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Iontophoresis is a method to enhance and regulate the transdermal drug delivery by application of an electric field to the skin. Application of small electric current (µ A) enhances transport of both charged and neutral molecules across the skin. Reverse of this process enables extraction of analytes across the skin for noninvasive sensing and diagnosis. Hence it is planned to conduct detailed studies on Reverse Iontophoresis. An invitro model is developed to study the extraction of glucose across the skin. Effects of magnitude of electric current, time of application, pH etc. on the extraction of glucose are studied. It is observed that extraction of glucose at the cathode is higher than at the anode. Advantage of invitro model is the possibility of varying parameters to an extent which is impossible invivo. Instrumentation suitable for continuous monitoring of reverse iontophoresis invivo in human subjects is developed. It supplies the required current and acquires the potential profile of the skin during reverse iontophoresis. Potential profiles showed that skin resistance decreases with the application of current. Experimental results revealed that the application of pulsed DC tends to make the reverse iontophoresis more effective by enhancing the flow of analytes which is proved by the fact that skin resistance decreases and stabilizes faster in comparison to the one with direct current reverse iontophoresis. Present work emphasizes the importance of selecting an appropriate duty cycle and frequency for reverse iontophoresis. Duty cycle around 95% and frequency of 250 mHz are good for low frequency reverse iontophoresis. Effect of reverse iontophoresis on the skin recovery is observed by monitoring the potential profiles at the end of the process. In all the reverse iontophoresis experiments, safety of the patient is ensured by fixing a compliance voltage level. Finally, Instrumentation to measure the capacitance of biosensors is developed based on frequency domain technique with a sinusoidal input. Accuracy in capacitance measurements is ±5%. Glucose measurement is demonstrated with the developed instrument using a capacitance type biosensor. The obtained results are in good agreement with the standard UV-Visible spectroscopic measurements based on phenol-sulphuric acid assay method.

O tratamento tópico do câncer de pele é uma estratégia promissora para aumentar a biodisponibilidade local de antineoplásicos e diminuir efeitos sistêmicos adversos. No entanto, altas concentrações do fármaco nos tumores, que acometem as camadas mais profundas da pele, são requeridas para que o tratamento seja adequado. Para promover a penetração cutânea dos antineoplásicos e atingir o tumor, sistemas de liberação nanoparticulados associados a métodos físicos, como a iontoforese, vêm sendo estudados. Nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) são sistemas carreadores explorados para a administração tópica, principalmente, de produtos cosméticos. Pouco se sabe, no entanto, sobre sua influência na penetração cutânea de fármacos e sobre os mecanismos pelos quais as NLS agem para aumentar esta penetração. A iontoforese é um método físico que aumenta a permeação cutânea de fármacos através da aplicação de uma corrente elétrica de baixa densidade. Sua influência na penetração tumoral de fármacos carreados por NLS ainda não foi explorada. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da iontoforese na penetração tumoral do antineoplásico modelo doxorrubicina (DOX) a partir de NLS catiônicas. Para tanto, NLS contendo DOX foram preparadas e caracterizadas quanto a distribuição de tamanho, potencial zeta e pH. NLS idênticas, mas marcadas com um fluoróforo lipofílico, o BODIPY FSE-8 (BOD), sintetizado especificamente para este fim, também foram obtidas e caracterizadas. Estas nanopartículas fluorescentes contendo DOX e BOD foram utilizadas para estudar, por microscopia confocal de varredura a laser, in vitro e in vivo, as vias de penetração dos compostos lipofílicos presentes nas NLS e da própria DOX. A penetração da DOX nas diferentes camadas da pele foi avaliada in vitro usando-se células de difusão vertical e pele de suíno. In vivo, a penetração do fármaco foi avaliada também no tumor e no plasma, após 1 h de aplicação passiva e iontoforética das NLS em tumores de células escamosas induzidos em camundongos imunossuprimidos. Nos estudos de microscopia observou-se que a aplicação das NLS levou a uma distribuição mais homogênea da fluorescência no estrato córneo (EC) do que a aplicação de soluções dos fluoróforos livres. A iontoforese aumentou a fluorescência de todas as amostras testadas, levando inclusive a presença de agregados fluorescentes abaixo dos folículos pilosos e a formação de regiões de transporte localizadas mais permeáveis no EC. Nos estudos quantitativos in vitro a iontoforese anódica (a partir do eletrodo positivo) das NLS-DOX levou a concentrações cerca de 39 vezes maiores de DOX na epiderme viável do que todas as outras