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Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:01Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-10-31Bitstream added on 2014-06-13T20:49:47Z : No. of bitstreams: 1 destro_m_me_botib.pdf: 1170172 bytes, checksum: dde49d0cf6d568f068e97098c9cdebe7 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O aumento da secreção de insulina estimulada por glicose é um mecanismo adaptativo observado nas ilhotas pancreáticas de animais resistentes à insulina. Estudos relatam que os ácidos graxos livres estimulam a secreção de insulina através da ativação do GPR40. Diante destes fatos, investigamos a secreção de insulina, a expressão de proteínas da via do GPR40 nas células ß e a participação dos lipídios na resistência à insulina induzida por dexametasona, através do tratamento com o redutor de lipídios bezafibrato. Os grupos receberam gavagem uma vez ao dia durante 28 dias: Controle (CTL) e DEXA com goma arábica 5% (1 ml/kg, peso corpóreo); BEZA e BEZA-DEXA com bezafibrato (300 mg/kg, p.c.). Nos últimos 5 dias de tratamento os grupos receberam injeções intraperitoniais: CTL e BEZA de solução salina (1 ml/kg, p.c.); DEXA e BEZA-DEXA de dexametasona (Decadron® 1,0 mg/kg, p.c). A secreção de insulina estimulada por glicose aumentou nos grupos BEZA e DEXA. BEZA-DEXA exibiu diminuição dos níveis de ácidos graxos livres, triglicérides e de insulina, mas não houve elevação dos níveis de glicose no sangue. Além disso, houve melhora na resistência à insulina e restauração do padrão de secreção de insulina, em comparação ao grupo DEXA. Nas ilhotas dos animais BEZA-DEXA a expressão das proteínas GPR40, PLCß1 e PKCδ foi significativamente maior em relação aos valores obtidos em DEXA. Esta via permaneceu inalterada nas ilhotas de DEXA e BEZA. Em conclusão, o tratamento com bezafibrato melhorou a função das células ß e impediu a indução de resistência à insulina pelo tratamento com dexametasona, mas os mecanismos não são conhecidos. O aumento na secreção de insulina em DEXA aparentemente não está relacionado com a ativação do GPR40. Contrariando a literatura, apesar da redução na secreção de insulina, as ilhotas dos animais BEZA-DEXA apresentaram ativação da via do GPR40 / Increased glucose-stimulated insulin secretion is an adaptive mechanism exhibited by pancreatic islets from insulin resistant animal. Studies report that the free fatty acids stimulate the insulin secretion via GPR40. As such, we investigate the expression of GPR40 in ß-cells and the involvement of lipids in dexamethasone-induced IR, by lipid-lowering therapy with bezafibrate. Groups received once daily gavage for 28 days: Control (CTL) and DEXA with gum Arabic 5% (1.0 mg/kg, body weight); BEZA and BEZA-DEXA with bezafibrate (300 mg/kg, b.w.). In the last 5 days of the treatment groups received intraperitoneal injections: CTL and BEZA of saline (1.0 mg/kg, b.w.); DEXA and BEZA-DEXA of dexamethasone (Decadron® 1.0 mg/kg, b.w.). The glucose-stimulated insulin secretion increased in the DEXA and BEZA groups. BEZA-DEXA shows decrease in fatty acids, triglycerides and insulin levels, but not raised blood glucose levels. In addition, there was improved in insulin resistance and restoration the insulin secretory pattern, when compared to DEXA group. In BEZA-DEXA islets, GPR40, PLCß1 and PKCδ protein content was significantly higher than DEXA. This pathway remained unchanged in DEXA and BEZA islets. In conclusion, bezafibrate treatment improved ß-cell function and prevented dexamethasone-induced IR, but the mechanisms are not known. Augmented insulin secretion in DEXA appears to be unrelated to the activation of the GPR40. Contrary to the literature, despite the reduction in insulin secretion, BEZA-DEXA islets showed activation of the GPR40 pathway

Glicose e oxigênio desempenham um importante papel na regulação do metabolismo celular. Dada a importância de ambos no metabolismo - o primeiro como fonte de carbono preferencial da maior parte das células, e o segundo como aceptor final de elétrons na cadeia respiratória, em diversos organismos desenvolveram-se métodos adequados para detectar sua presença de modo a ajustar o metabolismo em função de sua disponibilidade. Neste trabalho foi realizado o estudo da expressão, no nível transcricional, dos genes envolvidos nas vias metabólicas primárias e genes envolvidos em morte celular, em células humanas, com o intuito de determinar as alterações no metabolismo energético em resposta a condições de hipóxia e anóxia, por meio da técnica de microarrays de cDNA. Utilizamos, inicialmente, células normais de fibroblasto humano ASl98 e células de fibroblasto humano MRC-5 imortalizadas por transfecção por SV40, e por fim células provenientes de ilhotas pancreáticas humanas, para a elaboração de