En premier lieu, l'horloge circadienne des mammifères joue un rôle fondamental dans le foie en régulant le métabolisme des acides gras, du glucose et des xénobiotiques. L'altération de ce rythme a été montrée comme menant à diverses pathologies incluant le syndrome métabolique. Il est supposé que l'horloge circadienne régule principalement le métabolisme en régulant l'expression des enzymes hépatiques au niveau transcriptionnel. Nous montrons que l'horloge circadienne contrôle au ssi le métabolisme hépatique en synchronisant un rythme secondaire d'une période de 12 heures caractérisé par l'activation rythmique de la voie IRE1a dans le RE. L'absence d'horloge circadienne perturbe cette horloge secondaire et provoque une dérégulation des enzymes localisées dans le RE. Cela mène à une altération du métabolisme lipidique, résultant en une activation aberrante du facteur de transcription SREBP. Cette altération dans le métabolisme lipidique circadien chez les souris sans horloge pourrait être impliquée dans l'apparition du syndrome métabolique. D'autre part, la croissance cellulaire animale est principalement régulée par la détection des nutriments et est principalement médiée par la voie TOR. Chez la souris, un gène est identifié pour la kinase TOR et son association en complexe avec d'autres protéines permet de discriminer TORC1 et TORC2. TORC1 est la forme majeure sensible à la rapamycine et est le premier médiateur de la détection d'énergie et d'acides aminés pour le contrôle de la croissance. Ce contrôle consiste en la régulation de la traduction par la phosphorylation de S6 Kinase et 4E-BP et le contrôle de la biogenèse des ribosomes. Nous sommes intéressés de montrer si l'horloge circadienne régule la traduction régulée par TOR dans le foie de souris. / In one hand, The mammalian circadian clock plays a fundamental role in the liver by regulating fatty acid, glucose, and xenobiotic metabolism. Impairment of this rhythm has been shown to lead to diverse pathologies, including metabolic syndrome. Currently, it is supposed that the circadian clock regulates metabolism mostly by regulating expression of liver enzymes at the transcriptional level. We show that the circadian clock also controls hepatic metabolism by synchronizing a secondary 12 hr period rhythm characterized by rhythmic activation of the IRE1a pathway in the endoplasmic reticulum. The absence of circadian clock perturbs this secondary clock and provokes deregulation of endoplasmic reticulum localized enzymes. This leads to impaired lipid metabolism, resulting in aberrant activation of the sterol-regulated SREBP transcription factors. The resulting aberrant circadian lipid metabolism in mice devoid of the circadian clock could be inv olved in the appearance of the associated metabolic syndrome.In a second hand, the tissue growth in animals is principally regulated by nutrient sensing and principally by the protein kinase TOR. In mice one gene is identified as TOR kinase and the association of Tor protein associated with 2 different complex of protein (TORC1 and TORC2). TORC1 is the major rapamycin sensitive form and is the primary mediator of energy and amino acid sensing for growth control. This control consists in the regulation of translation through the phosphorylation of S6 Kinase (ribosomal S6 kinase) and 4E-BP (Eif4E binding protein) and the control of ribosome biogenesis. We are interested to show if the circadian clock regulate TOR translation regulation in mice liver.

