Contexte : Au cours de la dernière décennie, le nombre de personnes en attente d’une transplantation cardiaque a augmenté d’environ 25%, tandis que le nombre de greffes effectuées chaque année est resté stable. Le taux de décès des patients en attente d’une greffe cardiaque est d’environ 15-20%. Le don d’organe suite à un décès cardiocirculatoire (DDC) est une alternative au don après décès neurologique (DDN) qui a permis d’augmenter le nombre d’organes disponibles comme les poumons, les reins et les foies. Compte tenu de la survenue d’une mort cardiovasculaire dans les protocoles DDC, le cœur est rarement greffé à cause des dommages infligés durant la période d’ischémie chaude. Notre équipe a précédemment démontré que l’utilisation du Celastrol, ainsi que notre analogue synthétique inhibiteur de la HSP90 ont des effets cardioprotecteurs, quand administrés au moment de la reperfusion dans des modèles in vitro de culture cellulaire et ex vivo dans des cœurs de rats montés sur le système de perfusion Langendorff. L’objectif est d’évaluer les mécanismes cardioprotecteurs rapides d’une nouvelle formulation de l’inhibiteur HSP90, et de comprendre l’efficacité de ce nouveau composé synthétique sur deux lignées de cellules : les cardiomyoblastes H9c2 issus de rats et les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes humaines (iPSC-CMs). Méthodes/Résultats : Les cellules H9c2 et iPSC-CMs ont été cultivées. La signalisation cellulaire a été analysée par western blot pour évaluer le niveau d’activation de ces différentes voies. Suite à l’optimisation des conditions pour les cellules iPSC-CMs, les deux lignées cellulaires ont été mises en condition ischémique (sans glucose, 95% N2, 5% CO2) durant la nuit, puis reperfusées, en conditions normales, avec différentes concentrations de l’inhibiteur HSP90. La viabilité cellulaire ainsi que l’ouverture des pores mitochondriaux (mPTP) ont été évaluées à l’aide de kits d’analyses, la production de radicaux libres d’oxygène à l’aide de kits de fluorescence et l’expression des ARN messagers de gènes antioxydants à l’aide de la réaction en chaîne par polymérase (PCR). Les résultats ont montré une augmentation de l’activation des voies cytoprotectrices quand les deux lignées cellulaires étaient traitées à la concentration 10-6M du composé sans stress 4 ischémique : augmentation de HO-1 and HSP-70 dans les 30 premières minutes et AKT et ERK après 1 heure de traitement et 3 heures de récupération. Contrairement à nos attentes, le traitement au moment de la reperfusion à la concentration 10-6M a montré une diminution de la viabilité des cellules, alors que la concentration 10-7M l’a augmenté. À une concentration de 10- 7M, il y a eu diminution de la production de radicaux libres comparativement au groupe témoin. Comme attendu, cette concentration a aussi démontré une diminution de l’ouverture des mPTP. Tous ces résultats ont été observés, autant dans les cellules humaines que celles de rats. Une évaluation préliminaire de l’expression des gènes antioxydants dans les cellules H9c2 a seulement montré une augmentation de l’expression des gènes CAT et HO-1. Conclusion : Notre groupe de recherche a précédemment démontré l’efficacité des composés issus du Celastrol sur la réduction des dommages myocardiques dus à la reperfusion dans les modèles d’ischémie, incluant l’infarctus du myocarde et la donation après décès cardiocirculatoire. Ces expériences ont montré les effets bénéfiques du nouveau composé synthétique sur l’expression des gènes antioxydants, et sur l’activation d’une série de voies cytoprotectrices permettant la stabilisation de la membrane mitochondriale, réduisant aussi la production de radicaux libres, et améliorant ultimement la survie cellulaire. Des études supplémentaires sont en cours afin d’améliorer la compréhension des modes d’action, des mécanismes et des dosages optimaux du médicament, ce qui nous permettra de commencer les essais sur animaux dans le but d’introduire cette molécule en clinique dans le contexte de don d’organes. / Background: During the last decade, the number of people waiting for a cardiac transplantation has increased by about 25%, while the number of yearly transplant surgeries performed has remained steady. The death rate of patients awaiting heart transplant is about 15-20%. Organ donation after circulatory death (DCD) is an alternative to donation after neurological death (DND) that has allowed to increase the number of available organs like lungs, livers, and kidneys. However, because of the cardiac death in DCD protocols, the heart is rarely used because of the injuries suffered by the warm ischemia period. Our group has previously shown that Celastrol, along with a synthetic HSP90 inhibitor analog, have cardioprotective