Thesis (M.S.)--Wisconsin. / Includes bibliographical references (leaves 90-97).

A full length cDNA (1463 bp) encoding isocitrate lyase (EC 4.1.3.1) of Strongyloides stercoralis is described. The nucleotide sequence of this insert identified a cDNA coding for the isocitrate lyase. The conceptually translated amino acid sequence of the open reading frame for S. stercoralis isocitrate lyase encodes a 450 amino acid residue protein with an apparent molecular weight of 50 kDa and a predicted pl of 6.39. The sequence is 69 % A/T, reflecting a characteristic A/T codon bias of S. stercoralis. The amino acid sequence of S. stercoralis isocitrate lyase is compared with bifunctional glyoxylate cycle protein of Caenorhabditis elegans and isocitrate lyases from Chlamydomonas reinhardtii and Myxococcus xanthus. The full length cDNA of S. stercoralis was expressed in pRSET vector and bacteriophage T7 promoter based expression system. S. stercoralis lyase recombinant protein, purified via immobilized metal affinity chromatography, showed a molecular mass of 50 kDa on polyacrylamide gels. The role of isocitrate lyase in the glyoxylate cycle and energy metabolism of S. stercoralis is also discussed.

O gene TrCit do fungo filamentoso Trichoderma reesei codifica a proteína citrato sintase, uma enzima chave do ciclo de Krebs. Análise da região 5´ upstream de TrCit mostra que o gene está adjacente ao gene TrIcl (que codifica a proteína isocitrato liase, uma enzima do ciclo de glioxalato), em uma orientação cabeça-cabeça. A região promotora intergênica de 647 pb rica em G + C, apresenta uma ilha CpG, seqüência INR, caixas GC, caixas CAAT, sítios de ligação para diversos fatores de transcrição e é isenta de caixa TATA. O gene TrCit de 1573 pb contém 3 éxons e 2 íntrons. Sua seqüência codificadora de 1422 pb produz uma proteína de 474 aminoácidos, com um peso molecular estimado de 52,3 kD. O gene TrIcl de 1880 pb contém 3 éxons e 2 íntrons. Sua seqüência codificadora de 1788 pb produz uma proteína de 596 aminoácidos, com um peso molecular estimado de 65,4 kD. A atividade transcricional da região promotora foi analisada utilizando como repórter o gene de higromicina B fosfotransferase (hph). Uma região funcional necessária à transcrição de ambos os genes foi identificada na região central do promotor e contém uma caixa GC que liga o putativo fator de transcrição Sp1 de T. reesei (TrZnFSp1). O gene do putativo fator de transcrição “zinc-finger" TrZnFSp1 de 1500 pb contém 3 éxons e 2 íntrons. Sua seqüência codificadora de 1344 pb produz uma proteína de 448 aminoácidos, com um peso molecular estimado de 48,4 kD. Os resultados mostram que ambos os genes são transcritos de forma divergente a partir de um promotor bidirecional que compartilha na região central uma caixa GC, necessária para a transcrição de ambos os genes. / The TrCit gene from the filamentous fungus Trichoderma reesei codes for the citrate synthase protein, a key enzyme in the Krebs cycle. Analysis of TrCit 5’ upstream region showed that it is adjacent to the TrIcl gene that codes for isocitrate lyase protein, an enzyme involved in the glyoxylate cycle. Both genes, on a head-to-head orientation, are separated by an intergenic GC-rich and TATA-less promoter region of 647 base pairs. This bidirectional promoter has diverse cis regulatory elements: a CpG island, two INR sequences, GC boxes, CAAT boxes and several putative interaction sites for different transcription factors. The TrCit gene, 1,573-base pair-long, has an open reading frame of 1,422 base pairs interrupted by two introns. The gene codes for a protein with an estimated molecular weight of 52.3 kD. The TrIcl gene, 1,880-base pair-long, contains 3 exons and 2 introns and a putative coding sequence of 1,788 base pairs. The estimated molecular weight of TrICL is 65.4 kD. he transcriptional activity of the intergenic promoter region was analyzed using hygromicin B phosphotransferase (hph) as a reporter gene. A functional region required for the transcription of both genes was identified in the centre of this promoter. It has a GC box that interacts with a putative transcription factor Sp1 from T. reesei (TrZnFSp1). The results presented in this work show that both genes are divergently transcribed from a bidirectional promoter that shares an essential central GC box.

