Student Number : 0410864E - MSc dissertation - School of Chemistry - Faculty of Science / The aim of the project described in this dissertation is to explore the application of ring closing metathesis (RCM) to the synthesis of 6-, 7-, 8- and 9-membered N,N-, N,O- and O,O-benzo-fused heterocyclic compounds which are interesting structural motifs in medicinal chemistry. In recent times, their structures have been widely used as molecular scaffolds. Some of these heterocycles have been identified as antitumour agents, antibiotics and anti-HIV agents. In our laboratories, a variety of 6-, 7- and 8-membered nitrogen- and oxygen- containing benzo-fused rings have been synthesized through ruthenium-mediated isomerisation and RCM in moderate to good yields. The first step in the present project was N-protection of suitable 2-aminophenols or o-phenylenediamines followed by allylation. Rutheniummediated isomerisation followed by RCM was then used for the synthesis of the 6- membered ring system tert-butyl 4H-1,4-benzoxazine-4-carboxylate 91 and the 7- membered ring system tert-butyl 1,5-benzoxazepine-5(4H)-carboxylate 103 while only RCM was used for the 8-membered ring systems, di(tert-butyl) 2,3,4,5-tetrahydro-1,6- benzodiazocine-1,6-carboxylate 130, di(tert-butyl) 2,5-dihydro-1,6-benzodiazocine-1,6- dicarboxylate 129, 1,6-dibenzoyl-1,2,5,6-tetrahydro-1,6-benzodiazocine 132, 7-methoxy- 2,5-dihydro-1,6-benzodioxocine 137 and the 9-membered ring system 1,6-bis[(4- methylphenyl)sulfonyl]-2,5,6,7-tetrahydro-1H-1,6-benzodiazonine 159. In the synthesis of the 7-membered ring systems, based on established methodology, we encountered problems with the RCM from suitable benzylamine or benzyl alcohol precursors. The reasons for this are not clear but we suspect this could be as a result of electronic and kinetic factors. Nevertheless, we were able to synthesize a 7-membered ring system, tert-butyl 1,5-benzoxazepine-5(4H)-carboxylate 103, from a readily available precursor using a different methodology. Approaches to the synthesis of the 8-membered ring systems, di(tert-butyl) 2,3,4,5- tetrahydro-1,6-benzodiazocine-1,6-carboxylate 130, di(tert-butyl) 2,5-dihydro-1,6- benzodiazocine-1,6-dicarboxylate 129, 1,6-dibenzoyl-1,2,5,6-tetrahydro-1,6- benzodiazocine 132 and 7-methoxy-2,5-dihydro-1,6-benzodioxocine 137, as described in this dissertation, made extensive use of RCM in moderate to good yields, but the deprotection of the Boc group after hydrogenation proved to be a problem. The synthesis of the 9-membered nitrogen containing benzo-fused compounds, 1,6- bis[(4-methylphenyl)sulfonyl]-2,5,6,7-tetrahydro-1H-1,6-benzodiazonine 159 by RCM was successful but in the synthesis of the N,O-benzo-fused compound by RCM, we suspect that polymerization, which is a side reaction in RCM reactions that are slow, occurred. In the synthesis of the 9-membered O,O-benzo-fused compounds, we only isolated the starting material. The final approach in this dissertation involved the use of ruthenium-mediated isomerisation to afford internal isomerisation of the double bond within the heterocyclic rings of the 8-membered and 9-membered benzo-fused compounds previously prepared in our laboratory. This gave a mixture of regioisomers of 10-methoxy-2,3-dihydro-1,6- benzodioxocine 163 and 7-methoxy-2,3-dihydro-1,6-benzodiazocine 164, 1,6-bis[(4- Methylphenyl)sulfonyl]-1,2,3,6-tetrahydro-1,6-benzodiazocine 166, a regioisomeric mixture of 6-[(4-methylphenyl)sulfonyl]-3,6-dihydro-2H-1,6,-benzoxazocine 161 and 6-[(4-methylphenyl)sulfonyl]-5,6-dihydro-4H-1,6,-benzoxazocine 162, and the 9- membered benzo-fused ring system, 1,6-bis[(4-methylphenyl)sulfonyl]-2,3,6,7- tetrahydro-1H-1,6-benzodiazonine 170. The yields were good and the solid state structures of these isomerised compounds were examined by X-ray crystallography. Xray diffraction was also performed on the solid state 8- and 9-membered benzo-fused ring systems. We also compared the crystal structures of the 8- and 9-membered benzo-fused compounds with their isomerised compounds.