formulações, indicando um efeito positivo da eletromigração na penetração das NLS catiônicas. Nos estudos in vivo, o aumento da quantidade de DOX acumulada na pele após a iontoforese anódica das NLS-DOX foi bem acentuado frente às outras formulações. Já a presença de fármaco no tumor, apesar de apresentar uma tendência maior de acúmulo quando a iontoforese foi aplicada, não foi estatisticamente diferente das demais formulações. No entanto, a tendência das NLS de ficarem acumuladas na pele, diminuindo a presença da DOX na circulação, foi bastante característica. Pode-se concluir, portanto, que a aplicação de NLS associadas a iontoforese apresenta alto potencial de sucesso para o tratamento tópico, localizado, de tumores cutâneos. / Topical treatment of skin cancer is a promising strategy to increase local bioavailability of antineoplastic drugs and to reduce systemic adverse effects. However, elevated concentrations of the drug in tumors presented in deep skin layers are required for the adequate treatment. To increase drug skin penetration, nanoparticles associated with physical methods, such as iontophoresis, have been studied. Solid lipid nanoparticles (SLN) are drug carrier systems developed for topical administration, especially of cosmetic products. However, almost nothing is known about their influence on the skin penetration of drugs or on the mechanisms by which they enhance drug penetration through the skin. Iontophoresis is a physical method which increases the skin permeation of drugs through the application of a low density electrical current. Its influence on tumor penetration of drugs carried by SLN has not been explored yet. Therefore, the aim of this study was to evaluate the influence of iontophoresis on the penetration of the antineoplastic model drug doxorubicin (DOX) carried by cationic SLN. To this end, SLN containing DOX were prepared and characterized according to their medium size, zeta potential and pH. Besides that, identical SLN containing a lipophilic fluorophore BODIPY FSE-8 (BOD), synthesized specifically for this study, has also been obtained and characterized. These fluorescent nanoparticles containing DOX and BOD were used to study the in vitro and in vivo penetration routes of both DOX and lipophilic compounds present in the SLN, by confocal laser scanning microscopy analysis. The penetration of DOX in the different skin layers was evaluated in vitro using vertical diffusion cells and pig skin. In vivo, the drug penetration was also measured in the tumor and plasma after 1 hour of iontophoretic and passive application of SLN on squamous cells tumors, previously induced in immunosuppressed mice. The microscopy studies showed that the application of SLN resulted in a more homogeneous distribution of fluorescence in the stratum corneum (SC) compared to the application of solutions containing free fluorophores at the same conditions. Iontophoresis increased fluorescence for all samples tested, leading yet to the presence of fluorescent aggregates below the hair follicles and the formation of localized transport regions at the SC. The in vitro quantitative studies showed that anodic iontophoresis (from the positive electrode) of SLNDOX led to about 39 times higher concentrations of DOX in viable epidermis than all the others formulations, indicating a positive effect of electromigration on the penetration of cationic SLN. In the in vivo studies, the amount of DOX accumulated in the skin after anodic iontophoresis of SLN-DOX was also well pronounced. The tendency of SLN accumulation in the skin, reducing the presence of DOX in the blood circulation, was very characteristic. Therefore, it can be concluded that the application of SLN associated with iontophoresis has a great potential for success in the topical treatment of localized skin tumors.

Diante da hipótese de que micropartículas poliméricas podem atravessar a barreira epidérmica através da rota transfolicular, e baseado na evidência de que a iontoforese é um método que consegue direcionar a liberação de fármacos para os folículos pilosos, este trabalho teve como objetivo estudar in vitro a permeação cutânea do minoxidil sulfato (MXS), fármaco utilizado no tratamento da alopecia androgênica, tanto em sua forma microencapsulada como não encapsulada utilizando ou não a iontoforese, na tentativa de aumentar, controlar e direcionar a sua liberação tópica para o folículo piloso. O MXS foi primeiramente incorporado em um gel hidrofílico contendo 2,0% (m/m) do ativo e sua permeação e retenção cutânea in vitro verificada com e sem a presença de corrente elétrica durante 6 h, utilizando células de difusão e pele de orelha de porco. A quantidade de MXS retida no EC da pele foi determinada e diferenciada daquela retida nos folículos pilosos utilizando-se a técnica denominada tape stripping diferencial. Foi observado que o fluxo passivo de fármaco através da pele aumentou 150 vezes com aplicação de iontoforese anódica e que o aumento do pH da formulação de 3,5 para 5,5 restringiu 3 vezes essa permeação iontoforética e aumentou a retenção