Le Réticulum endoplasmique (RE) est le premier compartiment intracellulaire traversé par les protéines sécrétées. Au sein de cet organite, les protéines acquièrent une conformation native, et subissent de nombreuses modifications post-traductionnelles telles que la N-glycosylation ou la formation de ponts disulfures. Dans certaines conditions (stress réducteurs, hypoxie, privation en glucose…) des protéines anormalement conformées s’accumulent au sein du RE ce qui conduit à l’induction de l'Unfolded Protein Response (UPR). Cette réponse va alors tout d’abord induire l’inhibition de la traduction, ce qui limite l’entrée de nouvelles protéines dans le RE. En parallèle, un programme transcriptionnel spécifique conduit à l’augmentation de l’expression de protéines impliquées dans le repliement et la dégradation des protéines accumulées dans la lumière du RE. Cette réponse adaptative intégrée est contrôlée principalement par 3 protéines transmembranaires du RE : PERK (PKR-related ER kinase), ATF6 (Activating transcription factor) et enfin IRE1 (Inositol requiring kinase 1) sur laquelle porte notre étude. Au cours de ma thèse, j’ai tout d’abord participé à une étude démontrant que l’activation des voies de signalisation dépendantes d’IRE1 contribuait à la surexpression du VEGF-A in vitro et régulait l’angiogenèse et la croissance tumorale in vivo dans un modèle de greffe orthotopique de cellules U87 dérivées de gliomes humains. Cette protéine pourrait donc constituer une cible thérapeutique potentielle. Ces résultats nous ont par conséquent amenés à identifier des modulateurs de l’activité de la protéine IRE1. Pour cela nous avons développé un test in vitro permettant d’évaluer l’étape essentielle dans l’activation de la protéine IRE1, sa dimérisation. Ce test nous a permis d’identifier un peptide capable d’interférer dans la formation des dimères de la protéine IRE1, mais aussi et de façon inattendue, d’accroître son activité endoribonucléase in vitro et in vivo. Ainsi, nous proposons que ce peptide interfacial issu du domaine kinase de la protéine IRE1 pourrait promouvoir un changement conformationnel du domaine cytosolique de la protéine entière et par conséquent, potentialiserait de façon significative son activité endoribonucléasique. Ce modulateur identifié pourrait donc représenter un nouvel outil à potentiel thérapeutique utilisable par exemple dans des maladies conformationnelles. / The endoplasmic Reticulum (ER) is the first intracellular compartment encountered by secretory proteins. In this organelle proteins acquire their correct conformation and undergo many post-translational modifications such as N-glycosylation or disulphide bond formation. Under specific environmental conditions (reductive stress, hypoxia, glucose deprivation …), protein folding is perturbed and uncorrectly folded proteins accumulate in the lumen of the ER. This leads to the activation of an adaptive response named the Unfolded Protein Response (UPR). The UPR consists in an attenuation of protein translation and an activation of a specific transcriptional program. This integrated adaptive response is mediated by 3 transmembrane ER resident proteins: PERK (PKR-related ER kinase), ATF6 (Activating transcription Factor) and IRE1 (Inositol requiring kinase 1) and we focused more particularly on IRE1. During my PhD thesis, I participated to a study that demonstrated the role of IRE1 signaling in the regulation of VEGF expression in vitro and tumor growth and angiogenesis in vivo. The latter was carried out using a ortotopic implantation model of human glioma-derived cells. As a consequence IRE1 could certainly constitute a potential therapeutic target. In an attempt to modulate IRE1 activity, we aimed at identifying artificial modulators of its activity. To this end, we designed an in vitro assay capable of monitoring the first essential step in IRE1 activation process, namely its dimerization. This assay allowed us to identify a peptide able to interfere with IRE1 dimer formation, but, unexpectedly, to also increase its RNAse activity in vitro and in vivo. We propose that this interfacial peptide, derived from IRE1 kinase domain could promote a conformational change in IRE1 cytosolic domain and consequently lead to an increase in its enzymatic activity. This modulator could represent a new tool with therapeutic potential that could then be used in protein misfolding diseases for instance.