O gene TrCit do fungo filamentoso Trichoderma reesei codifica a proteína citrato sintase, uma enzima chave do ciclo de Krebs. Análise da região 5´ upstream de TrCit mostra que o gene está adjacente ao gene TrIcl (que codifica a proteína isocitrato liase, uma enzima do ciclo de glioxalato), em uma orientação cabeça-cabeça. A região promotora intergênica de 647 pb rica em G + C, apresenta uma ilha CpG, seqüência INR, caixas GC, caixas CAAT, sítios de ligação para diversos fatores de transcrição e é isenta de caixa TATA. O gene TrCit de 1573 pb contém 3 éxons e 2 íntrons. Sua seqüência codificadora de 1422 pb produz uma proteína de 474 aminoácidos, com um peso molecular estimado de 52,3 kD. O gene TrIcl de 1880 pb contém 3 éxons e 2 íntrons. Sua seqüência codificadora de 1788 pb produz uma proteína de 596 aminoácidos, com um peso molecular estimado de 65,4 kD. A atividade transcricional da região promotora foi analisada utilizando como repórter o gene de higromicina B fosfotransferase (hph). Uma região funcional necessária à transcrição de ambos os genes foi identificada na região central do promotor e contém uma caixa GC que liga o putativo fator de transcrição Sp1 de T. reesei (TrZnFSp1). O gene do putativo fator de transcrição “zinc-finger” TrZnFSp1 de 1500 pb contém 3 éxons e 2 íntrons. Sua seqüência codificadora de 1344 pb produz uma proteína de 448 aminoácidos, com um peso molecular estimado de 48,4 kD. Os resultados mostram que ambos os genes são transcritos de forma divergente a partir de um promotor bidirecional que compartilha na região central uma caixa GC, necessária para a transcrição de ambos os genes. / The TrCit gene from the filamentous fungus Trichoderma reesei codes for the citrate synthase protein, a key enzyme in the Krebs cycle. Analysis of TrCit 5’ upstream region showed that it is adjacent to the TrIcl gene that codes for isocitrate lyase protein, an enzyme involved in the glyoxylate cycle. Both genes, on a head-to-head orientation, are separated by an intergenic GC-rich and TATA-less promoter region of 647 base pairs. This bidirectional promoter has diverse cis regulatory elements: a CpG island, two INR sequences, GC boxes, CAAT boxes and several putative interaction sites for different transcription factors. The TrCit gene, 1,573-base pair-long, has an open reading frame of 1,422 base pairs interrupted by two introns. The gene codes for a protein with an estimated molecular weight of 52.3 kD. The TrIcl gene, 1,880-base pair-long, contains 3 exons and 2 introns and a putative coding sequence of 1,788 base pairs. The estimated molecular weight of TrICL is 65.4 kD. he transcriptional activity of the intergenic promoter region was analyzed using hygromicin B phosphotransferase (hph) as a reporter gene. A functional region required for the transcription of both genes was identified in the centre of this promoter. It has a GC box that interacts with a putative transcription factor Sp1 from T. reesei (TrZnFSp1). The results presented in this work show that both genes are divergently transcribed from a bidirectional promoter that shares an essential central GC box.