do MXS no EC e folículos pilosos. Estes resultados mostram que a iontoforese do MXS nestas condições é capaz de promover a liberação folicular do fármaco de maneira bastante significativa. Uma série de micropartículas de quitosana contendo MXS foi obtida por spray drying modificando quantidades e proporções de polímero e fármaco. O sistema selecionado para estudo foi obtido a partir de 1,50 g de polímero e 0,75 g de MXS, e apresentou alta eficiência de encapsulação (~82%), diâmetro médio igual a 3,05 µm, morfologia esférica e sem porosidades, e potencial zeta igual a + 5,87 mV. Quando incorporadas a uma formulação hidroalcoólica, essas micropartículas sofreram intumescimento, aumentando 1,5 vezes o seu diâmetro médio, mas não tiveram sua morfologia esférica alterada. Experimentos de liberação in vitro mostraram que as micropartículas obtidas foram capazes de sustentar 3,5 vezes a liberação do MXS. As micropartículas ainda restringiram a permeação passiva do fármaco, reduzindo 2 vezes seu fluxo de permeação e aumentando em 5 vezes a retenção de fármaco na região folicular, apesar das partículas em si não penetrarem a pele após administração passiva. Assim, este sistema foi capaz de promover uma liberação mais sustentada do fármaco, o que deve reduzir o número de aplicações do produto pelo paciente ao longo do dia, e garantiu a entrada de grandes quantidades do fármaco nos folículos pilosos, seu alvo de ação. A iontoforese dessas micropartículas, apesar de também não fazê-las penetrar a pele, conseguiu direcioná-las mais rapidamente para as aberturas foliculares, como mostrou os estudos de microscopia confocal de varredura a laser das micropartículas marcadas. Adicionalmente, a iontoforese aumentou 6 vezes a quantidade de MXS retida nos folículos já nas primeiras 3 h de aplicação, garantindo assim que grandes quantidades do fármaco atingissem seu local de ação mais rapidamente que quando as partículas foram aplicadas passivamente sobre a pele. / Given the hypothesis that polymeric microparticles can penetrate the skin barrier along the transfollicular route, and based on the evidence that iontophoresis is a method that can direct the delivery of drugs to the hair follicles, this work aimed to study the in vitro skin permeation of minoxidil sulfate (MXS), a drug used to treat androgenic alopecia, both in its micro-encapsulated and non-encapsulated form, using or not iontophoresis, in an attempt to increase, control and direct its topical delivery to the hair follicle. The MXS was first incorporated in a hydrophilic gel containing 2.0% (w/w) MXS and its skin permeation and retention was in vitro observed with and without the presence of electric current for 6 h, using diffusion cells and skin of porcine\'s ears. The amount of MXS retained in EC was determined and differentiated from that retained in the hair follicles using the technique called differential tape stripping. It was observed that the passive flux of drug through the skin was increased 150-fold with the application of anodal iontophoresis and, by increasing the pH of the formulation from 3.5 to 5.5, iontophoretic permeation of MXS was 3-fold restricted, whereas it increased its retention in stratum corneum and hair follicles. These results show that iontophoresis of MXS in these conditions can promote the follicular delivery of the drug quite significantly. A series of chitosan microparticles containing MXS was obtained by spray drying, modifying quantities and proportions of polymer and drug. The system selected for study was obtained from 1.50 g of polymer and 0.75 g of MXS, and showed high encapsulation efficiency (~ 82%), mean diameter of 3.05 µm, spherical morphology without porosities, and zeta potential equal to + 5.87 mV. When incorporated into a hydro ethanolic formulation, these microparticles suffered swelling, increasing 1.5 times its diameter, but their spherical morphology was not modified. Permeation experiments showed in vitro that the microparticles obtained were able to sustain 3.5 times the release of MXS. The microparticles also restricted the passive permeation of the drug, reducing 2-fold its permeation flux and increasing by 5-fold the retention of drug in the follicular region, although the microparticles themselves did not penetrate the skin after passive administration. Thus, this system was able to promote a more sustained release of the drug, which must reduce the number of product applications by the patient throughout the day, and ensured the entry of large amounts of drug in hair follicles, their target. Iontophoresis of microparticles, although not making them penetrate the skin either, was able to direct them quickly to the follicular openings, as shown by laser confocal scanning microscopy studies of the labeled microparticles. In addition, iontophoresis increased 6-fold the amount of MXS retained in the follicles within the first 3 h of application, thereby ensuring that large quantities of the drug achieved its site of action more quickly than when the particles were applied passively to the skin.