um protocolo de cultura celular em que as mesmas crescessem aderidas a microcarregadores Cytodex I. Numa segunda etapa, células de ilhotas pancreáticas humanas foram cultivadas em suspensão, aderidas aos microcarregadores, num biorreator, sendo então realizada a análise do perfil transcricional dos genes escolhidos, frente às condições de baixa tensão de oxigênio. É apresentada a análise da expressão gênica de aproximadamente 160 genes na qual foram verificados um comportamento de indução daqueles envolvidos no metabolismo de lipídios e alguns na morte celular e um comportamento inicial de indução, e posterior inibição, do metabolismo primário como um todo. Em vista dos dados obtidos é de interesse ressaltar que essas células deveriam ser mantidas em saturações de oxigênio acima de 5% para evitar o efeito deletério observado na baixa concentração de oxigênio sobre a viabilidade celular, em termos da indução de alguns genes envolvidos na morte celular e da repressão geral dos relacionados ao metabolismo energético. Também foi verificado que, em saturações de oxigênio de até 10%, as células adotaram um padrão transcricional que indicou uma resposta ao estresse por falta de oxigênio, este por sua vez reflete-se na viabilidade celular, característica crucial para o sucesso do transplante clínico de ilhotas. / Glucose and oxygen have important roles on the regulation of cellular metabolism. Due to their importance in metabolism, the former as the preferential carbon source and the later as the final electron acceptor of the respiratory chain, many organisms have developed suitable processes to detect their presence in order to adjust the cellular metabolism to their availability. In this work, we have studied, in human cells and at the transcriptional level, the expression of genes involved in primary metabolism pathways and some of those related to cell death, aiming to resolve alterations in the energetic metabolism as a response to hypoxic and anoxic conditions, by means of cDNA microarrays. We initially used AS198 human fibroblastic normal cells and MRC-5 human fibroblastic cells immortalized by SV40, and later on cells from human pancreatic islets, to develop a cell culture protocol in which they would grow on the surface of Cytodex 1 microcarriers. As a second step, cells from human pancreatic islets were cultured on microcarriers in suspension inside a bioreactor. This culture was then used to carry out the transcriptional profile analysis of selected genes in response to low levels of oxygen. This work presents the analysis of gene expression of approximately 160 genes that can be divided into two distinct groups. The first group, the expression of which is induced, comprises genes involved in lipid metabolism and some of those related to cell death. The expression of the second group, consisting of diverse genes of the primary metabolism, suffers an initial induction followed by repression. Given the data acquired it is interesting to note that the human pancreatic islets should be maintained under at least 5% dissolved oxygen to avoid the deleterious effects on cell viability observed at lower oxygen concentrations, resulting in the induction of some genes involved in cell death and the repression of those related to energetic metabolism. It was also verified that, under oxygen saturation of at least 10%, these cells adopted a transcriptional profile that indicated a response to the stress created by the lack of oxygen, which would in turn reflect on cell viability, a crucial characteristic for success in clinical islet transplantation.

Zinc levels in pancreatic islets are amongst the highest in the body and reduction in its levels in the pancreas has been associated with diabetes. The link between zinc, diabetes and islet dysfunction has recently been reiterated by genome-wide association studies that identified an islet cell membrane zinc transporter, SLC30A8 (ZnT8), as one of the risk loci for type 2 diabetes. Here we begin to elucidate the molecular mechanisms linking ZnT8 and type 2 diabetes by characterizing global and beta cell specific ZnT8 knockout mice. Our results associate absence of ZnT8 with a reduction in zinc sequestration into insulin vesicles, abnormal insulin granule morphology, down regulation of insulin processing enzymes, abnormal insulin secretion, elevated plasma proinsulin levels and diet-induced obesity and insulin resistance. Furthermore, we observed differential zinc uptake properties by two human ZnT8 variants. We report here that the W325 variant of ZnT8 is more efficient in mediating zinc transport than the at risk variant, R325. Cumulatively, these results suggest that ZnT8 is crucially important for zinc transport and zinc-insulin crystallization in insulin granules of the pancreatic beta cell.