Submitted by JÚLIO HEBER SILVA (julioheber@yahoo.com.br) on 2016-11-10T10:37:56Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Uessiley Ribeiro Barbosa - 2016.pdf: 3901383 bytes, checksum: f52c92a81d289db26f933d75a30e8788 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2016-11-10T17:48:40Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Uessiley Ribeiro Barbosa - 2016.pdf: 3901383 bytes, checksum: f52c92a81d289db26f933d75a30e8788 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-10T17:48:40Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Uessiley Ribeiro Barbosa - 2016.pdf: 3901383 bytes, checksum: f52c92a81d289db26f933d75a30e8788 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-10-04 / The Paracoccidioides brasiliensis (Pb) is a thermo-dimorphic fungus described as the etiological agent of paracoccidioidomycosis (PCM), an important systemic mycosis in Latin America. The isocitrate lyase (ICL) is an enzyme involved in glyoxylate cycle, an alternative pathway to Krebs cycle, which has been described in fungi, bacteria and plants. The absence of this enzyme in mammals makes it an interesting target for design of specific antifungal compounds for PCM. In this work, we use in silico methods like homology modeling, molecular dynamics and virtual screening, aiming the development of inhibitors compounds for PbICL enzyme in the absence and presence of cofactor and positive control. From a molecular docking protocol, it was possible to select promising compounds by criteria of affinity and efficiency based on screening of natural products. Two regions were selected for molecular docking, one involving a region already known by the binding of argentilactona inhibitor and another region involving the cofactor Mg 2+, a possible catalytic site of ICL. All compounds selected by affinity criteria had more than 80% of success rate in achieving lower energy and allowed to describe common residues within the protein interaction for the target sites. The structural quality parameters are significantly improved after 100 ns of simulation. The structure of PbICL and PbICL with magnesium show all quality parameters as acceptable to define them as highresolution structures. All selected compounds show aromatic chains with the possibility of being a pharmacophore, which is essential for biological activity. Another interesting aspect is that, through the selected compounds, it was possible to describe structural patterns related to the ligand specificity, that might be promising for a basic chemical sketch for rational drug design. / O Paracoccidioides brasiliensis (Pb) é um fungo termo-dimórfico descrito como agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica importante na América Latina. A Isocitrato liase (ICL) é uma enzima envolvida no ciclo do glioxilato, uma via do ciclo Krebs já descritos em fungos, bactérias e plantas. Sua ausência em mamíferos faz dessa enzima, um alvo interessante para o desenho de compostos antifúngicos específicos para a PCM. Neste trabalho, utilizamos métodos in silico como modelagem por homologia, dinâmica molecular e triagem virtual na busca de compostos inibidores para enzima isocitrato liase de P brasilienses (PbICL) na ausência e presença do cofator e com a seleção de controle positivo. A partir de um protocolo de ancoragem molecular, foi possível selecionar compostos promissores por critérios de afinidade e eficiência a partir de triagens virtuais com produtos naturais. Duas regiões foram selecionadas para a ancoragem molecular, uma envolvendo uma região já conhecida pela ligação do inibidor argentilactona e outra envolvendo a região de ligação do cofator Mg2+ , posicionada no possível sítio catalítico da enzima. Todos os compostos selecionados pelo critério de afinidade tiveram mais do que 80% de sucesso em alcançar a mais baixa energia e permitiram descrever resíduos frequentes na interação proteína-inibidor para sítios alvo da enzima. Os parâmetros de qualidade da estrutura são sensivelmente melhorados após 100 ns de simulação. As estruturas de PbICL e PbICL com Mg2+ apresentam todos os parâmetros dentro do aceitável para defini-la como estrutura de alta resolução. Todos os compostos selecionados apresentaram cadeias aromáticas com possibilidade de ser um grupo farmacofórico, o qual é essencial para a atividade biológica. Outro aspecto interessante é que através dos compostos selecionados foi possível descrever padrões estruturais relacionados à especificidade do composto, os quais podem vir a ser promissores para um esqueleto básico no desenho racional de fármacos.