A anestesia local da cavidade bucal é uma etapa fundamental na maioria dos procedimentos odontológicos. A administração não-invasiva efetiva de anestésicos locais na cavidade bucal visando substituir as doloridas injeções, possibilitaria o aprimoramento de procedimentos rotineiros e cirúrgicos. No entanto, a anestesia profunda e pelo tempo adequado de regiões estratégicas da mucosa bucal requer a penetração do anestésico em quantidades efetivas. A combinação dos cloridratos de lidocaína (LCL) e prilocaína (PCL) é uma estratégia interessante do ponto de vista farmacocinético, visto que a lidocaína inicia sua ação mais rapidamente, porém a prilocaína apresenta uma potência maior. A velocidade de liberação e permeação dos fármacos pode ser aumentada e modulada através da aplicação da iontoforese. O objetivo deste trabalho foi avaliar in vitro a influência da iontoforese na permeação de PCL e LCL através de mucosa esofageal suína a partir de uma formulação semi-sólida mucoadesiva. Para tanto, um hidrogel à base de hidroxipropilmetilcelulose foi desenvolvido e o efeito do pH (5,8 e 7,0) avaliado em função da iontoforese (1 mA/cm2 por 60 minutos). Um método analítico de cromatografia líquida de alta eficiência foi validado para quantificação simultânea dos fármacos, apresentando satisfatória seletividade, linearidade no intervalo de 0,25 a 10 ?g/mL, sensibilidade, precisão, exatidão e robustez. A recuperação dos fármacos a partir da mucosa esofageal suína forneceu níveis adequados conforme preconizado pela literatura. A formulação desenvolvida apresentou uniformidade de conteúdo e propriedades mecânicas e mucoadesivas adequadas para a aplicação bucal. A combinação dos fármacos na formulação não ocasionou a formação de uma mistura eutética, porém promoveu mudanças nos coeficientes de distribuição mucosa/formulação do PCL, tendo maior caráter hidrofílico em pH 7,0 e maior caráter hidrofóbico em pH 5,8. Nos estudos de permeação in vitro através de mucosa esofageal suína, a iontoforese a partir da formulação pH 7,0 foi capaz de aumentar as quantidades de PCL permeada e recuperada da mucosa quando isolada e combinada na formulação. Porém, as quantidades de LCL foram aumentadas por iontoforese apenas na mucosa quando combinada ao PCL. A iontoforese a partir da formulação contendo os fármacos isolados em pH 5,8, com o intuito de promover maior ionização dos fármacos, aumentou o fluxo do PCL e do LCL. No entanto, o fluxo passivo foi menor em pH 5,8 e o maior aumento de fluxo proporcionado pela iontoforese neste pH não acarretou em maiores quantidades de fármaco permeadas. O pré-tratamento da mucosa com LCL aumentou ligeiramente o fluxo passivo do PCL, porém quando a iontoforese foi aplicada, tanto o fluxo quanto o acúmulo do PCL na mucosa diminuíram após o pré-tratamento. Assim, para a anestesia não invasiva em procedimentos odontológicos, é recomendável aplicar a iontoforese diretamente na formulação que contém a combinação de PCL e LCL, em pH 7,0. Desta forma, alia-se início de ação mais rápido (LCL) e potência (PCL) e alcançam-se maiores quantidades permeadas e retidas na mucosa para ambos os fármacos. / Local anesthesia of the oral cavity is a key step in most dental procedures. The effective non-invasive administration of local anesthetics in the oral cavity, in order to replace the painful injections, would enable the improvement of routine and surgical procedures. However, deep anesthesia for a suitable period of time of strategic regions of the oral mucosa requires penetration of the anesthetic in effective amounts. The combination of lidocaine hydrochloride (LCL) and prilocaine (PCL) is an interesting strategy, since lidocaine begins to act more quickly, but prilocaine has a higher potency. The rate of release and permeation of drugs can be enhanced and modulated by the application of iontophoresis. The objective of this study was to evaluate in vitro the influence of iontophoresis on the permeation of PCL and LCL through porcine esophageal mucosa from a mucoadhesive semisolid formulation. Thus, a hydroxypropyl methylcellulose hydrogel was developed and the effect of pH (5.8 and 7.0) evaluated in function of iontophoresis (1 mA/cm2 for 60 minutes). An analytical method of high performance liquid chromatography was validated for the simultaneous quantification of drugs with satisfactory selectivity, linearity in the range 0.25 to 10 ?g/mL, sensitivity, precision, accuracy and robustness. The recovery of the drugs from the porcine esophageal mucosa provided adequate levels, as related in the literature. The formulation developed had uniformity of content and mechanical and mucoadhesive properties suitable for buccal application. The combination of the drugs at the formulation did not cause the formation of an eutectic mixture, but provided changes in the distribution coefficients (mucosa/formulation) of PCL, having greater hydrophilicity at pH 7.0 and higher hydrophobic character at pH 5.8. Regarding the in vitro permeation studies across porcine esophageal mucosa, iontophoresis from the formulation at pH 7.0 was able to increase the amounts of PCL permeated and recovered when isolated and combined at the formulation. For LCL, the amount was enhanced by iontophoresis only at the mucosa when the drug was associated with PCL. Iontophoresis from the formulation at pH 5.8, in order to promote higher ionization of the drugs, increased the flow of PCL and the LCL. However, the passive flux was lower at pH 5.8 and the greater increase of flow provided by iontophoresis at this pH did not result in higher amounts of total permeated drug. Pretreatment of the mucosa with LCL slightly increased passive flux of PCL, but when the iontophoresis was applied, both the flow and the amount of PCL recovered from the mucosa decreased after pretreatment. Thus, for a non-invasive anesthesia for dental procedures, it is recommended to apply iontophoresis directly at the formulation containing the combination of PCL and LCL, at pH 7.0. Therefore, it combines a faster onset of action (LCL) and higher potency (PCL), providing larger amounts permeated and recovered from the mucosa for both drugs.

