Die Nierentransplantation ermöglicht Patienten die Wiederherstellung der Nierenfunktion. Aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit an Organen nimmt dabei die Zahl der Transplantationen von einem lebenden Spender stetig zu. Zudem ermöglichen die präzisen und genauen Vorbereitungen und Abläufe bei Lebendnierenspenden eine bessere 5-Jahres-Überlebensrate als bei Kadaverspenden. Die genetische Verschiedenheit zwischen Spender und Empfänger bedingt jedoch eine lebenslange immunsuppressive Therapie, um Abstoßungsreaktionen und damit das Scheitern einer Organtransplantation zu verhindern. An den Universitätskliniken Leipzig und Halle/Saale besteht diese Therapie aus einer Dreifachkombination von Tacrolimus, Mycophenolat-Mofetil und Prednisolon, wobei mögliche Nebenwirkungen wie opportunistische Infektionen, kardiovaskuläre und metabolische Erkrankungen sowie Tumore in Kauf genommen werden. Zudem besteht für den immunsupprimmierten Organismus die ständige Gefahr einer Abstoßungsreaktion. Diese Aspekte führen bei den Empfängern zu einer massiven Einschränkung der Gesundheit und Lebensqualität. Inwieweit die ausgeprägte Immunsuppression notwendig ist, bleibt unklar und muss individuell festgelegt werden. Bisher existiert kein geeignetes Verfahren für ein Immunmonitoring, weshalb in vielen Fällen eine umfangreiche und überdosierte Immunsuppression in Kauf genommen wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein geeignetes Testverfahren, der Elispot-Assay, für die Expression der beiden proinflammatorischen Zytokine IFN-γ und IL-17 erstellt. Dafür wurden die PBMC der Spender und Empfänger aus Vollblut separiert, um sie anschließend sowohl separat als auch in einer Lymphozytenmischreaktion zu untersuchen. Die Darstellung von IL-17 konnte nur aufgrund einer zusätzlichen Stimulation mit OKT3 gelingen, während der IFN-γ-Elispot sowohl im Leerwert als auch unter Stimulation mit IL-2 zu ausreichenden Spotanzahlen führte. Die Spotanzahlen der Spender-PBMC wurden mit Hilfe von γ-Strahlung signifikant reduziert (IFN-γ: p=0,047 | IFN-γ + IL-2: p=0,007 | IL-17: p = 0,001), um in den Lymphozytenmischreaktionen die alleinige Zytokinausschüttung der Empfänger-PBMC messen zu können. Die Spender- PBMC fungierten dabei nur als Antigene. Insgesamt konnten zwischen 2009 und 2012 zwölf von siebzehn Patientenpaaren in die Studie eingeschlossen werden. Die Spotanzahlen der Paare wurden dabei sowohl im IFN-γ- als auch im IL-17-Elispot-Assay zu vier unterschiedlichen Zeitpunkten gemessen (vor Transplantation | 21±3 d postoperativ | 28±3 d postoperativ | 75±15 d postoperativ). In den meisten Fällen zeigte sich vor Transplantation eine erhöhte Spotanzahl im Vergleich zu den drei postoperativen Werten. Zudem stiegen die Spotanzahlen sowohl für IFN-γ als auch für IL-17 nach niedrigen Messergebnissen kurz nach der Transplantation im postoperativen Verlauf wieder an und erreichten in einigen Fällen die Spotanzahl der präoperativen Ausgangswerte. Ein signifikanter Unterschied konnte aufgrund der geringen Fallzahl nicht erreicht werden. Die kurzfristige Reduktion der Spotanzahlen postoperativ ist dabei aller Wahrscheinlichkeit nach auf die hohen Dosen an immunsuppressiven Medikamenten zurückzuführen. Insgesamt zeigten die Verläufe der IFN-γ- und der IL-17- Elispot-Assays ähnliche Verläufe. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass der IL-17-Elispot- Assay in Bezug auf mögliche Abstoßungsreaktionen eine ähnliche Aussagekraft besitzen könnte wie der bereits vielfach untersuchte IFN-γ-Elispot-Assay. Weiterhin wurden die Messergebnisse mit der Serumkreatininmolarität verglichen. Diese zeigte präoperativ höhere Molaritäten als postoperativ, wobei die postoperativen Molaritäten im Verlauf, im Gegensatz zu den Elispot-Messungen, abnahmen, was das Einsetzen der Nierenfunktion widerspiegelt. Unter den zwölf Patientenpaaren gab es keine einzige nachgewiesene akute Abstoßungsreaktion, der Verlauf der Serumkreatininmolaritäten war bei allen zwölf Empfängern vergleichbar. Demzufolge konnten die Werte der Elispot-Assays nicht herangezogen werden, um an ihnen eine Abstoßungsreaktion der transplantierten Nieren erkennen zu können. Das präoperative Abschätzen einer möglichen Abstoßungsreaktion anhand der Elispot-Assays konnte aufgrund fehlender Abstoßungsreaktionen ebenfalls nicht untersucht werden. Zusätzlich wurde bei den Patienten eine HLA-Typisierung vorgenommen, wobei der Bereich von optimalen bis maximal ungünstigen Konstellationen reichten (HLA-Mismatch: 0-0-0 bis 2-2-2). Auch hier konnten die Ergebnisse nicht mit möglichen Abstoßungsreaktionen verglichen werden. In der vorliegenden Arbeit wurden zahlreiche Varianten untersucht, die das Abschätzen einer Immunreaktion nach Nierentransplantation (Immunmonitoring) ermöglichen könnten. Aufgrund