Eine der für die biotechnologische Nutzung interessanten Eigenschaften der Hefe Yarrowia (Y.) lipolytica ist ihr Vermögen, unter bestimmten Kultivierungsbedingungen große Mengen an organischen Säuren, darunter auch Citronensäure (CS), ins extrazelluläre Medium zu sekretieren. Aufgrund ihrer Apathogenität, ihres breiten Substratspektrums und ihrer guten molekulargenetischen und verfahrenstechnischen Handhabbarkeit, stellt sie einen idealen Mikroorganismus zur biotechnologischen Gewinnung von Citronensäure dar. Bei der durch eine Stickstofflimitation ausgelösten Überproduktion von CS mit Y. lipolytica kommt es parallel auch zur Ausscheidung von Isocitronensäure (ICS), deren Anteil am Gesamtsäureprodukt in Abhängigkeit von der C-Quelle in Wildtypstämmen zwischen 10 % (Glucose, Saccharose, Glycerol) und 40-55 % (Pflanzenöle, Alkan) liegt. In der Literatur beschriebene Mutantenstämme von Y. lipolytica besitzen ein von Wildtypstämmen abweichendes Produktmuster und können sowohl weniger (2-5 % auf Glucose, 5-10 % Alkan und Pflanzenöl) als auch mehr ICS (15-35 % Glu¬cose, 65-75 % Alkan, Ethanol bzw. Pflanzenöl) sekretieren. Die gezielte Überexpression des für die Isocitratlyase codierenden Gens ICL1 durch die Erhöhung der Kopiezahl führte zu einer drastischen Erhöhung der Enzymaktivität in den entsprechenden ICL1 multicopy Transformanden (10-15fach gegenüber Wildtyp) aufgrund des Gen-Dosis-Effektes. Auf den getesteten hydrophilen C-Quellen Glucose, Glycerol und Saccharose verringerte sich der ICS-Anteil von durchschnittlich 10-12 % auf 3-5 %, auf den hydrophoben C-Quellen Hexadecan und Sonnenblumenöl sogar von durchschnittlich 40-55 % auf Werte um 5-10 %. Im Ergebnis dieser Untersuchungen entstand ein Patent (DE10333144A1), welches ein Verfahren zur Gewinnung von CS mit einer genetisch veränderten Hefe Y. lipolytica beschreibt. Die Zerstörung des Leserahmens des ICL1 Gens in Mutantenstämmen bewirkte das Ausbleiben der Synthese einer funktionell aktiven Isocitratlyase, was den Verlust der Fähigkeit zur Verwertung gluconeogenetischer C-Quellen wie Ethanol, Alkan und Pflanzenölen zur Folge hatte. Auf Glucose bzw. Glycerol zeigten diese Mutantenstämme im Vergleich zum Wildtypstamm jedoch nur eine geringe Erhöhung des ICS-Anteils um durchschnittlich 2-5 Prozentpunkte. Die Zerstörung des Leserahmens des IDP2 Gens, codierend für die NADP-abhängigen Isocitratdehydrogenase, führte zur Glutamat-Auxotrophie des entsprechenden Mutantenstammes auf allen getesteten C-Quellen. In der Produktbildung zeigte diese Mutante im Vergleich zum Wildtypstamm eine Verringerung des ICS-Anteils um durchschnittlich 2-4 Prozentpunkte. Es konnte gezeigt werden, dass Saccharose ein geeignetes Substrat zur Gewinnung von CS mit rekombinanten Stämmen von Y. lipolytica darstellt, die das für die Invertase codierende SUC2 Gens aus Saccharomyces cerevisiae exprimieren. Natürlicherweise kann Y. lipolytica diesen Zucker aufgrund des Fehlens des Enzyms Invertase nicht verwerten. Im Schüttelkolben wurden aus 100 g/l Saccharose unter nicht optimierten Bedingungen bereits 56 g/l CS+ICS gewonnen. Nach der Optimierung durch die Reduktion des für die Invertaseexpression durch pXPR2 notwendigen Peptonanteils von 1,7 auf 0,4 g/l erhöhte sich die Produktkonzentration auf 77 g/l. Die Übertragung des Produktionsprozesses in den Bioreaktor hatte die Verdopplung der Produktbildungsraten (RZA von 0,4 auf 0,85 g/l*h, r von 46 auf 89 mg/g*h) zur Folge, bedingt durch die Aufhebung der Sauerstofflimitation. Die Steigerung der Invertaseaktivität, die sich unter Bioreaktorbedingungen als ein Limi¬tationsfaktor her¬ausstellte, konnte durch die Anhebung des pH-Wertes von 5,0 auf 6,0 bzw. 6,8 er¬reicht werden. Dadurch konnten die Produktbildungsrate RZA um bis zu 80 % von 0,42 auf 0,76 g/l*h, die biomassespezifische Produktbildungsge¬schwin¬digkeit r um bis zu 70 % von 0,06 auf 0,1 g/g*h und die Ausbeute um bis zu 64 % von 0,5 auf 0,82 g/g gesteigert werden. Einen weiteren Limitationsfaktor für den CS-Bildungsprozess aus Saccharose stellt bei ausreichender Invertaseexpression offenbar die Aufnahme von Glucose und Fructose dar. Die Hefe Y. lipolytica zeigte höchste Produktbildungsraten aus Pflanzenölen, wie Sonnenblumen- oder Rapsöl, als nachwachsende Rohstoffe. Um zu prüfen, ob die Produktivität der CS-Bildung aus Pflanzenölen mit Y. lipolytica gesteigert werden kann, sollte die Triglyceridverwertung durch die Erhöhung der extrazellulären