Zinc levels in pancreatic islets are amongst the highest in the body and reduction in its levels in the pancreas has been associated with diabetes. The link between zinc, diabetes and islet dysfunction has recently been reiterated by genome-wide association studies that identified an islet cell membrane zinc transporter, SLC30A8 (ZnT8), as one of the risk loci for type 2 diabetes. Here we begin to elucidate the molecular mechanisms linking ZnT8 and type 2 diabetes by characterizing global and beta cell specific ZnT8 knockout mice. Our results associate absence of ZnT8 with a reduction in zinc sequestration into insulin vesicles, abnormal insulin granule morphology, down regulation of insulin processing enzymes, abnormal insulin secretion, elevated plasma proinsulin levels and diet-induced obesity and insulin resistance. Furthermore, we observed differential zinc uptake properties by two human ZnT8 variants. We report here that the W325 variant of ZnT8 is more efficient in mediating zinc transport than the at risk variant, R325. Cumulatively, these results suggest that ZnT8 is crucially important for zinc transport and zinc-insulin crystallization in insulin granules of the pancreatic beta cell.

Orientador: José Roberto Bosqueiro / Banca: Margarida Júri Saeki / Banca: Débora Cristina Damasceno / Resumo: O aumento da secreção de insulina estimulada por glicose é um mecanismo adaptativo observado nas ilhotas pancreáticas de animais resistentes à insulina. Estudos relatam que os ácidos graxos livres estimulam a secreção de insulina através da ativação do GPR40. Diante destes fatos, investigamos a secreção de insulina, a expressão de proteínas da via do GPR40 nas células ß e a participação dos lipídios na resistência à insulina induzida por dexametasona, através do tratamento com o redutor de lipídios bezafibrato. Os grupos receberam gavagem uma vez ao dia durante 28 dias: Controle (CTL) e DEXA com goma arábica 5% (1 ml/kg, peso corpóreo); BEZA e BEZA-DEXA com bezafibrato (300 mg/kg, p.c.). Nos últimos 5 dias de tratamento os grupos receberam injeções intraperitoniais: CTL e BEZA de solução salina (1 ml/kg, p.c.); DEXA e BEZA-DEXA de dexametasona (Decadron® 1,0 mg/kg, p.c). A secreção de insulina estimulada por glicose aumentou nos grupos BEZA e DEXA. BEZA-DEXA exibiu diminuição dos níveis de ácidos graxos livres, triglicérides e de insulina, mas não houve elevação dos níveis de glicose no sangue. Além disso, houve melhora na resistência à insulina e restauração do padrão de secreção de insulina, em comparação ao grupo DEXA. Nas ilhotas dos animais BEZA-DEXA a expressão das proteínas GPR40, PLCß1 e PKCδ foi significativamente maior em relação aos valores obtidos em DEXA. Esta via permaneceu inalterada nas ilhotas de DEXA e BEZA. Em conclusão, o tratamento com bezafibrato melhorou a função das células ß e impediu a indução de resistência à insulina pelo tratamento com dexametasona, mas os mecanismos não são conhecidos. O aumento na secreção de insulina em DEXA aparentemente não está relacionado com a ativação do GPR40. Contrariando a literatura, apesar da redução na secreção de insulina, as ilhotas dos animais BEZA-DEXA apresentaram ativação da via do GPR40 / Abstract: Increased glucose-stimulated insulin secretion is an adaptive mechanism exhibited by pancreatic islets from insulin resistant animal. Studies report that the free fatty acids stimulate the insulin secretion via GPR40. As such, we investigate the expression of GPR40 in ß-cells and the involvement of lipids in dexamethasone-induced IR, by lipid-lowering therapy with bezafibrate. Groups received once daily gavage for 28 days: Control (CTL) and DEXA with gum Arabic 5% (1.0 mg/kg, body weight); BEZA and BEZA-DEXA with bezafibrate (300 mg/kg, b.w.). In the last 5 days of the treatment groups received intraperitoneal injections: CTL and BEZA of saline (1.0 mg/kg, b.w.); DEXA and BEZA-DEXA of dexamethasone (Decadron® 1.0 mg/kg, b.w.). The glucose-stimulated insulin secretion increased in the DEXA and BEZA groups. BEZA-DEXA shows decrease in fatty acids, triglycerides and insulin levels, but not raised blood glucose levels. In addition, there was improved in insulin resistance and restoration the insulin secretory pattern, when compared to DEXA group. In BEZA-DEXA islets, GPR40, PLCß1 and PKCδ protein content was significantly higher than DEXA. This pathway remained unchanged in DEXA and BEZA islets. In conclusion, bezafibrate treatment improved ß-cell function and prevented dexamethasone-induced IR, but the mechanisms are not known. Augmented insulin secretion in DEXA appears to be unrelated to the activation of the GPR40. Contrary to the literature, despite the reduction in insulin secretion, BEZA-DEXA islets showed activation of the GPR40 pathway / Mestre