fehlender Abstoßungsreaktionen bei den Empfängern konnte das Testverfahren nicht an den klinischen Verläufen validiert werden. Mit dem in dieser Arbeit entwickelten Messverfahren kann jedoch eine neue und größer angelegte Studie erfolgen, die in Zukunft ein Immunmonitoring bei Patienten nach Nierentransplantation ermöglicht.:I Inhaltsverzeichnis................................................................I II Bibliographische Beschreibung....................................................................IV III Abkürzungsverzeichnis...................................................................................V 1 Einleitung...........................................................................................................01 1.1 Die T-Zell-vermittelte Immunität..................................................................01 1.1.1 Die verschiedenen Klassen der T-Lymphozyten................................ 01 1.1.2 Interferon-gamma als proinflammatorisches Zytokin......................... 04 1.1.3 Interleukin-17............................................................................................. 04 1.2 Die Nierentransplantation........................................................................... 05 1.2.1 Einführung.................................................................................................. 05 1.2.2 Besonderheiten der Lebendnierenspenden........................................ 06 1.3 Therapeutika bei Lebendnierenspenden................................................. 07 1.3.1 Calcineurininhibitoren............................................................................... 07 1.3.2 Prednisolon.................................................................................................. 08 1.3.3 Mycophenolat-Mofetil................................................................................. 09 1.4 Komplikationen bei Transplantationen....................................................... 10 1.4.1 Opportunistische Infektionen..................................................................... 10 1.4.2 Kardiovaskuläre und metabolische Erkrankungen................................ 11 1.4.3 Maligne Tumore.............................................................................................11 1.5 Transplantatrejektion........................................................................................ 12 1.5.1 Akute Abstoßungsreaktion............................................................................12 1.5.2 Chronische Transplantatnephropathie......................................................13 1.6 Zielsetzung der Arbeit.......................................................................................15 I2 Materialien und Methoden................................................................................. 16 2.1 Studiendesign.................................................................................................... 16 2.2 Materialien.......................................................................................................... 17 2.3 Methoden............................................................................................................ 19 2.3.1 Blutentnahmen................................................................................................ 19 2.3.2 Lymphozytenseparation.................................................................................19 2.3.3 Bestimmung der Zellzahl............................................................................... 20 2.3.4 Kryokonservierung der Zellen...................................................................... 20 2.3.5 Auftauen von kryokonservierten Zellen...................................................... 20 2.3.6 Bestrahlung von Zellen...................................................................................21 2.3.7 Stimulanzien.................................................................................................... 21 2.3.8 Durchflusszytometrie...................................................................................... 22 2.3.9 Elispot-Assay.................................................................................................... 23 3 Ergebnisse............................................................................................................... 29 3.1 Charakteristika der Patienten............................................................................ 29 3.2 Medikamentöse Therapieschemata nach Nierentransplantationen.......... 32 3.3 Versuche zur Etablierung des Elispot-Verfahrens......................................... 33 3.3.1 Vorversuche zum Nachweis von IFN-γ........................................................ 34 3.3.2 Vorversuche zum Nachweis von IL-17........................................................ 