L’objectif de la thèse était la préparation et la caractérisation des catalyseurs hétérogènes à base de polyoxométalates. L’étude mécanistique d’oxydation du méthane jusqu’au méthanol a montré que sur des polyoxométalates supportés sur la silice l’activation C-H a lieu déjà à la température ambiante. L’adsorption du méthane-13C sur H4SiMo12O40 supporté, suivie par RMN solide a mis en évidence la création de l’espèce méthoxy [SiMo12O40(CH3)]3-. Le cycle catalytique est complété par l’hydrolyse de cette espèce - méthanol est formé et une molécule de l’eau recrée la structure du départ de polyoxométalate. L’adsorption du méthanol-13C sur des polyoxométalates a montré la création de deux types des espèces methoxy, localisées sur des atomes d’oxygènes terminaux ou pontants est caractérisées par deux signaux RMN distincts – à 58 et 77 ppm, respectivement. En greffant un complexe de platine PtMe2COD sur les sels de césium de polyoxometalates, le dégagement du méthane ou de la mélange du méthane et de l’éthane a été observé et expliqué par la séquence de l’addition oxydative du proton de polyoxometalate au centre métallique, couplage C-H ou C-C et finalement l’élimination réductrice et libération d’une molécule de gaz. Sels d’ammonium de l’acide phosphotungstique H3PW12O40 ont été montrées de catalyser l’isomérisation du n-butane a l’isobutane dans des conditions douces (225°C, 1 atm.). Composé du cuivre Cu(OTf)2 sur la surface des sels inorganiques des polyoxometalates donne des catalyseurs très actifs en insertion des carbènes aux liaisons C-H des éthers cycliques. / The aim of this work was preparation and characterization of catalysts based on polyoxometalates and their use in various catalytic reactions in heterogenous conditions. Methane C-H activation on silica-supported polyoxometalates was shown already at room temperature. Methoxy species [SiMo12O40(CH3)]3- from the 13C-enriched methane adsorption at 200°C on the surface of a silicadispersed silicomolybdic acid was detected by means of 13C SS NMR. Its hydrolysis led to methanol formation, thus completing the catalytic cycle. After 13C-enriched MeOH adsorption presence of two distinct methoxy species on the surface of polyoxometalates was shown, located on terminal (single coordinated) and bridging (double coordinated) oxygen atoms and resulting in the resonances at 58 and 77 ppm in 13C SS NMR. Grafting of PtMe2COD on the surface of various polyoxometalate supports led to methane or combined methane and ethane release, explained by means of oxidative addition/reductive elimination mechanism on metal centers. Ammonium salts of phosphotungstic acid catalyzed efficiently n-butane to isobutane skeletal isomerisation at mild conditions (225 °C, atmospheric pressure). Successful heterogenization of copper catalysts, active in enantioselective C-H carbene insertion reactions, on polyoxometalate supports have been shown

<p>Bilirubin is a degradation product of haem, which is constantly formed in all</p><p>mammals. Increased levels of bilirubin in humans lead to jaundice, a condition</p><p>that is very common during the first days after birth. This neonatal</p><p>jaundice can routinely be treated by phototherapy without any serious side</p><p>effects. During this treatment, bilirubin undergoes a photoreaction to isomers</p><p>that can be excreted. The most efficient photoreaction is the isomerisation</p><p>around a double bond (Z-E-isomerisation), which results in more soluble</p><p>photoproducts.</p><p>The work presented in this thesis shows results of a femtosecond optical</p><p>spectroscopy study, combined with quantum-mechanical investigations, of</p><p>the mechanism of isomerisation of bilirubin. The spectroscopic research was</p><p>conducted with bilirubin in organic solvents, and in buffer complexed by</p><p>human serum albumin. This albumin complex is present in the blood, and</p><p>has thus medical importance. Quantum-chemical calculations (CASSCF) on</p><p>a bilirubin model were used to explain experimental results.