Glicose e oxigênio desempenham um importante papel na regulação do metabolismo celular. Dada a importância de ambos no metabolismo - o primeiro como fonte de carbono preferencial da maior parte das células, e o segundo como aceptor final de elétrons na cadeia respiratória, em diversos organismos desenvolveram-se métodos adequados para detectar sua presença de modo a ajustar o metabolismo em função de sua disponibilidade. Neste trabalho foi realizado o estudo da expressão, no nível transcricional, dos genes envolvidos nas vias metabólicas primárias e genes envolvidos em morte celular, em células humanas, com o intuito de determinar as alterações no metabolismo energético em resposta a condições de hipóxia e anóxia, por meio da técnica de microarrays de cDNA. Utilizamos, inicialmente, células normais de fibroblasto humano ASl98 e células de fibroblasto humano MRC-5 imortalizadas por transfecção por SV40, e por fim células provenientes de ilhotas pancreáticas humanas, para a elaboração de um protocolo de cultura celular em que as mesmas crescessem aderidas a microcarregadores Cytodex I. Numa segunda etapa, células de ilhotas pancreáticas humanas foram cultivadas em suspensão, aderidas aos microcarregadores, num biorreator, sendo então realizada a análise do perfil transcricional dos genes escolhidos, frente às condições de baixa tensão de oxigênio. É apresentada a análise da expressão gênica de aproximadamente 160 genes na qual foram verificados um comportamento de indução daqueles envolvidos no metabolismo de lipídios e alguns na morte celular e um comportamento inicial de indução, e posterior inibição, do metabolismo primário como um todo. Em vista dos dados obtidos é de interesse ressaltar que essas células deveriam ser mantidas em saturações de oxigênio acima de 5% para evitar o efeito deletério observado na baixa concentração de oxigênio sobre a viabilidade celular, em termos da indução de alguns genes envolvidos na morte celular e da repressão geral dos relacionados ao metabolismo energético. Também foi verificado que, em saturações de oxigênio de até 10%, as células adotaram um padrão transcricional que indicou uma resposta ao estresse por falta de oxigênio, este por sua vez reflete-se na viabilidade celular, característica crucial para o sucesso do transplante clínico de ilhotas. / Glucose and oxygen have important roles on the regulation of cellular metabolism. Due to their importance in metabolism, the former as the preferential carbon source and the later as the final electron acceptor of the respiratory chain, many organisms have developed suitable processes to detect their presence in order to adjust the cellular metabolism to their availability. In this work, we have studied, in human cells and at the transcriptional level, the expression of genes involved in primary metabolism pathways and some of those related to cell death, aiming to resolve alterations in the energetic metabolism as a response to hypoxic and anoxic conditions, by means of cDNA microarrays. We initially used AS198 human fibroblastic normal cells and MRC-5 human fibroblastic cells immortalized by SV40, and later on cells from human pancreatic islets, to develop a cell culture protocol in which they would grow on the surface of Cytodex 1 microcarriers. As a second step, cells from human pancreatic islets were cultured on microcarriers in suspension inside a bioreactor. This culture was then used to carry out the transcriptional profile analysis of selected genes in response to low levels of oxygen. This work presents the analysis of gene expression of approximately 160 genes that can be divided into two distinct groups. The first group, the expression of which is induced, comprises genes involved in lipid metabolism and some of those related to cell death. The expression of the second group, consisting of diverse genes of the primary metabolism, suffers an initial induction followed by repression. Given the data acquired it is interesting to note that the human pancreatic islets should be maintained under at least 5% dissolved oxygen to avoid the deleterious effects on cell viability observed at lower oxygen concentrations, resulting in the induction of some genes involved in cell death and the repression of those related to energetic metabolism. It was also verified that, under oxygen saturation of at least 10%, these cells adopted a transcriptional profile that indicated a response to the stress created by the lack of oxygen, which would in turn reflect on cell viability, a crucial characteristic for success in clinical islet transplantation.