36 3.3.3 Versuche mit FKS-freiem Medium.................................................................37 3.3.4 Vitalitätsmessung in der Durchflusszytometrie.......................................... 38 3.4 Vergleich von Buffy Coats mit Patientenproben im Elispot-Assay..............38 3.5 Elispot-Assays der Spender-Empfänger-Paare............................................ 39 3.5.1 Ergebnisse der Elispot-Assays zum Nachweis von IFN-γ........................40 3.5.2 Ergebnisse der Elispot-Assays zum Nachweis von IL-17....................... 45 II3.6 Elispot-Ergebnisse unter Berücksichtigung der HLA-Kompatibilität........49 4 Diskussion............................................................................................................... 50 4.1 Bewertung der Methoden.................................................................................. 51 4.1.1 Patientenauswahl und -akquirierung........................................................... 51 4.1.2 Durchflusszytometrie....................................................................................... 51 4.1.3 Elispot-Assay..................................................................................................... 52 4.2 Vitalitätsmessung................................................................................................. 53 4.3 Elispot-Ergebnisse............................................................................................... 53 4.3.1 Vergleich der unbestrahlten und bestrahlten Elispot-Assays................... 53 4.3.2 Elispot-Assays der Patienten.......................................................................... 54 4.3.2.1 IFN-γ-Elispot-Assay........................................................................................ 54 4.3.2.2 IL-17-Elispot-Assay.........................................................................................56 4.3.2.3 IFN-γ-Elispot-Assay und IL-17-Elispot-Assay im Vergleich.................... 57 4.4 HLA-Merkmale und Serumkreatininmolarität...................................................58 4.5 Schlussfolgerung und Ausblick...........................................................................59 5 Zusammenfassung...................................................................................................62 6 Abstract...................................................................................................................... 65 7 Literaturverzeichnis................................................................................................. 67 8 Tabellenverzeichnis.................................................................................................83 9 Abbildungsverzeichnis........................................................................................... 84 10 Erklärung über die eigenständige Verfassung der Arbeit............................. 85 11 Lebenslauf..............................................................................................................86 12 Danksagung.......................................................................................................... 87 / Introduction Since the first kidney transplantation in the 1950ies, kidney transplantation is still being challenged by graft dysfunction and complete graft failure. Permanent immunsuppressive treatment is mandatory to avoid an unfavourable outcome. The treatment with Prednisolone, Tacrolimus and Mycophenolat-Mofetil may cause toxic side effects resulting in Diabetes mellitus, hypertension, infections and cancer. In the present study we tried to demonstrate that the amount of spots in the Enzyme linked immunospot assay (Elispot-Assay) of IFN-γ and IL-17 correlates with the probability of graft dysfuction and complete graft failure. We also compared the results to clinical parameters. Methods Between the years 2009 and 2012, twelve pairs of related living kidney transplantations were included in this study. From each pair blood samples were taken at four time points (before transplantation, and at 21±3, 28±3 and 75±15 days after kidney transplantation, respectively). After establishing the technique of IFN-γ- and IL-17-Elispot-Assays, we separated the periphale blood mononuclear cells (PBMC) and performed follow up examinations at the four time points mentioned above. The PBMC of each donor and each recipient were examined separatly, and in addition together in a lymphocyte mixed reaction. We stimulated the PBMC of the IFN-γ-Elispot with Interleukin-2 (IL-2) and the PBMC of the IL-17-Elispot with OKT3 to get significant characteristics. PBMC of the donors were irradiated with 30 Gy before mixing them with the PBMC of the recipients. We also took the HLA-matches and serum creatinine molarity to compare important clinical