Plusieurs arguments de la littérature suggèrent l’importance de l’alimentation dans le développement tumoral et l’efficacité des traitements anti-cancereux. Dans différents modèles animaux, la restriction calorique (CR) supprime la prolifération des cellules tumorales et les sensibilise aux thérapies ciblées. Par conséquent, des approches non-pharmacologiques comme la restriction calorique ont un intérêt grandissant en clinique. Considérant l’addiction des cellules tumorales aux nutriments, nous nous sommes demandé quels macronutriments pouvaient avoir des propriétés anticancéreuses. A partir d’un modèle murin de lymphomes B (modèle transgénique Eµ-Myc) nous avons testé l’impact de deux régimes alimentaires : l’un pauvre en glucides (Low CHO, 25% de réduction en glucides) et l’autre pauvre en protéines (Low PROT, 25% de réduction en protéines). Des souris syngéniques C57BL/6 ont été injectées par voie intraveineuse avec des cellules primaires Eμ-Myc. Malgré un apport alimentaire équivalent entre les groupes, nous avons observé que le régime pauvre en protéines augmente la survie globale des souris C57BL/6 développant un lymphome B Eµ-Myc. De manière intéressante, nous avons démontré que cet effet pro-survie est dépendant du système immunitaire. En effet, la déplétion des cellules T CD8+ ou l’utilisation d’un modèle murin immunodéficient NSG (NOD-SCID il2rγ), empêche l’effet bénéfique du régime pauvre en protéines sur le développement tumoral. Nous avons reproduit et étendu nos observations en utilisant des lignées modèles de cancéreuses colorectaux (CT26) et de mélanome (B16) injectée dans des souris syngéniques, immunocompétente. Les cellules tumorales étant fortement dépendantes des nutriments, nous avons émis l’hypothèse qu’un régime pauvre en protéines pourrait induire un stress du réticulum endoplasmique (RE) dans ces dernières. En effet, nous avons observé une augmentation des protéines impliquées dans la signalisation du RE : CHOP et sXBP1. Par conséquent, nous avons traité les souris nourries en régime pauvre en protéines avec deux inhibiteurs du stress du RE : TUDCA, inhibiteur générique et MKC4485 qui cible l’activité ribonucléase d’IRE1. Dans les deux cas, ces inhibiteurs ont bloqué l’effet du régime faible en protéines sur le développement tumoral et l’infiltration des T CD8+ au sein de la tumeur. Pour s’affranchir, des potentiels effets secondaires des inhibiteurs chimiques, nous avons invalidé IRE1 dans la lignée CT26 et nous avons obtenus des résultats similaires, démontrant que la voie IRE1 dans les cellules tumorales est une voie centrale dans la réponse immunitaire anticancéreuse induite par un régime pauvre en protéines. En outre, nous avons découvert que l’activation de RIG-I est un événement en aval de l’activation d’IRE1 et que, par analyse bio-informatique nous avons pu corréler une signature IRE1 à une infiltration immunitaire élevée et à une immunogénicité accrue du cancer chez les patients atteints de mélanome, glioblastome et cancer colorectal. De ce fait, nous avons démontré que la réponse du système immunitaire induite par un régime pauvre en protéines est une conséquence de l’activation accrue de IRE1 dans les cellules cancéreuses. / Several arguments from the literature suggested the importance of diets in cancer development and in the efficacy of anti-cancer therapies. Calorie restriction (CR) suppresses cancer growth in various animal models and sensitizes tumor cells to targeted therapies (Meynet & Ricci, 2014). Thus, non-pharmacologic approaches such as CR have a growing interest in the clinic. Considering the nutrient addiction of cancer cells, we wondered which specific macronutrients contribute the most to anti-cancer effects. Therefore, we tested the reduction in specific macronutrient without decrease in general calorie intake on tumor development. We used two diets: reduced in carbohydrates (Low CHO, -25% carbohydrates) and diet reduced in protein (Low PROT, -25% proteins) on the Eµ-Myc transgenic mouse model of B-cell lymphoma. Syngeneic C57BL/6 mice were intravenously injected with primary Eμ-Myc cells. We observed that low PROT-diet, in spite of equal calorie intake among the groups, resulted in increase of the overall survival of Eµ-Myc-bearing C57BL/6 mice. Very importantly, we established that this pro-survival effect is immune system-dependent as both depletion of CD8+ T cells and use of immunodeficient NSG (NOD-SCID il2rγ) mouse model prevented the beneficial effect of the low PROT-diet on the tumor development. We reproduced and further extended our observations using subcutaneous injection of CT26 colorectal cancer cells in syngeneic immunocompetent BALB/c mice and B16 melanoma in C57BL/6 mice. As tumor cells are highly dependent on nutrients, we speculated that low PROT diet could induce ER stress in tumor cells. Indeed, we observed increase in proteins implicated in ER stress signaling – CHOP and sXBP1. Therefore, we treated low PROT-diet fed mice with two ER stress inhibitors, the general inhibitor TUDCA or MKC4485, which targets IRE1 RNAse activity. In both cases, inhibitors significantly prevented the effect of the Low PROT-diet on tumor development and on intratumoral number of CD8+ T cells. To eliminate any side effects of chemical inhibitors, we invalidated IRE1 in CT26 cells and obtained similar results, demonstrating that IRE1 signaling in tumor cells is a central event in the low PROT-diet induced anti-cancer immune response. In addition, we have uncovered RIG-I activation as a downstream event of IRE1 activation and by bioinformatic analysis correlated high-IRE1 signature with high immune infiltration and enhanced immunogenicity of cancer in patients bearing melanoma, glioblastoma and colorectal cancer. Hence, we have shown that the immune system response elicited under a Low PROT diet is a consequence of increased IRE1 activation in cancer cells.