A Doxorrubicina (DOX) é um dos antineoplásicos mais utilizados no tratamento de tumores sólidos, como os de pele. Sua baixa penetração cutânea e instabilidade frente aos tecidos biológicos impedem, no entanto, sua aplicação tópica e localizada. Dentro deste contexto, o objetivo deste trabalho foi direcionar e aumentar a penetração cutânea da DOX, além de protegê-la contra eventuais degradações na pele, através do desenvolvimento de nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) contendo DOX e da aplicação da iontoforese. As NLS foram obtidas pelo método da Microemulsão (ME), vertendo-as em excesso de água gelada e agitando o sistema vigorosamente. Foram obtidas NLS com cargas superficiais negativas (NLS-N) e NLS com cargas superficiais positivas (NLS-P). As NLS-N eram compostas por ácido esteárico, lecitina de soja, taurodeoxicolato de sódio e água. E as NLS-P por um derivado do colesterol e/ou ácido esteárico, poloxamer, cloreto de cetilpiridínio e água. As NLS com tamanho de partícula, polidispersividade e potencial zeta adequados para os estudos de permeação cutânea e celular foram definidas a partir de um planejamento fatorial completo (32). NLS-N e NLS-P selecionadas foram incorporadas com 8% de DOX e utilizadas nos estudos de permeação e citotoxicidade. O tamanho médio da NLS-N foi de 175 nm (PdI 0,278) e da NLS-P 278 nm (PdI 0,357). A eficiência de encapsulação foi de 90 e 61% para as NLS-N e NLS-P, respectivamente. Estudos de localização celular foram realizados e observou-se que as NLS-N permitiram a penetração da DOX tanto no citoplasma quanto no núcleo das células, assim como as NLS-P que também permitiram a penetração da DOX em um maior número de células tumorais. Estudos de estabilidade mostraram que a DOX encapsulada nas NLS foi estável a 4º C por até 48 h, sendo que as NLS liofilizadas foram estáveis por pelo menos 30 dias. Nos estudos de liberação da DOX das NLS observou-se que estas sustentaram a liberação da DOX. Porém, as NLS-P liberaram a DOX mais rapidamente do que as NLS-N, 40 e 25% em 72 horas, respectivamente. Nos estudos de permeação cutânea, observou-se que as NLS aumentaram significativamente a quantidade de DOX na solução receptora e na epiderme viável quando comparada com soluções de DOX. As NLS parecem penetrar/fundir na pele carregando o fármaco para camadas profundas da pele, diminuindo sua interação com o estrato córneo. A aplicação da corrente elétrica na dispersão de NLS aumentou a penetração das partículas na pele e, conseqüentemente, a penetração da DOX. As cargas superficiais das NLS positivas e negativas não influenciaram na sua penetração por iontoforese. Estudos de determinação do fluxo eletrosmótico com paracetamol mostraram que o principal mecanismo para a entrada das partículas na pele é o eletrosmótico e não o eletrorrepulsivo (proveniente das cargas). As NLS-P diminuíram o fluxo eletrosmótico significativamente, neutralizando as cargas negativas da pele e evidenciando a penetração das partículas neste tecido. Foram realizados estudos de citotoxicidade da DOX em diferentes formulações, em células B16F10 e em A431, e foi observado que a DOX encapsulada nas NLS-N é significativamente mais citotóxica do que as outras formulações, atingindo uma citotoxicidade de 100% quando em contato com as células de melanoma após apenas 6 h de incubação em concentrações superiores a 20 ng/mL. A aplicação de corrente elétrica em cultura de células aumentou também a penetração do fármaco nas células tumorais e, conseqüentemente, sua citotoxicidade. A indução dos tumores in vivo não se mostrou viável para o modelo de camundongos sem pêlo utilizado, porém o tratamento iontoforético demonstrou-se viável. / Doxorubicin (DOX) is one of the most used antineoplastic drug to treat solid tumors, such as skin cancer. Its low penetration into the skin and its instability in biological tissues, however, difficult topical and localized application. Within this context, the aim of this work was to increase DOX penetration into the skin, and to protect the drug against possible skin degradation, through the development of solid lipid nanoparticles (SLN) and the application of iontophoresis. The standardization and validation of two methodologies for the DOX quantification was performed: one of them using an UV/Vis spectrophotometer and the other using the HPLC. Both methods showed suitable linearity, sensibility, selectively, precision and accuracy, according to the in vigor specifications. SLN was obtained by microemulsion (ME) method spilling them into an excess of water with vigorously shaking. SLN were obtained with negative surface charge (SLN-N) and SLN with positive surface charge (SLN-P). SLN-N contained stearic acid, soy lecithin, sodium taurodeoxicolate, water and SLN-P containing compritol and / or stearic acid, poloxamer, sodium chloride, water. Particle size, polydispersity and zeta potential suitable