parameters with the results of the Elispot-Assays. Results Sufficient spots were measured using the unstimulated and stimulated IFN-γ-Elispot and the stimulated IL-17-Elispot. Radiation was significant at all three tests (IFN-γ: p=0,047 | IFN-γ + IL-2: p=0,007 | IL-17: p = 0,001). All twelve recipients showed a high number of spots before transplantation in both types of Elispot-Assays and most of them an increasing number of spots after a minimal turning point three weeks after transplantation. Due to the small number of cases, no significant results could be obtained at follow up. Non recipient developed a graft rejection as proven by biopsy or graft failure. The molarity of serum creatinine was permanently reduced whereas it was high before transplantation. Because of the abscence of any rejection episodes, HLA matches could not be compared. Discussion Due to the absence of rejection episodes or graft failure, no prediction for rejection by the IFN-γ- and IL-17-Elispot was possible. The low number of cases of living related kidney transplantation demonstrated the challange of the investigation of living related kidney transplantation. Although we could prove a significant effect of the irradiation of PBMC, there was no significant result in the follow up investigations. A higher number of cases are needed in future investigations. The established method of the IFN-γ- and IL-17-Elispot can be used in a future study with an extended number of cases and a longer follow up of time.:I Inhaltsverzeichnis................................................................I II Bibliographische Beschreibung....................................................................IV III Abkürzungsverzeichnis...................................................................................V 1 Einleitung...........................................................................................................01 1.1 Die T-Zell-vermittelte Immunität..................................................................01 1.1.1 Die verschiedenen Klassen der T-Lymphozyten................................ 01 1.1.2 Interferon-gamma als proinflammatorisches Zytokin......................... 04 1.1.3 Interleukin-17............................................................................................. 04 1.2 Die Nierentransplantation........................................................................... 05 1.2.1 Einführung.................................................................................................. 05 1.2.2 Besonderheiten der Lebendnierenspenden........................................ 06 1.3 Therapeutika bei Lebendnierenspenden................................................. 07 1.3.1 Calcineurininhibitoren............................................................................... 07 1.3.2 Prednisolon.................................................................................................. 08 1.3.3 Mycophenolat-Mofetil................................................................................. 09 1.4 Komplikationen bei Transplantationen....................................................... 10 1.4.1 Opportunistische Infektionen..................................................................... 10 1.4.2 Kardiovaskuläre und metabolische Erkrankungen................................ 11 1.4.3 Maligne Tumore.............................................................................................11 1.5 Transplantatrejektion........................................................................................ 12 1.5.1 Akute Abstoßungsreaktion............................................................................12 1.5.2 Chronische Transplantatnephropathie......................................................13 1.6 Zielsetzung der Arbeit.......................................................................................15 I2 Materialien und Methoden................................................................................. 16 2.1 Studiendesign.................................................................................................... 16 2.2 Materialien.......................................................................................................... 17 2.3 Methoden............................................................................................................ 19 2.3.1 Blutentnahmen................................................................................................ 19 2.3.2 Lymphozytenseparation.................................................................................19 2.3.3 Bestimmung der Zellzahl............................................................................... 20 2.3.4 Kryokonservierung der Zellen...................................................................... 