</p><p>The fluorescence decay observed with femtosecond spectroscopy shows an</p><p>ultrafast component (~120 fs), which is explained by exciton localisation,</p><p>followed by processes with a lifetime of about 1-3 ps. These are interpreted</p><p>as the formation of a twisted intermediate, which decays with a lifetime of</p><p>10-15 ps back to the ground state, as observed by absorption spectroscopy.</p><p>CASSCF calculations, in combination with the experimental results, suggest</p><p>the ca. 1-3 ps components to be relaxation to the twisted S1 minimum, followed</p><p>by the crossing of a barrier, from where further relaxation takes place</p><p>through a conical intersection back to the ground state.</p><p>Time-dependent DFT calculations were utilised to analyse the absorption</p><p>spectrum of bilirubin. Good agreement with the measured spectrum was</p><p>achieved, and low-lying states were observed, that need further investigation.</p><p>The theoretically obtained CD spectrum provides direct evidence that</p><p>bilirubin preferentially binds to human serum albumin in the enantiomeric</p><p>P-form at neutral pH.</p> / <p>Bilirubin är en nedbrytningsprodukt av hem som ständigt bildas hos alla</p><p>däggdjur. En förhöjd bilirubinkoncentration i den mänskliga kroppen kan</p><p>leda till gulsot, något som är mycket vanligt under de första dagarna efter</p><p>födelsen (neonatal gulsot). Fototerapi används rutinmässigt som säker behandlingsmetod,</p><p>under vilken bilirubin genomgår en fotoreaktion till en</p><p>isomer som kan utsöndras. Den mest effektiva fotoreaktionen är en Z-Eisomerisation,</p><p>vilken leder till lösligare fotoprodukter.</p><p>Arbetet som presenteras i denna avhandling visar resultaten av en kombinerad</p><p>femtosekund optisk-spektroskopisk och kvantmekanisk undersökning</p><p>av mekanismen bakom bilirubins isomerisation. Den spektroskopiska</p><p>studien genomfördes med bilirubin, löst i organiska lösningsmedel och i</p><p>buffert i komplex med humant serumalbumin. Detta albuminkomplex finns i</p><p>blodet, och är därför av medicinskt intresse. Kvantmekanistiska CASSCFberäkningar</p><p>på en bilirubinmodell användes för att förklara de experimentella</p><p>resultaten.</p><p>Det uppmätta fluorescence sönderfallet visar ultrasnabba komponenter</p><p>(~120 fs). Dessa tolkas som excitonlokalisering, som följs av bildandet av</p><p>ett vridet intermediat med en hastighetskonstant på ca. 1 ps-1(beroende på</p><p>lösningsmedlet). Absorptionsmätningar visar att detta intermediat sönderfaller</p><p>tillbaka till grundtillståndet med en livstid på 10-15 ps.</p><p>CASSCF beräkningar, i kombination med de experimentella resultaten, tyder</p><p>på att sönderfallet med livslängden på ca. 1 ps är en relaxation till det</p><p>vridna S1-tillståndet. Reaktionsvägen därifrån antas passera en barriär till en</p><p>konisk genomskärning, som möjliggör snabb relaxation till grundtillståndet.</p><p>Tidsberoende DFT-beräkningar användes för att analysera bilirubins absorptionsspektrum,</p><p>vilket gav bra överensstämmelse med uppmätta data. Dessutom</p><p>hittades ett tillstånd med låg excitationsenergi, som kräver ytterligare</p><p>studier. Med hjälp av det beräknade CD-spectret kunde det visas att bilirubin</p><p>binder till albumin i P-formen vid neutralt pH.</p>