effects when given as postconditioning agents at the moment of reperfusion in an in vitro model on cellular cultures and an ex vivo model on rat hearts mounted on a Langendorff perfusion system. The objective is to evaluate the rapid cardioprotective mechanisms of a novel formulation of the HSP90 inhibitor compound, and to understand the efficacy of this new synthetic compound on two cell lines: rat H9c2 cardiomyoblasts and human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSCCMs). Methods/Results: H9c2 rat cardiomyoblasts and human iPSC-CMs were cultured. Cell signaling was analyzed by western blot to evaluate pathway activations. Both cell lines were put in ischemic conditions (no glucose, 95% N2, 5% CO2) overnight, then reperfused (normal conditions) with different concentrations of HSP90i after optimizing the human iPSC-CMs’ stress experiment. Cell viability and mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening were evaluated using assays, oxygen-free radical production by fluorescence assay and antioxidant gene messenger RNA expression via polymerase chain reaction (PCR). Results showed an increase in cytoprotective pathway activation when both cell lines were treated with 10-6M of the compound without any stress: HO-1 and HSP-70 in the first 30 minutes while AKT and ERK after 1 hour of treatment and 3 hours of recuperation. Interestingly, treatment with the compound at 10-6M at the moment of reperfusion showed decreased viability of the cells while 10-7M improved it. Free radical production was also decreased at a concentration of 10-7M 6 when compared to the baseline, and as expected, the compound also decreased mPTP opening. These results were seen in both human and rat cell lines. Preliminary evaluation of antioxidant gene expression in H9c2 cells only showed an increase in the expression of the cytoprotective CAT and HO-1 genes. Conclusion: Our research group has previously demonstrated the efficacy of Celastrol compounds in reducing reperfusion damage in myocardial ischemia models, including myocardial infarction and donation after circulatory death. These experiments have shown that the beneficial effects of this new synthetic compound include the expression of antioxidant genes and the launching of a series of cytoprotective pathways that stabilize the mitochondrial membrane, reduce free radical production, and improve cell survival. Additional studies to fully understand the mode of action, the mechanisms and the optimal dosages are underway to allow us to move to animal trials in order to ultimately introduce the molecule in the clinical field in the context of organ donation.

In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Verfahren untersucht, die eine erfolgreiche Protektion vor hepatischer Ischämie/Reperfusionsschädigung versprachen: ischämische Präkonditionierung (IP) und pharmakologische Konditionierung mit Methylprednisolon (MP). Dabei wurde zunächst das Ausmaß der hepatozellulären Schädigung nach warmer Leberischämie durch Abklemmen der blutzuführenden Gefäße im Ligamentum hepatoduodenale (Pringle-Manöver) analysiert, wobei beide Behandlungsstrategien eine vergleichbar starke Gewebsprotektion erzielten. Nach 70%-iger Leberteilresektion mit Pringle-Manöver war jedoch trotz reduzierter Ischämie/Reperfusionsschädigung die Leberregeneration nach IP-Behandlung nachhaltig eingeschränkt. Im Gegensatz dazu waren die regenerativen Vorgänge nach MP-Behandlung nicht schneller, aber doch mit einer vergleichbaren Kinetik zu unbehandelten, ischämischen Kontrollen abgelaufen. Zusammenfassend gilt, daß sowohl IP- als auch MP-Behandlung die Ischämie/Reperfusionsschädigung deutlich reduzieren. Dies hat jedoch keinen positiven Einfluß auf die nachfolgende Regeneration nach Leberteilresektion mit Pringle-Manöver. / The present study analyses two strategies to protect from hepatic ischemia-reperfusion injury: ischemic preconditioning (IP) and pharmacologic administration of methylprednisolone (MP). First, the extent of hepatocellular damage after warm liver ischemia induced by cross clamping of the hepatic vessels in the hepatoduodenal ligament (Pringle manöver) was analysed demonstrating comparable tissue protection by both treatment modalities. After 70% partial hepatectomy including Pringle manöver however, the hepatocellular regerneration was markedly decreased after IP treatment, despite reduced ischemia-reperfusion injury. Moreover, MP treatment did not improve hepatic regeneration since it showed a comparable timing to untreated, ischemic controls. In conclusion, both IP and MP significantly reduced hepatic ischemia-reperfusion injury. However, no beneficial effects on hepatocellular regeneration after partial hepatectomy including pringle manöver were observed.