for studies of skin permeation and cell were defined from a complete factorial design (32). The average size of the SLN-N was 175 nm (PdI 0.278) and the SLN-P 278 nm (PdI 0.357). The encapsulation efficiency was 90, and 61% for SLN-N and SLN -P, respectively. Studies of cellular location were made and showed that the SLN -N allowed the penetration of DOX in the cytoplasm and the nucleus of cells, as well as SLN -P that also allowed the penetration of DOX in a larger number of tumor cells. Encapsulated DOX in the SLN was stable at 4° C for 48 hours, and freeze-dried SLN are stable for at least 30 days. In release studies with DOX-SLN was observed that they control DOX release. However, SLN-P DOX release more quickly than SLN-N, 40 and 25% in 72 hours, respectively. In skin permeation studies, it is observed that SLN significantly increase the amount of DOX in the receiver compartment and in the epidermis. It seems that SLN penetrate / merge the skin carrying the drug to the deep skin layers, reducing its interaction with the stratum corneum. The application of an electrical current increased DOX permeation into the skin, and consequently, DOX penetration. SLN superficial charges do not influence DOX permeatation with iontophoresis. Electrosmotic flow studies showed DOX permeates into the skin mostly for eletrosmose mechanism. Cytotoxicity studies were performed with DOX in different formulations in B16F10 and A431 cells, and it was observed that DOX encapsulated in the SLN-N is significantly more cytotoxic than the other formulations, achieving 100% of cytotoxicity when in contact with the melanoma cells after 6 hours of incubation at concentrations above 20 ng/mL. The application of an electrical current in cell culture also increased the penetration of the drug in tumor cells and, consequently, its cytotoxicity. The induction of tumors in vivo was not feasible for hairless mice, but the iontophoretic treatment demonstrated to be feasible.

A imunização transcutânea (IT) é uma técnica promissora de vacinação, na qual a formulação contendo o antígeno é aplicada sobre a pele para induzir resposta imune. O sucesso desse tipo de imunização ocorre devido à presença de células apresentadoras de antígenos (APCs) na epiderme viável, as quais são potentes estimuladoras de linfócitos T. Porém, é necessário que o antígeno transponha a barreira imposta pelo estrato córneo e atinja a epiderme viável em concentrações adequadas para que uma resposta imune efetiva seja induzida. Neste trabalho, a influência da iontoforese, método físico que utiliza uma corrente elétrica fraca para aumentar a penetração cutânea de fármacos, foi investigada pela primeira vez na IT. Sua associação com lipossomas, para direcionar a liberação do antígeno para a epiderme viável, e com nanopartículas de prata (NPAg), para potencializar a resposta imune, também foi avaliada pela primeira vez. A ovalbumina (OVA) foi utilizada como antígeno modelo e a injeção subcutânea de OVA como controle positivo da imunização. Foram obtidos lipossomas aniônicos contendo 5 mg/mL de OVA e catiônicos contendo 0,25 mg/mL de OVA, adicionados ou não de NPAg. Os lipossomas aniônicos apresentaram tamanho médio de aproximadamente 120 nm e eficiência de encapsulação da OVA de 78,4%. Os lipossomas catiônicos apresentaram tamanho médio de aproximadamente 260 nm e eficiência de encapsulação da OVA de 83,08%. A adição das NPAg não alterou significativamente o tamanho dos lipossomas, mas alterou o potencial zeta (de -7,5 mV para -14 mV para os lipossomas aniônicos e de +41 mV para +36 mV para os lipossomas catiônicos). As microscopias de força atômica e eletrônica de transmissão (MET) confirmaram a presença de vesículas lipossomais, sendo que a TEM mostrou as NPAgs dispersas no meio aquoso externo dos lipossomas aniônicos e no meio aquoso interno dos lipossomas catiônicos. A OVA e os lipossomas se mostraram estáveis ao processo de obtenção e frente a corrente elétrica. Nos estudos de penetração cutânea in vitro observou-se que a encapsulação da OVA nos lipossomas direcionou sua liberação para a epiderme viável. A associação com a iontoforese aumentou 108 vezes a liberação da OVA na epiderme viável quando lipossomas aniônicos contendo NPAg foram administrados e 92 vezes quando lipossomas catiônicos contendo NPAg foram administrados. A presença das NPAg nas formulações aumentou a quantidade de OVA na epiderme viável quando a iontoforese foi utilizada, mas diminuiu sua penetração passiva. As quantidades de OVA penetradas por iontoforese anódica e catódica a partir dos lipossomas aniônicos não foram significativamente diferentes. O coeficiente de penetração da OVA na epiderme viável a partir da iontoforese dos lipossomas aniônicos foi 1,6 vezes (na ausência de NPAg) e 39 vezes (na presença de NPAg) maior do que o dos lipossomas catiônicos. Nos experimentos de imunização transcutânea in vivo observou-se