Dans les conditions normales, les organismes maintiennent une masse cellulaire endocrine stable tout au long de leur vie. En cas d’obésité, la masse de cellules b pancréatiques est capable de maintenir des taux de glucose plasmatique en augmentant la sécrétion en insuline. L’incapacité de ces cellules à fournir de l’insuline entraîne alors l’apparition d’une hyperglycémie et d’un diabète de type II. Cliniquement, la majorité des individus obèses ne développent pas de diabète car les îlots pallient à cette résistance à l’insuline. La preuve de l’adaptation de la masse d’îlots humains à l’obésité, in vivo, n’a pas été clairement décrite et, de plus, peu d’informations existent sur les mécanismes et les types cellulaires impliqués. Actuellement, la mise en évidence de l’augmentation de la masse des cellules b chez les humains obèses repose uniquement sur des études histologiques.But : Au cours de cette thèse, nous avons cherché, dans un premier temps (partie 1), à évaluer la morphologie des îlots pancréatiques et la distribution des cellules a et b chez des donneurs en état de mort cérébrale normaux, en surpoids et obèses. Dans un second temps (partie 2), nous avons étudié l’adaptation au cours du temps des îlots humains à un environnement obésogène. Nous avons montré ainsi que les îlots humains non diabétiques s’adaptent in vivo à l’obésité en modifiant la masse de cellules b, leur fonction et leur expression génique. En suite (partie 3), on a identifié le mécanisme de transdifférenciation des cellules alpha et beta en utilisant la méthode de lineage tracing. Finalement (partie 4), on a déterminé la différence sur l’expression de gène des ilots humains greffé chez les souris sous régime control ou régime riche en graisse en utilisant les puces d’ARN (Illumina).Methodes et Resultats: Des coupes de pancréas humains inclues en paraffines ont été analysées. Les donneurs obèses étaient caractérisés par une augmentation de la masse endocrine totale, de la taille des îlots, de la graisse intra-pancréatique et du ratio b:a dans les îlots, mais avec une diminution du ratio a:b dans les îlots. Au cours de l’étude longitudinale, des souris Rag2-/- non diabétiques ont été greffées sous la capsule rénale avec des îlots humains issus de donneurs en état de mort cérébrale (donneurs non diabétiques ou donneurs avec un dysfonctionnement métabolique déclaré). Les animaux ont été nourris pendant 2 semaines avec soit un régime contrôle soit un régime riche en graisse (high fat diet HFD). Un suivi du poids, du taux des triglycérides, de la glycémie et du C-peptide a été mis en place. Après sacrifice des souris, les greffons et les pancréas endogènes ont été analysés pour le volume endocrine, la distribution des cellules b et a et les mécanismes de régénération des cellules pancréatiques. Après 12 semaines sous régime gras, les souris montraient toutes les caractéristiques typiques de l’obésité, à savoir, une augmentation du poids, un doublement de la graisse abdominale, des triglycérides, de la glycémie et une sensibilité à l’insuline réduite. De plus, l’apparition sur ces animaux d’un doublement rapide de la quantité de C-peptide humain dans le sérum murin nous indique la mise en place d’une compensation fonctionnelle. Une analyse histologique des greffons a permis de mettre en évidence une adaptation de la masse endocrine des îlots avec une augmentation des cellules b. D’autres analyses ont identifié la prolifération et la néogénèse comme les mécanismes responsables de ce doublement de la masse endocrine humaine.Discussion: Ce nouveau modèle animal permet d’étudier, in vivo sur une longue période, l’adaptation des îlots humains à un environnement obésogène murin. Il peut être utilisé comme un outil dans le décryptage des voies de signalisation impliquées dans l’expansion des cellules b humaines et permettre également l’identification des facteurs prédisposant ces cellules à subir une décompensation. / Under normal healthy conditions, organisms maintain a dynamic endocrinecell mass throughout life. Pancreatic beta cell mass are able to maintain plasma glucose levels increasing insulin secretion in conditions as obesity.Beta cell inability to compensate in insulin demand provokes hyperglycemia and Type 2 Diabetes. Clinically, most obese individuals do not develop diabetes because islets compensate for insulin resistance. Direct evidence that human islet mass adapts longitudinally to obesity in vivo was lacking and, moreover, little information was available on the mechanismsand cell type(s) involved.Current evidence for increased beta cell mass in obese humans (vs lean) is based entirely on postmortem histology.Aim: In this thesis, firstly (Part 1) we performed a descriptive cross sectional study by evaluating the pancreatic islet morphology and alpha and beta cell distribution from our archived human pancreatic sections of obese and normal subjects. Secondly, (Part 2) we explored the longitudinal adaptation of human islets to an obesogenic environment