Lipaseaktivität verbessert werden. Dazu wurden zum einen Insertionsmutantenstämme, die auf eine erhöhte extrazelluläre Lipaseaktivität im Plattentest hin selektiert wurden, charakterisiert. Zum anderen wurde das für die extrazelluläre Lipase codierende LIP2 Gen in Y. lipolytica überexprimiert. Die erhaltenen LIP2 multicopy Transformanden zeigten eine bis zu 400fach erhöhte Lipaseaktivität im Vergleich zum Wildtypstamm (von 400 U/l auf bis zu 150000 U/l). Eine Verbesserung der Triglyceridverwertung aufgrund der Erhöhung der extrazellulären Lipaseaktivität in den untersuchten Insertionsmutanten und LIP2 multicopy Transformanden wurde nicht festgestellt. Die erhaltenen Daten für die Produktbildungsrate RZA (0,9-1,1 g/l*h), die biomassespezifische Produktbildungsgeschwindigkeit r (0,08-0,14 g/g*h) und die Ausbeuten (1,3-1,5 g/g) waren innerhalb der untersuchten Stämme vergleichbar und ließen keine verbesserte Produktbildung erkennen. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt liegt offenbar nicht bei der Hydrolyse der Triglyceride durch Lipasen, sondern bei der Aufnahme und dem Transport der Fettsäuren und/oder deren Katabolismus.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:30:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Rogerio Troian.pdf: 1860424 bytes, checksum: ba62f125166320434b87b83d216fc4e4 (MD5) Previous issue date: 2009-02-26 / Paracoccidioides brasiliensis, a thermodimorphic fungus, is the causative agent of paracoccidioidomycosis (PCM), a prevalent systemic mycosis in Latin America. Pathogenicity appears to be intimately related to the dimorphic transition from the hyphal to the yeast form, which is induced by a shift from environmental temperature to the temperature of the mammalian host. To cope with nutrient deprivation during the infection process, a number of pathogens employ the glyoxylate cycle (GC) to utilize fatty acids as carbon sources. The genes which constitute this pathway have been implicated in pathogenesis. An important aspect in the interaction between P.brasiliensis and your host is the ability to adhere to matrix extracelular components. In this work has shown that the isocitrate lyase of P. brasiliensis (PbICL) is located in the cell wall and also in the cytoplasm. PbICL recombinant and polyclonal antibody were able to inhibit the interaction of P. brasiliensis to epithelial cell cultures in vitro. Was also evaluated the ability of PbICL recombinant to connect the components of the extracellular matrix such as laminin, fibronectin, collagen type I and IV. These results suggest that PbICL is necessary to interaction between molecules of the extracellular matrix and P.brasiliensis, and that this interaction is crucial in adhesion and invasion of the fungus to the host cells. The kinetic parameters of PbICLr were determined. The sequence coding for methylisocitrate lyase of P. brasiliensis (PbmeICL) and the recombinant protein PbmeICLr were obtained. / Paracoccidioides brasiliensis, um fungo termodimórfico, é o agente causador da paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica prevalente da América Latina. A patogenicidade aparenta estar intimamente relacionada com a transição dimórfica da fase de micélio para levedura presente no hospedeiro. Para suprir a deficiência de nutrientes durante o processo de infecção, alguns patógenos empregam o ciclo do glioxalato (CG) na utilização de ácidos graxos como fontes de carbono. Os genes que constituem esta via têm sido relacionados à patogênese. Um aspecto importante na interação entre P. brasiliensis e seu hospedeiro é a habilidade do fungo em aderir aos componentes da matriz extracelular. Nesse trabalho foi demonstrado que a isocitrato liase de P. brasiliensis (PbICL) está localizada na parede celular e também no citoplasma. PbICL recombinante (PbICLr) e o seu respectivo anticorpo policlonal foram capazes de inibir a interação de P. brasiliensis às culturas de células epiteliais in vitro. Foi avaliada também a capacidade da PbICLr de se ligar a componentes da matriz extracelular, como laminina, fibronectina, colágeno tipo I e IV. Esses resultados sugerem que PbICL é necessária para interação entre P. brasiliensis e moléculas da matriz extracelular, sendo essa interação fundamental na aderência e invasão do fungo às células do hospedeiro. Os parâmetros cinéticos da PbICLr foram determinados. A sequência que codifica para a metilisocitrato liase de P. brasiliensis (PbmeICL), bem como a proteína recombinante PbmeICLr foram obtidas.