Bilirubin is a degradation product of haem, which is constantly formed in all mammals. Increased levels of bilirubin in humans lead to jaundice, a condition that is very common during the first days after birth. This neonatal jaundice can routinely be treated by phototherapy without any serious side effects. During this treatment, bilirubin undergoes a photoreaction to isomers that can be excreted. The most efficient photoreaction is the isomerisation around a double bond (Z-E-isomerisation), which results in more soluble photoproducts. The work presented in this thesis shows results of a femtosecond optical spectroscopy study, combined with quantum-mechanical investigations, of the mechanism of isomerisation of bilirubin. The spectroscopic research was conducted with bilirubin in organic solvents, and in buffer complexed by human serum albumin. This albumin complex is present in the blood, and has thus medical importance. Quantum-chemical calculations (CASSCF) on a bilirubin model were used to explain experimental results. The fluorescence decay observed with femtosecond spectroscopy shows an ultrafast component (~120 fs), which is explained by exciton localisation, followed by processes with a lifetime of about 1-3 ps. These are interpreted as the formation of a twisted intermediate, which decays with a lifetime of 10-15 ps back to the ground state, as observed by absorption spectroscopy. CASSCF calculations, in combination with the experimental results, suggest the ca. 1-3 ps components to be relaxation to the twisted S1 minimum, followed by the crossing of a barrier, from where further relaxation takes place through a conical intersection back to the ground state. Time-dependent DFT calculations were utilised to analyse the absorption spectrum of bilirubin. Good agreement with the measured spectrum was achieved, and low-lying states were observed, that need further investigation. The theoretically obtained CD spectrum provides direct evidence that bilirubin preferentially binds to human serum albumin in the enantiomeric P-form at neutral pH. / Bilirubin är en nedbrytningsprodukt av hem som ständigt bildas hos alla däggdjur. En förhöjd bilirubinkoncentration i den mänskliga kroppen kan leda till gulsot, något som är mycket vanligt under de första dagarna efter födelsen (neonatal gulsot). Fototerapi används rutinmässigt som säker behandlingsmetod, under vilken bilirubin genomgår en fotoreaktion till en isomer som kan utsöndras. Den mest effektiva fotoreaktionen är en Z-Eisomerisation, vilken leder till lösligare fotoprodukter. Arbetet som presenteras i denna avhandling visar resultaten av en kombinerad femtosekund optisk-spektroskopisk och kvantmekanisk undersökning av mekanismen bakom bilirubins isomerisation. Den spektroskopiska studien genomfördes med bilirubin, löst i organiska lösningsmedel och i buffert i komplex med humant serumalbumin. Detta albuminkomplex finns i blodet, och är därför av medicinskt intresse. Kvantmekanistiska CASSCFberäkningar på en bilirubinmodell användes för att förklara de experimentella resultaten. Det uppmätta fluorescence sönderfallet visar ultrasnabba komponenter (~120 fs). Dessa tolkas som excitonlokalisering, som följs av bildandet av ett vridet intermediat med en hastighetskonstant på ca. 1 ps-1(beroende på lösningsmedlet). Absorptionsmätningar visar att detta intermediat sönderfaller tillbaka till grundtillståndet med en livstid på 10-15 ps. CASSCF beräkningar, i kombination med de experimentella resultaten, tyder på att sönderfallet med livslängden på ca. 1 ps är en relaxation till det vridna S1-tillståndet. Reaktionsvägen därifrån antas passera en barriär till en konisk genomskärning, som möjliggör snabb relaxation till grundtillståndet. Tidsberoende DFT-beräkningar användes för att analysera bilirubins absorptionsspektrum, vilket gav bra överensstämmelse med uppmätta data. Dessutom hittades ett tillstånd med låg excitationsenergi, som kräver ytterligare studier. Med hjälp av det beräknade CD-spectret kunde det visas att bilirubin binder till albumin i P-formen vid neutralt pH.