que as quantidades de OVA que penetraram a pele por iontoforese foram suficientes para induzir resposta imune humoral semelhante a induzida pela injeção subcutânea da OVA para os lipossomas aniônicos, na presença e ausência de NPAg, e para o lipossoma catiônico apenas na presença da NPAg, sugerindo que as NPAg, na presença de baixas concentrações de OVA, funcionam como adjuvantes imunológicos. A iontoforese anódica das formulações, assim como a injeção subcutânea da OVA, não estimularam resposta imune celular significativa. A iontoforese catódica, no entanto, induziu tanto resposta humoral como celular, além de estimular a produção de INF-? e o recrutamento de células apresentadoras de antígeno, tanto no baço como nos linfonodos inguinais. Sendo assim, a iontoforese de lipossomas contendo OVA e NPAg foi capaz de direcionar a liberação da OVA para a epiderme, induzir altos títulos de anticorpos IgG1 e ainda ativar a resposta imune celular, sendo uma estratégia promissora para a IT. / Transcutaneous immunization (TI) is a promising strategy for vaccine in which the antigen-containing formulation is applied to the skin to induce immune response. The success of this type of immunization occurs due to the presence of antigen presenting cells (APCs) in the viable epidermis, which are potent stimulator of T lymphocytes. However, the antigen should transpose the barrier imposed by the stratum corneum to reach the viable epidermis in appropriate concentrations so that an effective immune response is induced. In this work, the influence of iontophoresis, a physical method that uses a weak electrical current to increase skin penetration of drugs, was investigated for the first time in TI. Its association with liposomes, to target the antigen release to the viable epidermis, and with silver nanoparticles (NPAg), to enhance the immune response, was also evaluated for the first time. Ovalbumin (OVA) was used as a model antigen and OVA subcutaneous injection as a positive control of immunization. Anionic and cationic liposomes containing 5 mg/ml and 0.25 mg/mL of OVA, respectively, were obtained and were added or not by NPAg. Anionic liposomes had an average size of approximately 120 nm and 78,4% OVA encapsulation efficiency. Cationic liposomes had an average size of approximately 260 nm and 83,08% OVA encapsulation efficiency. The addition of NPAg did not significantly alter the size of the liposomes, but changed the zeta potential (-7.5 mV to - 14 mV for anionic liposomes and +41 mV to +36 mV for cationic liposomes). The atomic force microscopy and transmission electron microscopy (TEM) confirmed the presence of liposomal vesicles; TEM showed NPAgs dispersed in the external aqueous medium of the anionic liposomes and in the internal aqueous medium of the cationic liposomes. The OVA and the liposomes were stable during the preparation process and in front of the electric current. In the in vitro skin penetration studies it was observed that the encapsulation of OVA into liposomes directed their release to the viable epidermis. The association with iontophoresis increased 108-fold the release of OVA in the viable epidermis when anionic liposomes containing NPAg were administered and 92-fold when cationic liposomes containing NPAg were administered. The presence of NPAg in the formulations increased the amount of OVA released in the viable epidermis when iontophoresis was applied, but decreased OVA passive penetration. The amount of OVA penetrated by anodic and cathodic iontophoresis of anionic liposomes was similar. The OVA penetration coefficient in the viable epidermis from the iontophoresis of anionic liposomes was 1.6-fold (in the absence of NPAg) and 39- fold (in the presence of NPAg) greater than the iontophoresis of cationic liposomes. In transcutaneous immunization in vivo experiments, it was observed that the amount of OVA that penetrated the skin by iontophoresis was sufficient to induce similar humoral immune response than that induced by subcutaneous injection of OVA when anionic liposomes, in the presence and absence of NPAg, and cationic liposome, only in the presence of NPAg, were administered. These results suggest that NPAg in the presence of low concentrations of OVA acted as immunological adjuvants. Altough induced humoral immune response; anodal iontophoresis of the formulations as well as subcutaneous injection of OVA did not stimulate significant cellular immune response. Cathodic iontophoresis, on the other hand, induced both humoral and cellular immune response, as well as stimulating the production of IFN-? and the recruitment of antigen presenting cells, both in spleen and in inguinal lymph nodes. Therefore, iontophoresis of liposomes containing OVA and NPAg was able to target the release of OVA to the epidermis, induce high titers of IgG1 and activate the cellular immune response, being a promising strategy for TI.

