismos envolvidos nesse fenômeno são ainda pouco compreendidos. No presente estudo, demonstramos que a ativação do fator de transcrição MEF2C (Myocyte Enhancer Factor 2-C) tem papel crítico no processo de desdiferenciação de miócitos cardíacos. Essa conclusão foi obtida por meio de experimentos de ganho de função pela superexpressão de MEF2C em miócitos ventriculares de ratos neonatos em cultura (MVRNs). Demonstramos que a superexpressão de MEF2C em MVRNs induziu a desdiferenciação e a ativação de mecanismos envolvidos na progressão do ciclo celular. Esses resultados foram obtidos por meio de experimentos de microarranjo de DNA, PCR em tempo real, western blotting e análise do fenótipo celular por microscopias de luz, confocal e eletrônica de transmissão. Esses fenômenos foram atenuados pela superexpressão da quinase de adesão focal (FAK), uma proteína que reconhecidamente exerce efeitos pró-hipertróficos em miócitos cardíacos adultos. Experimentos in vivo e in vitro demonstraram a interação direta entre o fator de transcrição MEF2C e a FAK. Estudos com base em ensaios de reação cruzada associada à espectrometria de massas, dinâmica molecular, espalhamento de raios-X a baixos ângulos e mutação sítio dirigida, demonstraram que as hélices 1 e 4 do domínio FAT da FAK interagem diretamente com a domínio de ligação ao DNA do dímero de MEF2C. Estudos de afinidade e de gel shift demonstraram que a porção FAT da FAK desloca a interação MEF2C/DNA in vitro. Ensaios de gene repórter demonstraram que a FAK, mediada pela região C-terminal, diminui a atividade transcricional de MEF2C em células C2C12. O conjunto de dados demonstra que a ativação do fator de transcrição MEF2C em MVRNs induz a desdiferenciação e ativação de mecanismos de progressão do ciclo celular e que a FAK impede esses efeitos através da interação inibitória no domínio de ligação de MEF2C ao DNA / Abstract: During the first days of postnatal development, cardiac myocytes lose their ability to proliferate, and the further growth of the heart is due to hypertrophy and not hyperplasia of cardiac myocytes. However, in response to stress, cardiac myocytes may have dedifferentiation and re-establishment of the cell cycle. The mechanisms involved in this phenomenon are still poorly understood. In the present study, we demonstrated that activation of the transcription factor MEF2C (myocyte enhancer factor 2-C) plays a critical role in the process of dedifferentiation of cardiac myocytes. This conclusion was obtained by gain-of-function experiments through overexpressing MEF2C in neonatal rat ventricular myocytes in culture (NRVMs). We also showed that overexpression of MEF2C in NRVMs induced the dedifferentiation and activation of mechanisms involved on cell cycle progression. These results were obtained by DNA microarray experiments, real time PCR, western blotting and cell phenotype analysis by light microscopy, confocal and electronic transmission. These effects were attenuated by overexpression of focal adhesion kinase (FAK) protein known to exert pro-hypertrophic effects on adult cardiac myocytes. In vivo and in vitro experiments demonstrated the direct interaction between the transcription factor MEF2C and FAK. A model based on crosslinking technology coupled with mass spectrometry, small angle X-ray scattering and the site directed mutation analyses indicated that alpha-helices 1 and 4 of FAK FAT domain interacts directly with the DNA binding domain of MEF2C dimer. Affinity studies and gel shift assay demonstrated that the FAK FAT domain displaces the MEF2C/DNA interaction in vitro. Reporter gene assays demonstrated that FAK, mediated by the C-terminal region, decreases the transcriptional activity of MEF2C in C2C12 cells. The data set shows that the activation of the transcription factor MEF2C in MVRNs induces dedifferentiation and activation of cell cycle progression and that FAK prevents these effects by inhibitory interaction with DNA binding domain of MEF2C / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Ciências