This thesis focuses on investigations of transient dark states of fluorescentmolecules using spectroscopic techniques. The main purpose is to show andconvince the reader that transient dark states are not always a nuisance, butalso represent an additional source of information. Several studies with fluorescencecorrelation spectroscopy were performed, all related to non-fluorescentstates such as triplet state or isomerized states.Photobleaching is one of the main problems in virtually all of the fluorescencetechniques. In this thesis, mechanisms that retard photobleaching arecharacterized. Several compounds, antioxidants and triplet state quenchers,which decrease photobleaching, are studied, and guidelines for achieving optimalfluorescence brightness using these compounds are presented.Triplet state quenching by several compounds was studied. Detailed investigationsof the fluorescence quencher potassium iodide demonstratedthat for some of fluorophores, except of quenching, there is fluorescence enhancementmechanism present. In agreement with the first publication inthis thesis, antioxidative properties were found to play an important role inthe fluorescence enhancement. Quenching of the triplet state is proposedas a tool for monitoring diffusion mediated reactions over a wide range offrequencies.Specially designed fluorophores combining high triplet yields with reasonablefluorescence brightness and photostability were characterized forpossible applications in novel super-resolution imaging techniques based onfluorescence photoswitching. Except of benefits for imaging techniques, photoinducedswitching to non-fluorescent states could be used for monitoringmolecular diffusion, which was also demonstrated in this thesis.Studies of the triplet state kinetics of fluorophores close to dielectric interfaceswere performed using fluorescence spectroscopy. The analysis of thetriplet state kinetic can provide information about the local microenvironmentand electrostatic interactions near dielectric interfaces. / QC 20100414

L'objectif de ma thèse est d'étudier chez l'embryon de poisson zèbre le contrôle spatio-temporel de l'expression génétique induit par l'acide rétinoïque (RA). L'acide rétinoïque est un morphogène dérivé de la vitamine A qui est impliqué dans de nombreux processus lors du développement embryonnaire. Chez les vertébrés, cette molécule joue un rôle crucial dans la mise en place de l'axe antéro-postérieur et dorso-ventral ainsi que dans la segmentation du rhombocéphale (cerveau postérieur ou hindbrain) entre autre par la formation d'un gradient antéro-postérieur qui donne lieu à une expression différenciée des gènes Hox. Les isomères naturels de l'acide rétinoique tel que all-trans retinoic acid (ATRA), 9-cis RA et 13-cis RA font partie de la voie de signalisation de RA. Cette voie est médiée par 2 sous-types de récepteurs nucléaires: RAR et RXR agissent comme des facteurs de transcription. Les isomères de l'acide rétinoique possèdent des affinités différentes pour les 2 types de récepteur. Le 9-cis RA est capable de se lier avec RARs ou RXRs. Le ATRA est la forme pricipale de l'acide rétinoique dans l'organisme vivant, Il est le ligand des RAR. Le 13-cis RA est aussi capable de se lier avec RAR mais son affinité est très faible par rapport au ATRA. Grâce à cette faible affinité aux RAR, le 13-cis RA a été utilisé pour traiter l'acné et la leucémie afin de minimiser les effets tératogènesde ATRA. In vitro, Le 13-cis RA est capable de s' isomériser rapidement en ATRA apres illumination par UV. Cette isomérisation est aussi possible dans le sens inverse c'est-à-dire qu'on peut illuminer l'ATRA pour le transformer en 13-cis RA. Grâce à cette propriété chimique de l'acide rétinoique, J'ai pu développer une méthode qui permet d'activer ou d'inactiver l'acide rétïnoique par illumination aux UV avec une grande résolution spatio-temporelle dans un organisme vivant.