20 2.3.5 Auftauen von kryokonservierten Zellen...................................................... 20 2.3.6 Bestrahlung von Zellen...................................................................................21 2.3.7 Stimulanzien.................................................................................................... 21 2.3.8 Durchflusszytometrie...................................................................................... 22 2.3.9 Elispot-Assay.................................................................................................... 23 3 Ergebnisse............................................................................................................... 29 3.1 Charakteristika der Patienten............................................................................ 29 3.2 Medikamentöse Therapieschemata nach Nierentransplantationen.......... 32 3.3 Versuche zur Etablierung des Elispot-Verfahrens......................................... 33 3.3.1 Vorversuche zum Nachweis von IFN-γ........................................................ 34 3.3.2 Vorversuche zum Nachweis von IL-17........................................................ 36 3.3.3 Versuche mit FKS-freiem Medium.................................................................37 3.3.4 Vitalitätsmessung in der Durchflusszytometrie.......................................... 38 3.4 Vergleich von Buffy Coats mit Patientenproben im Elispot-Assay..............38 3.5 Elispot-Assays der Spender-Empfänger-Paare............................................ 39 3.5.1 Ergebnisse der Elispot-Assays zum Nachweis von IFN-γ........................40 3.5.2 Ergebnisse der Elispot-Assays zum Nachweis von IL-17....................... 45 II3.6 Elispot-Ergebnisse unter Berücksichtigung der HLA-Kompatibilität........49 4 Diskussion............................................................................................................... 50 4.1 Bewertung der Methoden.................................................................................. 51 4.1.1 Patientenauswahl und -akquirierung........................................................... 51 4.1.2 Durchflusszytometrie....................................................................................... 51 4.1.3 Elispot-Assay..................................................................................................... 52 4.2 Vitalitätsmessung................................................................................................. 53 4.3 Elispot-Ergebnisse............................................................................................... 53 4.3.1 Vergleich der unbestrahlten und bestrahlten Elispot-Assays................... 53 4.3.2 Elispot-Assays der Patienten.......................................................................... 54 4.3.2.1 IFN-γ-Elispot-Assay........................................................................................ 54 4.3.2.2 IL-17-Elispot-Assay.........................................................................................56 4.3.2.3 IFN-γ-Elispot-Assay und IL-17-Elispot-Assay im Vergleich.................... 57 4.4 HLA-Merkmale und Serumkreatininmolarität...................................................58 4.5 Schlussfolgerung und Ausblick...........................................................................59 5 Zusammenfassung...................................................................................................62 6 Abstract...................................................................................................................... 65 7 Literaturverzeichnis................................................................................................. 67 8 Tabellenverzeichnis.................................................................................................83 9 Abbildungsverzeichnis........................................................................................... 84 10 Erklärung über die eigenständige Verfassung der Arbeit............................. 85 11 Lebenslauf..............................................................................................................86 12 Danksagung.......................................................................................................... 87