and showed direct evidence that non-diabetic human islets adapt bothendocrine and beta cell mass, function and gene expression to obesity in vivo. Thirdly (Part 3) we performed lineage tracing to determine which cell type alpha or beta give rise to the increase islet mass in obesity. Finally (Part 4) in this diet induced obesity model we developed, we looked at the differential gene expression with Illumina gene chips in a kinetic study on human islets which were laser capture microdissected at 6, 8 and 10 weeks on control or high fat diet.Methods: Archived human pancreatic sections were immunostained for endocrine, beta, alpha, fat. In the obese/immunodeficient mouse model, non-diabetic Rag2–/– mice were transplanted under kidney capsule with human islets from human brain-deceased donors (non-diabetics donors and donors with overt metabolic dysfunction). Animals were fed for 12 weeks with a control or high-fat diet (HFD), and followed for weight, serum triacylglycerol, fasting blood glucose and human C-peptide. After the mice were killed, human grafts and the endogenous pancreas were analyzed for endocrine volume, distribution of beta and alpha cells, and mechanisms of regeneration.Results: The cross-sectional study, performed on archived human paraffin embedded sections of normal weight, overweight, or obese subjects showed that obese donors were characterized by an increased total endocrine mass, bigger individual islet size, increased intrapancreatic fat, increased β to  cell ratio and decreased :β cell ratio in islets. In the longitudinal study, concomitant with the increased weight gain, doubling of abdominal fat, increased serum triacylglycerol and reduced insulin sensitivity in 12 week HFD animals we reported that human islet grafts showed functional compensation, measured as a more than doubling of fasting human C-peptide in mouse serum, and histological adaptation of islet endocrine mass including increased beta cells. Further analysis of the human grafts revealed proliferation and neogenesis as the responsible mechanisms for the doubling of the human endocrine mass.Discussion: This novel model allows, for the first time, longitudinal studies of human islet adaptation to an obese murine environment and may be instrumental in deciphering pathways involved in human beta cell expansion, as well as in helping to identify factors predisposing human beta cells to undergo decompensation.

As complicações relacionadas ao diabetes mellitus estão intimamente ligadas à hiperglicemia. Os pacientes que evoluem com grande instabilidade metabólica e progressão das complicações microvasculares apesar do tratamento intensivo com insulina são candidatos ao transplante de pâncreas. Neste contexto, o transplante de ilhotas pancreáticas surge como alternativa por ser menos invasivo e menos imunogênico. No entanto, o processo de digestão do pâncreas e isolamento das ilhotas pancreáticas expõe as células endócrinas a diversos estímulos nocivos, que resultam em diminuição da viabilidade das células isoladas e menor chance de sucesso após o transplante. A geração de espécies reativas de oxigênio (ERO) e o consumo das defesas anti-oxidantes durante o processo de digestão do pâncreas pode contribuir para a perda da viabilidade das ilhotas isoladas. O objetivo deste estudo foi avaliar o impacto da suplementação com glutationa etil mono-éster (GEE), um éster de melhor biodisponibilidade da glutationa (um importante anti-oxidante endógeno) nos resultados do isolamento e do transplante de ilhotas pancreáticas em um modelo animal. GEE foi adicionada na concentração de 10 mM na solução de colagenase durante o isolamento das ilhotas de rato. Após o isolamento, foram realizados estudos in vitro para avaliar a presença de ERO com o ensaio carboxi-H2DCFDA e a viabilidade das ilhotas isoladas com os ensaios JC-1 (integridade mitocondrial) e Sytogreen/brometo de etídio (integridade da membrana celular); viabilidade das células beta-pancreáticas por citometria de fluxo para avaliação de necrose e apoptose, TUNEL para a avaliação do índice de apoptose e secreção de insulina estimulada por glicose. Realizamos também estudos in vivo, com o transplante das ilhotas na cápsula renal de camundongos diabéticos, seguimento dos animais por 30 dias após o transplante e recuperação do enxerto para análise histológica. Quatro grupos de animais foram avaliados: 1) Animais transplantados com número suficiente de ilhotas para reverter o diabetes (500) não isoladas com GEE; 2) Animais transplantados com número suficiente de ilhotas (500) isoladas em presença de GEE; 3) Animais transplantados com número insuficiente de ilhotas (150) não isoladas com GEE e 4) Animais transplantados com número insuficiente de ilhotas (150) isoladas em presença de GEE. A suplementação com GEE na concentração de 10 mM durante o isolamento das ilhotas diminuiu a formação de ERO (Controle 57,0 ± 4,3% versus GEE 47,0 ± 3,9%, p = 0,0034) e aumentou a viabilidade das ilhotas, conforme demonstrado