Chez Saccharomyces cerevisiae, les souches mutantes pour Rrd1, une protéine qui possède une activité de peptidyl prolyl cis/trans isomérase, montrent une résistance marquée à la rapamycine et sont sensibles au 4-nitroquinoline 1-oxide, un agent causant des dommages à l’ADN. PTPA, l’homologue de Rrd1 chez les mammifères, est reconnu en tant qu’activateur de protéine phosphatase 2A. Notre laboratoire a précédemment démontré que la surexpression de PTPA mène à l’apoptose de façon indépendante des protéines phosphatase 2A. La fonction moléculaire de Rrd1/PTPA était encore largement inconnue au départ de mon projet de doctorat. Mes recherches ont d’abord montré que Rrd1 est associé à la chromatine ainsi qu’à l’ARN polymérase II. L’analyse in vitro et in vivo par dichroïsme circulaire a révélé que Rrd1 est responsable de changements au niveau de la structure du domaine C-terminal de la grande sous-unité de l’ARN polymérase II, Rpb1, en réponse à la rapamycine et au 4-nitroquinoline 1-oxide. Nous avons également démontré que Rrd1 est requis pour modifier l’occupation de l’ARN polymérase II sur des gènes répondant à un traitement à la rapamycine. Finalement, nous avons montré que suite à un traitement avec la rapamycine, Rrd1 médie la dégradation de l’ARN polymérase II et que ce mécanisme est indépendant de l’ubiquitine. La dernière partie de mon projet était d’acquérir une meilleure connaissance de la fonction de PTPA, l’homologue de Rrd1 chez les mammifères. Nos résultats montrent que le «knockdown» de PTPA n’affecte pas la sensibilité des cellules à différentes drogues telles que la rapamycine, le 4-nitroquinoline 1-oxide ou le peroxyde d’hydrogène (H2O2). Nous avons également tenté d’identifier des partenaires protéiques pour PTPA grâce à la méthode TAP, mais nous ne sommes pas parvenus à identifier de partenaires stables. Nous avons démontré que la surexpression de la protéine PTPA catalytiquement inactive n’induisait pas l’apoptose indiquant que l’activité de PTPA est requise pour produire cet effet. Finalement, nous avons tenté d’étudier PTPA dans un modèle de souris. Dans un premier lieu, nous avons déterminé que PTPA était exprimé surtout au niveau des tissus suivants : la moelle osseuse, le thymus et le cerveau. Nous avons également généré avec succès plusieurs souris chimères dans le but de créer une souris «knockout» pour PTPA, mais l’allèle mutante ne s’est pas transférée au niveau des cellules germinales. Mes résultats ainsi que ceux obtenus par mon laboratoire sur la levure suggèrent un rôle général pour Rrd1 au niveau de la régulation des gènes. La question demeure toujours toutefois à savoir si PTPA peut effectuer un rôle similaire chez les mammifères et une vision différente pour déterminer la fonction de cette protéine sera requise pour adresser adéquatement cette question dans le futur. / In Saccharomyces cerevisiae, mutants devoid of Rrd1, a protein possessing in vitro peptidyl prolyl cis/trans isomerase activity, display striking resistance to rapamycin and show sensitivity to the DNA damaging agent 4-nitroquinoline 1-oxide. PTPA, the mammalian homolog of Rrd1, has been shown to activate protein phosphatase 2A. Our laboratory previously found that overexpression of PTPA leads to apoptosis independently of PP2A. At the outset of my thesis work, the molecular function of Rrd1/PTPA was largely unknown. My work has shown that Rrd1 is associated with the chromatin and interacts with RNA polymerase II. In vitro and in vivo analysis with circular dichroism revealed that Rrd1 mediates structural changes of the C-terminal domain of the large subunit of RNA pol II, Rpb1, in response to rapamycin and 4-nitroquinoline 1-oxide. Consistent with this, we demonstrated that Rrd1 is required to alter RNA pol II occupancy on rapamycin responsive genes. We also showed that upon rapamycin exposure Rrd1 mediates the degradation of RNA polymerase II and that this mechanism is ubiquitin-independent. Another part of my work was to gain insight into the function of PTPA, the mammalian counterpart of Rrd1. PTPA knockdown did not affect sensitivity to rapamycin, 4-nitroquinoline 1-oxide or H2O2. We also attempted to find protein interaction partners for PTPA using tandem affinity purification, but no stable partners for PTPA were found. We also demonstrated that overexpression of a catalytically inactive PTPA mutant did not induce apoptosis, indicating that PTPA activity is required to produce this effect. Finally, we attempted to study PTPA in a mouse model. We first determined that PTPA was expressed in a tissue-specific manner and was most abundant in bone marrow, thymus and brain. We pursued creation of a knockout mouse and successfully generated chimeras, but the mutated allele was not transmitted to the germline. My data and other data from our laboratory regarding the yeast work suggest a general role for Rrd1 in regulation of gene transcription. Whether PTPA has a similar function in mammalian cells remains unknown, and a different vision of what the protein does in mammalian cells will be required to adequately address this question in the future.