<p>Cytokines are soluble signalling mediators within the immune system, and have been shown to be of importance in the development of type 1 diabetes (T1D). This thesis studied the production of cytokines in experimental models of T1D and during transplantation of insulin-producing islets of Langerhans. </p><p>We have demonstrated that the transcriptional TNFα-inhibitor MDL 201,449A, previously shown to reduce immune-mediated diabetes induced in mice by multiple low doses of streptozotocin, was not TNFα-specific, but also inhibited IFNγ and IL-10 in spleen cells. Furthermore, when the inhibitor was removed from in vitro cultures, a rebound phenomenon of increased cytokine secretion occurred.</p><p>The thesis also investigated whether plastic adhesion, a method generally employed to deplete macrophages, influenced cytokine production in spleen cells. We observed that plastic adhesion increased TNFα, IFNγ and IL-10 release, and decreased IL-4 secretion. Plastic adhesion depleted only ~30% of the macrophages, but as much as ~60% of the regulatory T cells. </p><p>Thirdly, we found that “control” treatments for islet transplantations, i.e. syngeneic and sham transplantations, exerted a clear effect on cytokine production from spleen cells, possibly due to a decrease in regulatory T cells that may be caused by the surgery and/or anaesthesia. Moreover, spleen cells from mice exposed to surgery exhibited a decreased proliferative capacity to concanavalin A stimulation. We also perceived a marked difference in cytokine response depending on the mouse strain used in the experiments.</p><p>Finally, we aimed to elucidate if, besides autoimmune activities, also high glucose- and free fatty acid concentrations as seen in diabetes could cause changes in cytokine production. We observed that spleen cells cultured in varying glucose concentrations had different cytokine production profiles. The free fatty acid palmitate might also influence cytokine release, but this effect was obscured by the cytokine-suppressive action of the ethanol used to dissolve the palmitate.</p>

Cytokines are soluble signalling mediators within the immune system, and have been shown to be of importance in the development of type 1 diabetes (T1D). This thesis studied the production of cytokines in experimental models of T1D and during transplantation of insulin-producing islets of Langerhans. We have demonstrated that the transcriptional TNFα-inhibitor MDL 201,449A, previously shown to reduce immune-mediated diabetes induced in mice by multiple low doses of streptozotocin, was not TNFα-specific, but also inhibited IFNγ and IL-10 in spleen cells. Furthermore, when the inhibitor was removed from in vitro cultures, a rebound phenomenon of increased cytokine secretion occurred. The thesis also investigated whether plastic adhesion, a method generally employed to deplete macrophages, influenced cytokine production in spleen cells. We observed that plastic adhesion increased TNFα, IFNγ and IL-10 release, and decreased IL-4 secretion. Plastic adhesion depleted only ~30% of the macrophages, but as much as ~60% of the regulatory T cells. Thirdly, we found that “control” treatments for islet transplantations, i.e. syngeneic and sham transplantations, exerted a clear effect on cytokine production from spleen cells, possibly due to a decrease in regulatory T cells that may be caused by the surgery and/or anaesthesia. Moreover, spleen cells from mice exposed to surgery exhibited a decreased proliferative capacity to concanavalin A stimulation. We also perceived a marked difference in cytokine response depending on the mouse strain used in the experiments. Finally, we aimed to elucidate if, besides autoimmune activities, also high glucose- and free fatty acid concentrations as seen in diabetes could cause changes in cytokine production. We observed that spleen cells cultured in varying glucose concentrations had different cytokine production profiles. The free fatty acid palmitate might also influence cytokine release, but this effect was obscured by the cytokine-suppressive action of the ethanol used to dissolve the palmitate.

Toxoplasma gondii est un parasite répandu, ayant un impact médical et vétérinaire. Chez les hôtes intermédiaires, les tachyzoïtes et les bradyzoïtes sont responsables de la toxoplasmose aiguë (TA) et chronique (TC), respectivement. Sous la réponse immunitaire, la TA évolue en TC, se manifestant par des kystes latents dans le cerveau et les muscles squelettiques. De plus, une forte corrélation existe entre la TC et plusieurs neuropathologies et cancers. Chez les patients immunodéprimés, la TC peut être réactivée et conduire à une maladie potentiellement fatale. Les traitements actuels ciblent principalement les TA, et présentent plusieurs effets secondaires. Nous nous sommes concentrés sur la TC et la compréhension de ses mécanismes moléculaires. Nous avons d’abord étudié l’efficacité de l’imiquimod contre la TA et la TC. Au cours de la TA, l'imiquimod a entraîné le recrutement de cellules T dans le péritoine et la rate de souris traitées et a considérablement diminué le nombre de kystes cérébraux lors de l'établissement de la TC. Remarquablement, le gavage de souris avec les kystes cérébraux restants chez des