Les réseaux vasculaires et nerveux présentent des similitudes frappantes (points de branchements, superposition, voies afférentes/efférentes, …) et tous deux interagissent lors du développement ou dans le cadre de pathologies.Dans un premier projet, nous avons voulu déterminer si un facteur pro-angiogénique, c'est-à-dire induisant la formation de nouveaux vaisseaux, peut avoir un effet direct sur le réseau neuronal. Des études menées in vitro ou in vivo chez l’adulte, ont montré une implication directe du Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) sur le système nerveux (survie, prolifération neuronale, croissance axonale, …). Nous avons cherché à savoir si ce facteur a un effet sur le développement ou l’activité des réseaux neuronaux lors de la vie embryonnaire alors que les systèmes vasculaires et nerveux se mettent progressivement en place. Avec une approche électrophysiologique, nous avons focalisé notre attention sur les motoneurones de la moelle épinière de souris entre les stades E13,5 et P0. Nos résultats montrent que le VEGF augmente de façon significative la fréquence des activités synaptiques liées à la libération de GABA et de Glycine pendant une fenêtre temporelle correspondant à la mise en place de ces mêmes activités (E13,5 et E15,5). Cet effet modulateur met en évidence un nouveau rôle du VEGF dans la maturation fonctionnelle des réseaux neuronaux et ouvre de nouvelles perspectives dans l’étude des neurodégénérescences précoces. Dans un second projet, nous nous sommes intéressés au glioblastome, cancer cérébral très invasif. Nous montrons que l’inhibition d’IRE1 (Inositol Requiring-Enzyme 1, senseur du stress du réticulum endoplasmique) dans un modèle d’implantation orthotopique chez la souris induit la formation de tumeurs plus petites, moins vascularisées et plus dispersées avec un meilleur pronostic de survie. Nous observons aussi des altérations du microenvironnement tumoral (matrice extracellulaire, réaction astrocytaire) avec des modifications de l’expression de nombreux facteurs de croissance dont le TGFß. / The nervous and the vascular systems share similarities (branching points, afferent/efferent parts …) and are closely connected during development and pathology.In the first part of this project, we questioned whether the pro-angiogenic key factor VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), which promotes new blood vessels formation, can directly interact with neural networks while nervous and vascular systems are developing. In the present study, using an electrophysiological approach, we focused on the effect of VEGF on embryonic spinal lumbar motoneurons (MNs). Our results demonstrate that VEGF increases the frequency of the GABA/glycinergic events at early developmental stages (E13.5 and E15.5) but not at the perinatal stage E17.5. Our data highlight a new role for VEGF which can control both the maturation of the vascular and neuronal networks and may likely be involved in early MNs degeneration.In the second part, we focused on glioblastoma, the most agressive form of brain cancer. Our results show that inhibition of IRE1 (Inositol Requiring-Enzyme 1, stress sensor of endoplasmic reticulum) leads to formation of smaller, less vascularized, more invasive tumors with a better prognosis. We also observe that tumoral microenvironnement is altered (reactive astrogliosis, extracellular matrix) and expression of several growth factors like TGFß is modified.

When unfolded proteins accumulate in the endoplasmic reticulum (ER), the unfolded protein response (UPR) increases ER protein folding capacity to restore protein folding homeostasis. Unfolded proteins activate UPR signalling across the ER membrane to the nucleus by promoting oligomerisation of IRE1, a conserved transmembrane ER stress receptor. Despite significant research, the mechanism of coupling ER stress to IRE1 oligomerisation and activation has remained contested. There are two proposed mechanisms by which IRE1 may sense accumulating unfolded proteins. In the direct binding mechanism, unfolded proteins are able to bind directly to IRE1 to drive its oligomerisation. In the chaperone inhibition mechanism, unfolded proteins compete for the repressive BiP bound to IRE1 leaving IRE1 free to oligomerise. Currently, these two mechanisms respectively lack compelling in vivo and in vitro evidence required to assess their validity. The work presented here first describes in vivo experiments that identify a role of the ER co-chaperone ERdj4 as an IRE1 repressor that promotes a complex between the luminal Hsp70 BiP and the luminal stress-sensing domain of IRE1α (IRE1LD). This is then built on by a series of in vitro experiments showing that ERdj4 catalyses formation of a repressive BiP-IRE1LD complex and that this complex can be disrupted by the presence of competing unfolded protein substrates to restore IRE1LD to its default, dimeric, and active state. The identification of ERdj4 and the in vitro reconstitution of chaperone inhibition establish BiP and its J-domain co-chaperones as key regulators of the UPR. This thesis also utilises the power of Cas9-CRISPR technology to introduce specific mutations into the endogenous IRE1α locus and to screen for derepressing IRE1α mutations. Via this methodology, two predicted unstructured regions of IRE1 are found to be important for IRE1 repression. Finally, this thesis challenges recent in vitro findings concerning the direct binding mechanism.