Chez Saccharomyces cerevisiae, les souches mutantes pour Rrd1, une protéine qui possède une activité de peptidyl prolyl cis/trans isomérase, montrent une résistance marquée à la rapamycine et sont sensibles au 4-nitroquinoline 1-oxide, un agent causant des dommages à l’ADN. PTPA, l’homologue de Rrd1 chez les mammifères, est reconnu en tant qu’activateur de protéine phosphatase 2A. Notre laboratoire a précédemment démontré que la surexpression de PTPA mène à l’apoptose de façon indépendante des protéines phosphatase 2A. La fonction moléculaire de Rrd1/PTPA était encore largement inconnue au départ de mon projet de doctorat. Mes recherches ont d’abord montré que Rrd1 est associé à la chromatine ainsi qu’à l’ARN polymérase II. L’analyse in vitro et in vivo par dichroïsme circulaire a révélé que Rrd1 est responsable de changements au niveau de la structure du domaine C-terminal de la grande sous-unité de l’ARN polymérase II, Rpb1, en réponse à la rapamycine et au 4-nitroquinoline 1-oxide. Nous avons également démontré que Rrd1 est requis pour modifier l’occupation de l’ARN polymérase II sur des gènes répondant à un traitement à la rapamycine. Finalement, nous avons montré que suite à un traitement avec la rapamycine, Rrd1 médie la dégradation de l’ARN polymérase II et que ce mécanisme est indépendant de l’ubiquitine. La dernière partie de mon projet était d’acquérir une meilleure connaissance de la fonction de PTPA, l’homologue de Rrd1 chez les mammifères. Nos résultats montrent que le «knockdown» de PTPA n’affecte pas la sensibilité des cellules à différentes drogues telles que la rapamycine, le 4-nitroquinoline 1-oxide ou le peroxyde d’hydrogène (H2O2). Nous avons également tenté d’identifier des partenaires protéiques pour PTPA grâce à la méthode TAP, mais nous ne sommes pas parvenus à identifier de partenaires stables. Nous avons démontré que la surexpression de la protéine PTPA catalytiquement inactive n’induisait pas l’apoptose indiquant que l’activité de PTPA est requise pour produire cet effet. Finalement, nous avons tenté d’étudier PTPA dans un modèle de souris. Dans un premier lieu, nous avons déterminé que PTPA était exprimé surtout au niveau des tissus suivants : la moelle osseuse, le thymus et le cerveau. Nous avons également généré avec succès plusieurs souris chimères dans le but de créer une souris «knockout» pour PTPA, mais l’allèle mutante ne s’est pas transférée au niveau des cellules germinales. Mes résultats ainsi que ceux obtenus par mon laboratoire sur la levure suggèrent un rôle général pour Rrd1 au niveau de la régulation des gènes. La question demeure toujours toutefois à savoir si PTPA peut effectuer un rôle similaire chez les mammifères et une vision différente pour déterminer la fonction de cette protéine sera requise pour adresser adéquatement cette question dans le futur. / In Saccharomyces cerevisiae, mutants devoid of Rrd1, a protein possessing in vitro peptidyl prolyl cis/trans isomerase activity, display striking resistance to rapamycin and show sensitivity to the DNA damaging agent 4-nitroquinoline 1-oxide. PTPA, the mammalian homolog of Rrd1, has been shown to activate protein phosphatase 2A. Our laboratory previously found that overexpression of PTPA leads to apoptosis independently of PP2A. At the outset of my thesis work, the molecular function of Rrd1/PTPA was largely unknown. My work has shown that Rrd1 is associated with the chromatin and interacts with RNA polymerase II. In vitro and in vivo analysis with circular dichroism revealed that Rrd1 mediates structural changes of the C-terminal domain of the large subunit of RNA pol II, Rpb1, in response to rapamycin and 4-nitroquinoline 1-oxide. Consistent with this, we demonstrated that Rrd1 is required to alter RNA pol II occupancy on rapamycin responsive genes. We also showed that upon rapamycin exposure Rrd1 mediates the degradation of RNA polymerase II and that this mechanism is ubiquitin-independent. Another part of my work was to gain insight into the function of PTPA, the mammalian counterpart of Rrd1. PTPA knockdown did not affect sensitivity to rapamycin, 4-nitroquinoline 1-oxide or H2O2. We also attempted to find protein interaction partners for PTPA using tandem affinity purification, but no stable partners for PTPA were found. We also demonstrated that overexpression of a catalytically inactive PTPA mutant did not induce apoptosis, indicating that PTPA activity is required to produce this effect. Finally, we attempted to study PTPA in a mouse model. We first determined that PTPA was expressed in a tissue-specific manner and was most abundant in bone marrow, thymus and brain. We pursued creation of a knockout mouse and successfully generated chimeras, but the mutated allele was not transmitted to the germline. My data and other data from our laboratory regarding the yeast work suggest a general role for Rrd1 in regulation of gene transcription. Whether PTPA has a similar function in mammalian cells remains unknown, and a different vision of what the protein does in mammalian cells will be required to adequately address this question in the future.