souris traitées à l'imiquimod n'a pas pu induire de TC. Après l'établissement de la TC, nous avons démontré que l'imiquimod réduisait considérablement le nombre de kystes cérébraux chez les souris chroniquement infectées et augmentait les récepteurs Toll-Like 11 et 12, qui se lient à une protéine du tachyzoïte, la profiline. Parallèlement, l’expression de TLR-7 augmentait, probablement par son agoniste, l'imiquimod. L'imiquimod induit une interconversion, comme l'indiquent la diminution du taux de protéine P21 et l'augmentation du taux de protéine P30, exprimées exclusivement et respectivement chez les bradyzoïtes et les tachyzoïtes. Les voies en aval de TLR-11/12 ont été activées via la voie MyD88 de signalisation, entraînant une induction ultérieure de la réponse immunitaire. In vitro, l'imiquimod n’affecte pas la souche Toxoplasma dépourvue de profiline, suggérant un rôle via le complexe Profilin/TLR-11/12. Enfin, le traitement par l'imiquimod a régulé positivement les transcrits des ligands 9 (CXCL9) et 10 (CXCL10), connus pour induire le recrutement de lymphocytes T dans des foyers réactivés du Toxoplasme afin d'éliminer l'infection.Ensuite, nous nous sommes concentrés sur les mécanismes moléculaires impliqués dans la TA et particulièrement dans la TC. Nous avons caractérisé P18, un membre de la superfamille SRS. Lorsque nous avons supprimé P18, la virulence était atténuée au cours de la TA, dû à un échappement plus rapide des tachyzoïtes du péritoine de souris, parallèle à un recrutement significatif de cellules dendritiques. De manière concomitante, moins de tachyzoïtes étaient détectés dans la rate, tandis que plus de parasites ont atteint le cerveau de souris infectées. L’élimination de P18 a augmenté le nombre de kystes de bradyzoïtes in vitro et dans le cerveau de souris infectées. Une expression induite de cytokines, notamment CXCL9 et 10, a également été observée. L’immunosuppression de souris KO P18 infectées a retardé la réactivation. L’infection orale de souris immunodéficientes ayant des macrophages fonctionnels a montré un prolongement de survie, contrairement aux souris n’ayant pas de macrophage, soulignant un rôle de l'IFN-g dans l’interconversion. Collectivement, ces données confirment le rôle de P18 dans la modulation de la réponse immunitaire, facilitant le passage des tachyzoïtes dans le cerveau et favorisant la formation de kystes. P18 joue également un rôle central dans la réactivation et la dissémination de parasites de manière dépendante de l'IFN-g. Dans l'ensemble, nous avons montré le potentiel thérapeutique prometteur de l'imiquimod contre la toxoplasmose et caractérisé le rôle de P18 dans l'immunomodulation afin de contrôler la dissémination et l'interconversion. Notre étude ouvre la voie à de nouvelles approches thérapeutiques contre la toxoplasmose, sa persistance et sa réactivation. / Toxoplasma gondii is a prevalent parasite of medical and veterinary impact. In intermediate hosts, tachyzoïtes and bradyzoïtes are responsible for acute and chronic toxoplasmosis (AT and CT), respectively. In immunocompetent patients, AT evolves, due to the host immunity, into a persistent CT, which manifests as latent tissue cysts in the brain and skeletal muscles. CT correlates with several neuro-pathologies and cancers. In immunocompromised patients, CT may reactivate and poses a life threatening condition. Current treatments primarily target AT, are limited to general anti-parasitic/anti-bacterial drugs, and associate with several limitations. Here, we focused on targeting CT and understanding its molecular mechanisms. First, we explored the efficacy of Imiquimod against AT and CT. During AT, Imiquimod led to recruitment of T cells to peritoneum and spleen of treated mice and significantly decreased the number of brain cysts upon establishment of CT. Remarkably, gavage of mice with the remaining brain cysts from Imiquimod treated mice, failed to induce CT. Post-establishment of CT, we demonstrated that Imiquimod sharply reduced the number of brain cysts in chronically infected mice, and significantly increased Toll-Like Receptors 11 and 12. These TLRs are usually expressed by dendritic cells and monocytes, and bind a tachyzoïte actin-binding protein, profilin. Concomitantly, TLR-7 was upregulated, likely by its agonist Imiquimod. Imiquimod induced interconversion as documented by the decreased protein levels of P21, and increased protein levels of P30, exclusively expressed in bradyzoïtes and tachyzoïtes respectively. Pathways downstream from TLR-11/12 were activated, through MyD88 dependent TLR signaling, which resulted in subsequent immune response induction. In vitro, Toxoplasma strain lacking profilin, does not respond to Imiquimod, suggesting a role through Profilin/TLR-11/12. Finally, Imiquimod treatment