Eine der für die biotechnologische Nutzung interessanten Eigenschaften der Hefe Yarrowia (Y.) lipolytica ist ihr Vermögen, unter bestimmten Kultivierungsbedingungen große Mengen an organischen Säuren, darunter auch Citronensäure (CS), ins extrazelluläre Medium zu sekretieren. Aufgrund ihrer Apathogenität, ihres breiten Substratspektrums und ihrer guten molekulargenetischen und verfahrenstechnischen Handhabbarkeit, stellt sie einen idealen Mikroorganismus zur biotechnologischen Gewinnung von Citronensäure dar. Bei der durch eine Stickstofflimitation ausgelösten Überproduktion von CS mit Y. lipolytica kommt es parallel auch zur Ausscheidung von Isocitronensäure (ICS), deren Anteil am Gesamtsäureprodukt in Abhängigkeit von der C-Quelle in Wildtypstämmen zwischen 10 % (Glucose, Saccharose, Glycerol) und 40-55 % (Pflanzenöle, Alkan) liegt. In der Literatur beschriebene Mutantenstämme von Y. lipolytica besitzen ein von Wildtypstämmen abweichendes Produktmuster und können sowohl weniger (2-5 % auf Glucose, 5-10 % Alkan und Pflanzenöl) als auch mehr ICS (15-35 % Glu¬cose, 65-75 % Alkan, Ethanol bzw. Pflanzenöl) sekretieren. Die gezielte Überexpression des für die Isocitratlyase codierenden Gens ICL1 durch die Erhöhung der Kopiezahl führte zu einer drastischen Erhöhung der Enzymaktivität in den entsprechenden ICL1 multicopy Transformanden (10-15fach gegenüber Wildtyp) aufgrund des Gen-Dosis-Effektes. Auf den getesteten hydrophilen C-Quellen Glucose, Glycerol und Saccharose verringerte sich der ICS-Anteil von durchschnittlich 10-12 % auf 3-5 %, auf den hydrophoben C-Quellen Hexadecan und Sonnenblumenöl sogar von durchschnittlich 40-55 % auf Werte um 5-10 %. Im Ergebnis dieser Untersuchungen entstand ein Patent (DE10333144A1), welches ein Verfahren zur Gewinnung von CS mit einer genetisch veränderten Hefe Y. lipolytica beschreibt. Die Zerstörung des Leserahmens des ICL1 Gens in Mutantenstämmen bewirkte das Ausbleiben der Synthese einer funktionell aktiven Isocitratlyase, was den Verlust der Fähigkeit zur Verwertung gluconeogenetischer C-Quellen wie Ethanol, Alkan und Pflanzenölen zur Folge hatte. Auf Glucose bzw. Glycerol zeigten diese Mutantenstämme im Vergleich zum Wildtypstamm jedoch nur eine geringe Erhöhung des ICS-Anteils um durchschnittlich 2-5 Prozentpunkte. Die Zerstörung des Leserahmens des IDP2 Gens, codierend für die NADP-abhängigen Isocitratdehydrogenase, führte zur Glutamat-Auxotrophie des entsprechenden Mutantenstammes auf allen getesteten C-Quellen. In der Produktbildung zeigte diese Mutante im Vergleich zum Wildtypstamm eine Verringerung des ICS-Anteils um durchschnittlich 2-4 Prozentpunkte. Es konnte gezeigt werden, dass Saccharose ein geeignetes Substrat zur Gewinnung von CS mit rekombinanten Stämmen von Y. lipolytica darstellt, die das für die Invertase codierende SUC2 Gens aus Saccharomyces cerevisiae exprimieren. Natürlicherweise kann Y. lipolytica diesen Zucker aufgrund des Fehlens des Enzyms Invertase nicht verwerten. Im Schüttelkolben wurden aus 100 g/l Saccharose unter nicht optimierten Bedingungen bereits 56 g/l CS+ICS gewonnen. Nach der Optimierung durch die Reduktion des für die Invertaseexpression durch pXPR2 notwendigen Peptonanteils von 1,7 auf 0,4 g/l erhöhte sich die Produktkonzentration auf 77 g/l. Die Übertragung des Produktionsprozesses in den Bioreaktor hatte die Verdopplung der Produktbildungsraten (RZA von 0,4 auf 0,85 g/l*h, r von 46 auf 89 mg/g*h) zur Folge, bedingt durch die Aufhebung der Sauerstofflimitation. Die Steigerung der Invertaseaktivität, die sich unter Bioreaktorbedingungen als ein Limi¬tationsfaktor her¬ausstellte, konnte durch die Anhebung des pH-Wertes von 5,0 auf 6,0 bzw. 6,8 er¬reicht werden. Dadurch konnten die Produktbildungsrate RZA um bis zu 80 % von 0,42 auf 0,76 g/l*h, die biomassespezifische Produktbildungsge¬schwin¬digkeit r um bis zu 70 % von 0,06 auf 0,1 g/g*h und die Ausbeute um bis zu 64 % von 0,5 auf 0,82 g/g gesteigert werden. Einen weiteren Limitationsfaktor für den CS-Bildungsprozess aus Saccharose stellt bei ausreichender Invertaseexpression offenbar die Aufnahme von Glucose und Fructose dar. Die Hefe Y. lipolytica zeigte höchste Produktbildungsraten aus Pflanzenölen, wie Sonnenblumen- oder Rapsöl, als nachwachsende Rohstoffe. Um zu prüfen, ob die