pelo ensaio Sytogreen/brometo de etídio (Controle 70,6 ± 3,4% versus GEE 83,6 ± 4,8%, p= 0,0010) e pela diminuição na porcentagem de células TUNEL-positivas (Controle de 39,2 ± 5,0% versus GEE 29,1 ± 1,9%, p= 0,042) no grupo tratado. O estudo de viabilidade por citometria de fluxo também mostrou um número maior de células beta pancreáticas viáveis no grupo tratado (Controle 21,4 ± 3,4% versus GEE 33,7 ± 3,9%, p= 0,0156). A manutenção da integridade funcional das ilhotas teve impacto nos resultados dos transplantes, com menor índice de célula TUNEL-positivas (Controle 23,3 ± 2,6% versus GEE 8,3 ± 0,8%, p < 0,0001) nos enxertos recuperados após as primeiras 24 horas do transplante e maior porcentagem de animais normoglicêmicos (Controle 30% versus GEE 65,2%, p = 0,004) após transplante de um número marginal de 150 ilhotas na cápsula renal após seguimento de 30 dias. Em conclusão, estes dados corroboram que a formação de ERO é uma causa relevante de dano celular durante o isolamento de ilhotas pancreáticas e sugerem que o uso do compostos anti-oxidante GEE pode ser uma estratégia para melhorar os resultados dos transplantes de ilhotas / The vascular complications related to Diabetes Mellitus are closely linked to hyperglycemia. Patients who develop metabolic instability and progression of microvascular complications despite intensive insulin therapy are candidates to pancreas transplantation. Pancreatic islet transplant is an alternative approach since it is less immunogenic and minimally invasive. However, the success of pancreatic islet transplantation still faces many challenges, mainly related to cell damage during the islet isolation process and early post-transplant period. The increase in reactive oxygen species (ROS) generation and the consumption of antioxidant defenses might be factors related to these injuries. The aim of the present study was to evaluate whether supplementation with glutathione-ethyl-ester (GEE), a compound with higher bioavailability than glutathione (an important endogenous antioxidant), could improve islet viability and efficacy in a marginal islet transplantation model in rodents. GEE was added to a final concentration of 10 mM in collagenase solution during islet isolation. After isolation, in vitro studies were conducted to evaluate the presence of ROS using carboxy-H2DCFDA assay and the viability of isolated islets with JC-1 assay (mitochondrial integrity), Sytogreen/ethidium bromide assay (cellular membrane integrity), fractional beta cell viability assay by flow cytometry, TUNEL assay for apoptosis evaluation and glucose-stimulated insulin secretion. We also performed in vivo studies with islet transplantation under the kidney capsule of diabetic mice, 30 days follow-up after transplantation and recovery of the graft for histological analysis. Four experimental groups were evaluated: 1) animals transplanted with 500 islets, a number considered sufficient to promote diabetes reversion, not isolated in presence of GEE; 2) animals transplanted with 500 islets isolated in presence of GEE; 3) animals transplanted with 150 islets, a number considered insufficient to promote diabetes reversion, not isolated in presence of GEE and 4) animals transplanted with 150 islets isolated in presence of GEE. The addition of GEE at 10 mM concentration during islet isolation was able to decrease ROS content in isolated islets (Control 57.0 ± 4.3% versus GEE 47.0 ± 3.9%, p = 0.0034) and increase islet viability, as demonstrated by the Sytogreen/ethidium bromide assay (Control 70.6 ± 3.4% versus GEE 83.6 ± 4.8%, p = 0.0010) as well as by the reduction in TUNEL-positive cells (Control 39.2 ± 5.0% versus GEE 29.1 ± 1.9%, p = 0.042) in the treated group. The fractional beta-cell viability also showed an improvement in the treated group (Control 21.4 ± 3.4% versus GEE 33.7 ± 3.9%, p = 0.0156). The improved cell viability observed in vitro was translated into better outcomes in vivo, since supplementation of GEE during the isolation process resulted in a significantly lower rate of TUNEL-positive cells (Control 23,3 ± 2,6% versus GEE 8,3 ± 0,8%, p < 0,0001) in the islet grafts recovered after 24h of transplantation and in a higher percentage of normoglycemia (Control 30% versus GEE 65,2%, p = 0,004) after 30 days of follow-up in animals transplanted with the marginal islet mass (150 islets). In conclusion, the current data corroborate that ROS production is a relevant cause of cellular damage during islet isolation and suggest that the use of GEE might be a strategy to improve islet transplantation outcomes