Ziel der Arbeit war, zu untersuchen, ob der gezielte Einsatz gentherapeutischer Methoden zu einer Verhinderung der Abstoßung allogener Transplantate bzw. zu einer Verhinderung der Induktion des Ischämie-/Reperfusionsschadens in verschiedenen Transplantationsmodellen der Ratte beitragen kann. Dabei wurden zwei Schwerpunkte gesetzt: Zum einen wurde auf den ex-vivo Gentransfer von therapeutischen Molekülen direkt in das Transplantat mit Hilfe von rekombinanten Adenoviren fokussiert. Zum anderen wurde das Potenzial von retroviral modifizierten, allospezifischen T-Zellen als Träger therapeutischer Gene zur Verhinderung der Transplantatrejektion untersucht. Diese Habilitationsschrift umfasst dreizehn Originalartikel in internationalen Zeitschriften, sechs Übersichtsartikel (Reviews) und vier Manuskripte, die bereits zur Veröffentlichung eingereicht sind. / The aim of the research was to investigate, whether the specific use of gene therapeutic methods can play a role in the prevention of allogeneic graft rejection or in the prevention of the induction of ischemia/reperfusion damage in various rat transplantation models. Doing this there were to main focusses: First we concentrated on the ex-vivo gene transfer of therapeutic molecules directly into the graft, which was done using recombinant adenoviruses. Then we investigated the potential of retrovirally modified, allospecific T-cells as carriers for therapeutic genes for the prevention of graft rejection. This publication consists of thirteen original papers in international journals, six reviews and four manuscripts that have been submitted for publication.

Mémoire en recherche-création / Creative dissertation / Objectif: Les lésions rénales aiguës causées par l'ischémie-reperfusion rénale (I/R) constituent un problème clinique majeur pour lequel les thérapies sont limitées, et dont le mécanisme sous-jacent reste mal compris. L'insuffisance rénale aiguë précède souvent la transition vers l'insuffisance rénale chronique, marquée par une inflammation soutenue, un remodelage tubulaire et une fibrose. Il est intéressant de noter que la protéine Hedgehog interacting (Hhip) a été identifiée comme un régulateur important dans la maladie rénale chronique, avec une expression notable dans les cellules endothéliales. Cependant, l'implication et le rôle de Hhip dans l'insuffisance rénale aiguë n'ont pas fait l'objet d'études approfondies. Dans ma thèse de maîtrise, nous cherchons à déterminer si le knock-out de Hhip spécifique aux cellules endothéliales peut prévenir l'insuffisance rénale aiguë induite par l’I/R in vivo, et à explorer les mécanismes moléculaires possibles par le biais d'expériences in vitro. Méthodes: Une I/R rénale unilatérale de 45 minutes ou une chirurgie sham avec néphrectomie controlatérale a été réalisée sur des souris mâles HhipEC-KO âgées de 10 semaines et sur leurs compagnons de contrôle Hhipfl/fl, respectivement. Les souris ont été divisées en quatre groupes : sham-Hhipfl/fl, sham-HhipEC-KO, IRI-Hhipfl/fl, IRI-HhipEC-KO, avec 6-8 souris dans chaque groupe. Des échantillons de sérum, d'urine et de rein ont été prélevés dans chaque groupe aux 1er, 3e et 7e jours postopératoires en vue d'analyses ultérieures. Les expériences in vitro ont consisté à exposer des cellules tubulaires proximales rénales naïves (IRPTCs) au milieu conditionné prélevé sur des cellules endothéliales de souris (mECs) dans différentes conditions, y compris la présence ou l'absence de Hhip (Hhip recombinant ou siRNA-Hhip) et le traitement au cisplatine. Résultats: Par rapport aux souris témoins sham, les souris qui ont subi une chirurgie I/R rénale ont toutes subi une perte de poids corporel significative et des lésions tubulaires rénales marquées, quel que soit le statut du knock-out Hhip. Les souris IRI-Hhipfl/fl ont présenté un taux de mortalité plus élevé et un rapport albumine/ créatinine (ACR) élevé en postopératoire par rapport aux souris IRI-HhipEC-KO. De meilleurs résultats pathologiques et une fibrose rénale réduite ont été observés chez les souris HhipEC-KO lors de lésions rénales aiguës. En outre, les niveaux d'expression du marqueur de lésions rénales-1 (KIM-1) étaient plus faibles chez les souris IRI-HhipEC-KO que chez les souris IRI-Hhipfl/fl. Notamment, l'expression des marqueurs associés à la sénescence