Produktivität der CS-Bildung aus Pflanzenölen mit Y. lipolytica gesteigert werden kann, sollte die Triglyceridverwertung durch die Erhöhung der extrazellulären Lipaseaktivität verbessert werden. Dazu wurden zum einen Insertionsmutantenstämme, die auf eine erhöhte extrazelluläre Lipaseaktivität im Plattentest hin selektiert wurden, charakterisiert. Zum anderen wurde das für die extrazelluläre Lipase codierende LIP2 Gen in Y. lipolytica überexprimiert. Die erhaltenen LIP2 multicopy Transformanden zeigten eine bis zu 400fach erhöhte Lipaseaktivität im Vergleich zum Wildtypstamm (von 400 U/l auf bis zu 150000 U/l). Eine Verbesserung der Triglyceridverwertung aufgrund der Erhöhung der extrazellulären Lipaseaktivität in den untersuchten Insertionsmutanten und LIP2 multicopy Transformanden wurde nicht festgestellt. Die erhaltenen Daten für die Produktbildungsrate RZA (0,9-1,1 g/l*h), die biomassespezifische Produktbildungsgeschwindigkeit r (0,08-0,14 g/g*h) und die Ausbeuten (1,3-1,5 g/g) waren innerhalb der untersuchten Stämme vergleichbar und ließen keine verbesserte Produktbildung erkennen. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt liegt offenbar nicht bei der Hydrolyse der Triglyceride durch Lipasen, sondern bei der Aufnahme und dem Transport der Fettsäuren und/oder deren Katabolismus.

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TaffarelMT_DISSERT.pdf: 2213102 bytes, checksum: 779f70cd3a9747e4f3a386630bd3d1cc (MD5) Previous issue date: 2013-04-09 / Funda??o de Apoio ? Pesquisa do Estado do Rio Grande do Norte / Oilseeds are a high-value natural resource, due to its use as a substitute for petroleum. However, the storage time can reduce seed viability and oil quality. Therefore, scientific efforts have been made to provide a increment of storage time, germination rates and plant establishment of high-value oilseeds. The seedling establishment depends of the plant pass over the functional transition stage, characterized by a metabolic change from heterotrophic condition to autotrophic one. The storage oil mobilization is performed by β-oxidation process and the glyoxylate cycle. Also, the functional transition involves acclimation to photosynthetic condition, which generally includes the participation of antioxidant system and the reactive oxygen species, the latter are produced in various reactions of primary and secondary metabolism. In the present study, Catalase was inhibited during the functional transition of sunflower and safflower, after were performed many analyzes to elucidate the effects caused on the SOD and APX antioxidant systems. Also, were checked the changes in expression pattern of the glyoxylate cycle enzymes markers, ICL and MLS. It was observed that after CAT inhibition, the SOD and APX antioxidant systems allow the seedling establishment. Besides, was verified that both oilseeds can be accelerate the reverse mobilization and the photosynthetic establishment when Catalase activity has dramatically decreased / As sementes oleaginosas armazenam ?leos, um recurso natural de alto valor econ?mico devido a sua aplicabilidade como substituto aos derivados do petr?leo. Por?m, o tempo de armazenamento pode inviabilizar a semente provocando a redu??o da qualidade do ?leo e perda da viabilidade da semente. Por este motivo, esfor?os cient?ficos t?m sido realizados para proporcionar um maior tempo de armazenamento e incrementar taxas de germina??o e estabelecimento destas plantas com alto valor econ?mico. O estabelecimento da pl?ntula depende da capacidade do vegetal transpassar a etapa de transi??o funcional, caracterizada pela mudan?a do estado heterotr?fico para o autotr?fico. O consumo das reservas de ?leo depende das vias de β-oxida??o e do ciclo do glioxilato. No entanto, o processo de transi??o envolve a aclimata??o do vegetal ? condi??o de organismo fotossintetizante, que em geral conta com a participa??o fundamental do sistema antioxidante do vegetal devido ? produ??o de esp?cies reativas de oxig?nio em v?rias rea??es do metabolismo prim?rio e secund?rio. Neste estudo, a Catalase foi inibida durante a transi??o funcional de girassol e c?rtamo para analisar os efeitos provocados nos sistemas antioxidantes de APX e da SOD e verificar as modifica??es no padr?o de express?o das enzimas marcadoras do ciclo do glioxilato, ICL e MLS. Constatou-se que diante da inibi??o da Catalase o sistema antioxidante da APX e da SOD permitem o estabelecimento da pl?ntula. Verificou-se tamb?m que as duas oleaginoasas parecem acelerar a mobiliza??o de reservas e o estabelecimento fotossint?tico quando a Catalase tem a atividade drasticamente reduzida