upregulated the transcript expression levels of Chemokine (C-X-C motif) ligand 9 (CXCL9) and 10 (CXCL10), known to induce T cell recruitment to reactivated Toxoplasma foci to clear the infection.Then, we focused on molecular mechanisms involved in AT and notably CT. We characterized P18, a Surface-Antigen 1 (SAG-1) Related Sequence (SRS) superfamily member. When we deleted P18, the virulence was attenuated during AT. Indeed, P18 depletion led to a faster clearance of the parasites from the peritoneum of mice, paralleled by a substantial recruitment of dendritic cells, presumably a vehicle for tachyzoïte dissemination. Concomitantly, a lower number of tachyzoïtes was detected in the spleens while a higher number of parasites reached the brains of infected mice. P18 depletion increased the number of bradyzoïte cysts, in vitro and in the brains of infected mice. An induced expression of cytokines/chemokines, including CXCL9 and 10 was also observed. Immunosuppression of infected mice with KO P18, delayed reactivation. Oral infection of Severe Combined Immunodeficiency (SCID) (with IFN-g secreting macrophages), and NOD/Shi-scid/IL-2Rgnull (NSG) mice (lacking IFN-g), showed a significant prolonged survival in infected SCID but not NSG mice. This underlines a role for IFN-g in the conversion from bradyzoïtes to tachyzoïtes. Collectively, these data support a role of P18 in orchestrating the immune response, which ultimately facilitates tachyzoïte trafficking to the brain and favors cyst formation. P18 plays also a central role in parasite reactivation and dissemination in an IFN-g dependent fashion.Altogether, we showed the promising therapeutic potential of Imiquimod against toxoplasmosis and characterized P18 role in immunomodulation to control dissemination and interconversion. Our study paves the path towards new therapeutic approaches against toxoplasmosis. It tackled key questions pertaining to establishment, maintenance and reactivation of CT and should result in a comprehensive solution to this endemic disease.

Host immune responses must be tightly regulated by an intricate balance between positive and negative signals while fighting pathogens; persistent pathogens may usurp these regulatory mechanisms to dampen host immunity to facilitate survival in vivo. Here we report that Tim-3, a negative signalling molecule expressed on monocytes and T cells, is up-regulated on natural killer (NK) cells in individuals chronically infected with hepatitis C virus (HCV). Additionally, the transcription factor T-bet was also found to be up-regulated and associated with Tim-3 expression in NK cells during chronic HCV infection. MicroRNA-155 (miR-155), an miRNA that inhibits signalling proteins involved in immune responses, was down-regulated in NK cells by HCV infection. This Tim-3/T-bet over-expression and miR-155 inhibition were recapitulated in vitro by incubating primary NK cells or NK92 cell line with Huh-7 hepatocytes expressing HCV. Reconstitution of miR-155 in NK cells from HCV-infected patients led to a decrease in T-bet/Tim-3 expression and an increase in interferon-γ production. Blocking Tim-3 signalling also enhanced interferon-γ production in NK cells by improving signal transducer and activator of transcription-5 phosphorylation. These data indicate that HCV-induced, miR-155-regulated Tim-3 expression regulates NK cell function, suggesting a novel mechanism for balancing immune clearance and immune injury during chronic viral infection.

Human cytomegalovirus (HCMV, Herpesviridae) can cause severe complications in the infected individuals undergoing hematopoietic stem cell transplantation. Nowadays, these patients are treated using antivirotics or HCMV-specific T cells derived from the seropositive graft donor. This study explored the possibility of redirecting HCMV-non-specific T cells from a seronegative donor towards HCMV-infected cells via chimeric antigen receptor (CAR), i.e. artificially designed T cell receptor. Viral glycoprotein B (gB) has been selected as a target for this receptor. Published sequence of a single chain variable fragment of a human antibody was used for the design of the CAR against gB (gBCAR). After the verification of production and surface localization in cell lines, gBCAR was being introduced into human T cells via lentiviral vectors. Human fetal lung fibroblasts (LEP) infected with HCMV were used as target cells after the expression of gB at their surface was demonstrated. gBCAR functionality was evaluated by the incubation of modified T cells with infected cells and subsequent analysis of media for IFNγ concentration, which was significantly higher in the setting of gBCAR T cells incubated with HCMV-LEP than in the control incubations. The results obtained show the specificity of gBCAR against...