A ceratite fúngica é uma doença grave que pode levar à perda da visão. O tratamento consiste na aplicação de antifúngicos, no entanto a administração tópica não tem se mostrado efetiva devido aos mecanismos de defesa do olho que levam à baixa retenção da formulação no local de aplicação e à baixa permeação do fármaco através da córnea. Sendo assim, formulações mais adequadas e sistemas de liberação vêm sendo estudados na tentativa de melhorar a biodisponibilidade local de antifúngicos. No presente trabalho foram obtidos e caracterizados dois sistemas para a liberação ocular do fluconazol (FLU), um antifúngico de atividade reconhecida: um gel termorreversível in situ e micropartículas poliméricas. A permeação passiva e iontoforética do fármaco através da córnea foi estudada in vitro a partir dos sistemas desenvolvidos. O gel termorreversível in situ contendo 16% de poloxamer e 1,0% de quitosana apresentou temperatura de geleificação adequada, propriedades mucoadesivas, melhores parâmetros mecânicos (dureza, compressibilidade e adesividade) que ambos os polímeros separadamente e mostrou-se superior que micropartículas poliméricas, com fluxo de permeação passiva cerca de duas vezes maior. A maior quantidade de fármaco retido na córnea foi obtida após aplicação da iontoforese em solução aquosa do fármaco. Ainda assim, o fluxo iontoforético do FLU não foi significativamente diferente do fluxo passivo a partir do gel termorreversível. O desempenho in vivo desta formulação foi então avaliado em modelo animal. Estudos de permeação, utilizando a técnica de microdiálise para amostragem da câmara anterior, confirmaram a maior biodisponibilidade do fármaco. Por fim, exames de cintilografia em humanos confirmaram maior tempo de retenção na superfície ocular. Portanto, o gel termorreversível in situ obtido e caracterizado no presente trabalho e a iontoforese, representam sistemas promissores para a liberação ocular tópica do FLU. O primeiro possui características promotoras de permeação, prolongado tempo de retenção e facilidade de obtenção e administração, e o segundo é capaz de promover maior retenção do fármaco na córnea. / Fungal keratitis is a serious disease that can lead to loss of sight. The treatment consists in antifungal application; however topical administration has not shown to be effective due to defense mechanisms of the eye, which leads to low retention at the application site and low permeation of the drug trough the cornea. In this way, more suitable formulations and delivery systems have been studied in an attempt to increase local availability of antifungal agents. At the present work it was obtained and characterized two systems for the passive and iontophoretic ocular delivery of fluconazole (FLU), a well known antifungal agent: an in situ forming gel and polymeric microparticles. Passive and iontophoretic drug permeation across the cornea was studied in vitro from the developed systems. The in situ forming gel containing 16% of poloxamer and 1.0% of chitosan presented more adequate gelation temperature, mucoadhesive properties, improved mechanical parameters (strength, compressibility and adhesiveness) than both polymers separately and showed to be superior to the polymeric microparticles, with passive permeation flux almost twice higher. The greatest amount of drug retained in the cornea was achieved after iontophoresis application using an aqueous solution of the drug. Even though, the iontophoretic drug flux was not significantly different from the passive drug flux using the in situ forming gel. The in vivo performance of this formulation was then evaluated in an animal model. Permeation studies, using the microdialysis technique for the anterior chamber sampling, confirmed the increased drug availability. At the end, scintigraphy exams in humans confirmed the greater retention time at the ocular surface. Therefore, the in situ forming gel obtained and characterized at the present work and iontophoresis, represent promising systems for the topical ocular delivery of FLU. The first possess permeation enhancement properties, prolonged retention time and facility of obtention and administration, and the second is capable of promoting higher drug retention in the cornea.