cellulaire, y compris la β-galactosidase associée à la sénescence (SA-β-gal), la p21 et la p16, était accrue dans les tubules rénaux des souris Hhipfl/fl, mais significativement réduite chez les souris HhipEC-KO. Des expériences in vitro ont également révélé que les IRPTCs naïves cultivées dans un milieu conditionné (CM) provenant de mECs prétraitées au cisplatine présentaient une réponse de sénescence cellulaire prononcée, caractérisée par l'expression accrue de p21 et de p53. Cependant, le CM provenant de mECs silencées par Hhip, contenant également du cisplatine, a largement atténué ces effets néfastes chez les IRPTCs naïves. En outre, les reins des souris IRI-HhipEC-KO présentaient moins de fibrose et une plus faible expression de la molécule d'adhésion vasculaire-1 (VCAM-1) que les reins des souris témoins (IRI-Hhipfl/fl). Conclusion: Ces résultats suggèrent le rôle protecteur du knock-out de Hhip dans les cellules endothéliales contre les lésions tubulaires rénales induites par les lésions rénales aiguës. Cette protection potentielle peut être médiée, au moins en partie, par l'inhibition de la sénescence des cellules tubulaires médiée par Hhip. / Background/aim: Acute kidney injury (AKI) caused by renal ischemia reperfusion (I/R) stands as a major clinical issue with limited therapies, and its underlying mechanism remains poorly understood. AKI often precedes the transition to chronic kidney disease (CKD), marked by the sustained inflammation, tubular remodeling, and fibrosis. Interestingly, Hedgehog interacting protein (Hhip) has been identified as an important regulator in CKD, with notable expression in endothelial cells. However, the involvement and the role of Hhip during AKI has not been thoroughly investigated. In my master’s thesis, we aim to investigate whether endothelial cell-specific knockout of Hhip can prevents renal I/R-induced AKI in vivo, and to explore possible molecular mechanisms involved through in vitro experiments. Methods: 45-minute unilateral renal I/R or sham surgery, along with contralateral nephrectomy, was performed on 10-week-old male HhipEC-KO and its control littermate Hhipfl/fl mice, respectively. The mice were divided into four groups: sham-Hhipfl/fl, sham-HhipEC-KO, IRI-Hhipfl/fl, IRI-HhipEC-KO, with 6-8 mice in each group. Serum, urine and kidney samples were collected from each group on the 1st, 3rd, 7th postoperative days for subsequent analysis. In vitro experiments involved exposing naïve renal proximal tubular cells (IRPTCs) to the conditioned medium harvested from mouse endothelial cells (mECs) under different conditions, including presence or absence of Hhip (recombinant Hhip or siRNA-Hhip) and Cisplatin treatment. Results: Compared to sham control mice, mice that underwent renal I/R surgery all experienced significant body weight loss and marked renal tubular injury, regardless of Hhip knockout status. IRI-Hhipfl/fl mice exhibited a higher mortality rate and an elevated albumin/creatinine ratio (ACR) postoperatively compared to IRI-HhipEC-KO mice. Improved pathological outcomes and reduced renal fibrosis were observed in HhipEC-KO mice during AKI. In addition, the expression levels of kidney injury marker-1 (KIM-1) were lower in the IRI-HhipEC-KO mice than in the IRI-Hhipfl/fl mice. Notably, the expression of cellular senescence-associated markers, including senescence-associated-β-galactosidase (SA-β-gal), p21, and p16 was enhanced in the renal tubules of Hhipfl/fl mice, but significantly reduced in HhipEC-KO mice. In vitro experiments further revealed that naïve IRPTCs cultured in conditioned medium (CM) from Cisplatin-pretreated mECs exhibited a pronounced cellular senescence response, characterized by the upregulated expression of p21 and p53. However, CM from Hhip-silenced mECs, also containing Cisplatin, largely mitigated these adverse effects in naïve IRPTCs. Furthermore, kidneys of IRI-HhipEC-KO mice displayed less fibrosis and lower expression of vascular adhesion molecule-1 (VCAM-1) compared to their controls (IRI-Hhipfl/fl). Conclusion: These results hint at the protective role of Hhip knockout in endothelial cells against AKI-induced renal tubular injury. This potential protection may be mediated, at least in part, by the inhibition of Hhip-mediated tubular cell senescence.

No description available.