A crescente incidência de disfunções metabólicas, como resistência à insulina e diabetes mellitus tipo 2 (T2DM), está correlacionada com a elevação da ocorrência de obesidade e sobrepeso. Em busca da melhora da saúde e de um corpo ideal segundo os padrões estéticos propagados atualmente, um número cada vez maior de indivíduos adere às dietas da moda que prometem rápida redução do peso corporal, ao invés de adotar uma alimentação balanceada e a prática regular de exercícios físicos. Uma dieta bastante divulgada e até recomendada por profissionais da saúde é o jejum intermitente (JI), que consiste em alternar períodos de jejum de até 24 horas com períodos de ingestão alimentar. Diversos estudos experimentais têm relatado alterações metabólicas em consequência do JI, como modificações da glicemia e da tolerância à glicose, porém, os resultados encontrados na literatura são conflitantes e, além disso, o impacto do jejum intermitente, em longo prazo, sobre as ilhotas pancreáticas ainda não foi devidamente elucidado. Desta forma, o presente estudo teve como objetivo caracterizar os impactos de doze semanas de JI em ratas Wistar. Para tal, ratas Wistar com 30 dias de idade foram distribuídas aleatoriamente em dois grupos: controle, com livre acesso à ração balanceada; e jejum intermitente, submetido a 24 horas de jejum intercalado com 24 horas de livre acesso à ração balanceada. Foi observado que os animais submetidos ao JI, apresentaram menor ganho de peso corporal, redução do comprimento da tíbia e da distância naso-anal, e alteração da composição corporal, incluindo diminuição da massa muscular e aumento do tecido adiposo. Em média, o consumo de ração do grupo JI foi menor, porém, no dia que era disponibilizado alimento, os animais apresentaram hiperfagia o que resultou em grande aumento das dimensões do estômago. O jejum intermitente reduziu os valores plasmáticos do colesterol total, triglicérides, LDL, HDL e glicemia, e aumentou a concentração basal da insulina plasmática, bem como a secreção da insulina após o estímulo com glicose. Foi observada redução significativa da massa de ilhotas pancreáticas e aumento da porcentagem de células dispersas de ilhotas em apoptose. Ainda nas células dispersas de ilhotas pancreáticas, houve aumento do conteúdo de espécies reativas de oxigênio mitocondrial e total, e do peróxido de hidrogênio (H2O2), além de aumento da expressão do sistema antioxidante. Assim, nossos dados sugerem que esse protocolo estudado de 24 horas de jejum intercalados com 24 horas de alimentação à vontade não seja saudável em longo prazo. Mais estudos em longo prazo são necessários para investigar qual seria o melhor protocolo de jejum intermitente de forma a reduzir os efeitos colaterais e melhorar a saúde, para então o JI ser considerado uma boa alternativa para perda e manutenção do peso. / The increasing incidence of metabolic dysfunctions, such as insulin resistance and type 2 diabetes mellitus (T2DM), is correlated with increased occurrence of obesity and overweight. In pursuit of improved health and an ideal body according to today\'s aesthetic standards, an increasing number of individuals adhere to fad diets that promise a rapid reduction of body weight, instead of adopting a balanced diet and regular practice of physical exercises. A well-publicized diet and even recommended by health professionals is intermittent fasting (IF), which consists of alternating fasting periods of up to 24 hours with periods of food intake. Several experimental studies have reported metabolic changes as a consequence of IF, such as changes in glucose and glucose tolerance, but the results found in the literature are conflicting and, in addition, the impact of intermittent fasting in the long term on pancreatic islets has not yet been properly elucidated. Thus, the present study aimed to characterize the effects of twelve-week IF on Wistar rats. For this, 30-day-old Wistar rats were randomly assigned to two groups: control, with free access to balanced chow; and intermittent fasting, subjected to 24-hour fast intercalated with 24 hours of free access to the balanced chow. It was observed that the animals submitted to IF presented lower body weight gain, reduced tibia length and naso-anal distance, and altered body composition, including decreased muscle mass and increased adipose tissue. On average, the dietary intake of the IF group was lower, but on the day that food was available, the animals presented hyperphagia which resulted in a large increase in the stomach size. Intermittent fasting reduced plasma levels of total cholesterol, triglycerides, LDL, HDL, and glycaemia, and increased basal plasmatic insulin level, as well as insulin secretion after stimulation with glucose. We observed significant reduction in pancreatic islet mass and increase in percentage of islet-dispersed cells in apoptosis. Still in islet-dispersed cells, there was an increase in mitochondrial and total reactive oxygen species content, and of hydrogen peroxide (H2O2), in addition to an increase in expression of antioxidant system. Thus, our data suggest that this protocol of 24-hour fasting intercalated with 24-hour feed at will is not healthy in the long run. More long-term studies are needed to investigate the best intermittent fasting protocol in order to reduce side effects and improve health, so IF be considered a good alternative for weight loss and maintenance.