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京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(理学) / 甲第22292号 / 理博第4606号 / 新制||理||1661(附属図書館) / 京都大学大学院理学研究科生物科学専攻 / (主査)教授 森 和俊, 教授 緒方 博之, 教授 平野 丈夫 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Science / Kyoto University / DGAM

Fibroproliferative disorders are the leading cause of morbidity and mortality worldwide, with one specific group of fibroproliferative disorders being interstitial lung diseases (ILD). Idiopathic pulmonary fibrosis is the most common ILD; however its pathogenesis is not entirely understood. What is known is that there is repetitive cellular injury preceding the fibrotic remodeling in the lungs that contributes to the irreversible deposition of extracellular matrix (ECM) proteins. Myofibroblasts that accumulate at the site of injury are thought to be the key drivers of ECM deposition and are often associated in the disease. Although it is poorly understood how these immune cells differentiate in the lung, one hypothesis suggests the role of alternatively activated profibrotic macrophages in this process. The data presented in this thesis suggest that there are a presence of UPR and macrophage proteins in the lungs of IPF patients and the UPR may be necessary in the polarization of alternatively activated macrophages. / Thesis / Master of Science (MSc)

We have identified a novel Cyclin, called Cyclin O, which is able to bind and activate Cdk2 in response to intrinsic apoptotic stimuli. We have focused on the study of Cyclin Oα and Cyclin Oβ, alternatively spliced products of the gene. Upon treatment with different stress stimuli, transfected Cyclin Oα accumulates in dense aggregations in the cytoplasm compatible with being Stress Granules (SGs). Furthermore, we have seen that Cyclin Oβ and a point mutant of the N-terminal part of the protein constitutively localize to the SGs. Although both alpha and beta isoforms are proapoptotic, only Cyclin Oα can bind and activate Cdk2. On the other hand, we have demonstrated that Cyclin O is upregulated by Endoplasmic Reticulum (ER) stress and is necessary for ER stress-induced apoptosis. Cyclin O activates specifically the PERK pathway and interacts with the PERK inhibitor protein p58IPK. Moreover, Cyclin O participates in the activation of other eIF2α kinases. We have also observed that a pool of Cyclin O is located in active mitochondria, suggesting a function of the protein linked to oxidative metabolism.Hemos identificado una nueva Ciclina, llamada Ciclina O, que es capaz de unirse y activar Cdk2 en respuesta a estímulos apoptóticos intrínsecos. Nos hemos centrado en el estudio de la Ciclina Oα y la Ciclina Oβ, productos de splicing alternativo del gen. En respuesta a diferentes tipos de estrés, la Ciclina Oα se acumula en agregaciones citoplásmicas densas que podrían corresponder a Gránulos de Estrés (SGs). Además, hemos visto que la Ciclina Oβ y un mutante puntual de la parte N-terminal de la proteína se localizan constitutivamente en los SGs. Aunque las dos isoformas alfa y beta son proapoptóticas, solo la Ciclina Oα es capaz de unirse y activar Cdk2. Por otro lado, hemos demostrado que los niveles de Ciclina O se incrementan en respuesta al estrés de Retículo Endoplásmico (RE) y que esta proteína es necesaria para la inducción de apoptosis dependiente de estrés de RE. La Ciclina O activa específicamente la vía de PERK e interacciona con la proteína inhibidora de PERK p58IPK. Además, la Ciclina O participa en la activación de otras quinasas de eIF2α. La Ciclina O se localiza en mitocondrias activas, lo que sugiere una función de la proteína ligada al metabolismo oxidativo.