L’hyperglycémie de stress et la variabilité glycémique, consécutives à la réaction inflammatoire péri opératoire, sont associées à une morbidité et une mortalité accrues en chirurgie cardiaque. L’insulinothérapie intraveineuse administrée à l’aide de protocoles complexes, dits « dynamiques », constitue à l’heure actuelle le traitement de référence de l’hyperglycémie de stress. L’intérêt du contrôle glycémique péri-opératoire est admis par tous, sans qu’il existe de consensus véritable quant aux objectifs à atteindre, et reste très exigeant en termes de charge de soins. Dans la 1ère partie de ce travail, nous avons voulu vérifier si, 7 ans après sa mise en place, l’observance du protocole d’insulinothérapie utilisé dans notre Unité de Soins Intensifs de Chirurgie Cardiaque était conforme à celle mesurée lors de son implantation. Nous avons constaté des dérives majeures dans l’application du protocole qui ont pu être corrigées par la mise en place de mesures correctrices simples. Dans une 2ème partie du travail, nous avons cherché à évaluer si, à l’instar de la chirurgie cardiaque classique, une variabilité glycémique accrue était associée à une altération du pronostic des patients bénéficiant d’une procédure moins invasive (remplacement valvulaire aortique percutané ou TAVI). Nous avons ainsi analysé les données des patients ayant bénéficié d’un TAVI dans notre centre, et inclus dans les registres multicentriques français France et France-2. Nos résultats suggèrent une association entre une augmentation de la variabilité glycémique et un risque accru de complications cardiovasculaires majeures dans les 30 premiers jours, indépendamment de la qualité du contrôle glycémique obtenu. Enfin, dans une 3ème partie nous avons voulu savoir si exenatide, analogue de synthèse de GLP-1, permettait d’améliorer le contrôle glycémique péri opératoire en chirurgie cardiaque. Nous avons conduit un essai randomisé contrôlé de phase II/III montrant que l’administration intraveineuse (IV) d’exenatide, ne permettait pas d’améliorer la qualité du contrôle glycémique ou de réduire la variabilité glycémique par rapport à l’insuline IV, mais permettait de retarder l’administration d’insuline et de diminuer la quantité d’insuline administrée. Notre étude suggère également une diminution de la charge en soins. Du fait des données rapportées chez l’animal et dans l’infarctus du myocarde, nous avons également conduit une étude ancillaire suggérant l’absence d’effets cardioprotecteurs majeurs d’exenatide sur les lésions d’ischémie-reperfusion myocardiques, ne permettant pas d’améliorer la fonction cardiaque gauche à court et à moyen terme. L’optimisation du contrôle glycémique en chirurgie cardiaque nécessite ainsi la recherche de stratégies visant à améliorer l’observance des protocoles de soins et à réduire la variabilité glycémique. La place des analogues du GLP-1 reste à définir dans cette indication. / Stress hyperglycemia and glycemic variability are associated with increased morbidity and mortality in cardiac surgery patients. Intravenous (IV) insulin therapy using complex dynamic protocols is the gold standard treatment for stress hyperglycemia. If the optimal blood glucose target range remains a matter of debate, blood glucose control using IV insulin therapy protocols has become part of the good clinical practices during the postoperative period, but implies a significant increase in nurse workload. In the 1st part of the thesis, we aimed at checking the nurse-compliance to the insulin therapy protocol used in our Cardiac Surgery Intensive Care Unit 7 years after its implementation. Major deviations have been observed and simple corrective measures have restored a high level of nurse compliance. In the 2nd part of this thesis, we aimed at assessing whether blood glucose variability could be related to poor outcome in transcatheter aortic valve implantation (TAVI) patients, as reported in more invasive cardiac surgery procedures. The analysis of data from patients who undergone TAVI in our institution and included in the multicenter France and France-2 registries suggested that increased glycemic variability is associated with a higher rate of major adverse events occurring between the 3rd and the 30th day after TAVI, regardless of hyperglycemia. In the 3rd part if this thesis, we conducted a randomized controlled phase II/III trial to investigate the clinical effectiveness of IV exenatide in perioperative blood glucose control after coronary artery bypass graft surgery. Intravenous exenatide failed to improve blood glucose control and to decrease glycemic variability, but allowed to delay the start in insulin infusion and to lower the insulin dose required. Moreover, IV exenatide could allow a significant decrease in nurse workload. The ancillary analysis of this trial suggested that IV exenatide did neither provide cardio protective effect against myocardial ischemia-reperfusion injuries nor improve the left ventricular function by using IV exenatide. Strategies aiming at improving nurse compliance to insulin therapy protocols and at reducing blood glucose variability could be suitable to improve blood glucose control in cardiac surgery patients. The use of the analogues of GLP-1 in cardiac surgery patients needs to be investigated otherwise.