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Renata Silva do Prado.pdf: 1314483 bytes, checksum: 0832c7a22af0d5f60e10293a7d47b2d0 (MD5) Previous issue date: 2010-11-20 / The fungus Paracoccidioides brasiliensis is the causative agent of paracoccidioidomicosys (PCM), the most prevalent human systemic mycosis in Latin America. The toxicity of drugs and the appearance of resistant strains have imposition the search for new therapeutic approaches. Plants with reputed antimicrobial uses represent a rich source for the screening of potential antifungal compounds. In this work, we investigated the inhibitory action of argentilactone, extracted from the essential oil of Hyptis ovalifolia, and its analogues on P. brasiliensis yeast cells, during the differentiation from mycelium to yeast, on native and recombinant PbICL. Sensitivity tests on plates, which assessed the activity of argentilactone on yeast cells of P. brasiliensis showed both argentilactone as reduced argentilactone interfered in fungus growth, affecting the cells in a dose-dependent way. The experiments evaluating the minimum inhibitory concentration (MIC), which evaluated the influence of the compounds during the transition from mycelium to yeast in P. brasiliensis showed that argentilactone and reduced argentilactone interferes in this process, also in a dose-dependent way. A specific activity of isocitrate lyase of the fungus, both recombinant as native, as measured by tests of enzyme activity was also affected by the compounds. The type of inhibition promoted by argentilactone and reduced argentilactone was defined as inhibition of mixed type through tests of enzyme kinetics. Different carbon sources (acetate and glucose) have directly influence on the processs of inhibition. The analogues epoxy argentilactone and diol argentilactone not inhibit the growth and differentiation of P. brasiliensis. In addition, it not inhibited the enzyme isocitrate lyase native or recombinant. / O fungo Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), micose humana sistêmica de maior prevalência na América Latina. Devido à toxicidade dos antifúngicos existentes, e ao aparecimento de isolados resistentes, estudos em busca de novas terapias tem adquirido relevância. Plantas com propriedades terapêuticas representam uma fonte em potencial para descoberta de novos antifúngicos. Neste trabalho, foi investigada a influência de argentilactona, extraída do óleo essencial de Hyptis ovalifolia, e seus análogos obtidos sinteticamente sobre células leveduriformes de P. brasiliensis, durante o processo de diferenciação de micélio para levedura e sobre a enzima isocitrato liase recombinate (PbICLr) e nativa. Os testes de sensibilidade em placas, que avaliaram a atividade de argentilactona sobre células leveduriformes de P. brasiliensis, mostraram que tanto argentilactona como argentilactona reduzida interferiram no crescimento do fungo, afetando as células de modo dose-dependente. Os experimentos de avaliação de concentração inibitória mínima (CIM), que avaliaram a influência dos compostos durante a transição de micélio para levedura em P. brasiliensis mostraram que argentilactona e argentilactona reduzida interferem nesse processo, também de modo dose-dependente. A atividade específica da isocitrato liase do fungo, tanto recombinante como nativa, mensurada por testes de atividade enzimática, também foi afetada pelos compostos. O tipo de inibição promovida pela argentilactona e argentilactona reduzida foi definido como inibição do tipo mista, através de testes de cinética enzimática. Diferentes fontes de carbono (acetato e glicose) influenciaram diretamente o processo de inibição. Os análogos epoxi argentilactona e diol argentilactona não inibiram o crescimento de células leveduriformes e o processo de diferenciação de P. brasiliensis. Em adição, também não inibiram a atividade da enzima isocitrato liase recombinante e nativa.