Ce travail de thèse porte sur l'étude des propriétés optiques des composés à transition d'état de spin (TS). Nous avons plus précisément caractérisé la transition photo-induite faisant passer les complexes de Fe(II) de l'état bas-spin (BS) vers l'état haut-spin (HS) et réciproquement. Ces molécules on été étudiées à la fois sous forme solide et en solution. À l'état solide, La TS des complexes moléculaires que nous avons étudié présente une boucle d'hystérésis thermique proche de la température ambiante. En plaçant ces composés à une température comprise dans cette dernière, il est alors possible de faire photo-commuter partiellement ou complètement ce type de molécule. Après avoir étudié les paramètres influençant l'efficacité de la TS photo-induite, nous avons réalisé un montage permettant d'enregistrer la dynamique de cette transition dans la boucle d'hystérésis.Dans un second temps, nous avons dissous ces molécules dans un solvant adéquate, afin d'étudier les mécanismes élémentaires, à l'échelle de la molécule, qui sont à l'oeuvre lors de la TS. Nous avons plus particulièrement étudié deux complexes: [Fe(phen)3](BF4)2 et [Fe(2-CH3-phen)3](BF4)2. Le premier se présente à l'état BS à température ambiante, tandis que le second est à l'état HS. Nous avons alors révélé l'ensemble des étapes faisant commuter le premier complexe de l'état BS vers l'état HS et le second de l'état HS vers l'état BS. Dans une troisième et dernière partie, nous avons étudié la photo-isomérisation d'un cristal de Na2[Fe(CN)5NO].2H2O. Sous l'effet d'une excitation laser, le radical N-O peut réaliser une rotation sur lui même, soit de 90°, soit de 180°. Nous avons alors mesuré la dynamique de cette isomérisation photo-induite avec un montage, pompe visible, sonde infrarouge (~5µm). / This work deals with the study of the optical properties of spin cross-over (SCO) compounds. More precisely, we have characterized the photo-induced transition leading iron(II) SCO complexes from their low-spin (LS) to their high-spin (HS) states and conversely. These molecules have been studied in the solid state and in solution.In the solid state, our compounds display a thermal hysteresis loop at room temperature. When the temperature of the compounds is set inside their hysteresis loop, it is possible to switch them optically from the LS state to the HS state. First, we have studied the parameters impacting on the efficiency of the photo-induced SCO. Then, we have built an experimental set-up that makes it possible to record the kinetics of this transition inside the hysteresis loop. This latter experiment has confirmed our hypothesis that this phase transition is induced by a laser heating of the sample.In solution, we have studied, by means of time-resolved UV-visible pump-probe experiments, the elementary mechanisms involved in the SCO phenomenon. We focused our attention on two complexes: [Fe(phen)3](BF4)2 and [Fe(2-CH3-phen)3](BF4)2. The first one is in the LS state at room temperature, whereas the other one is in the HS state. Thanks to these experiments, we have evidenced and measured the lifetimes of the energy levels involved in the SCO at the molecular level.Finally, we have studied the photo-isomerization of a Na2[Fe(CN)5NO].2H2O crystal. By means of transient absorption experiments combining visible and infrared femtosecond pulses, we have evidenced the levels involved in this phase transition.

Title: Study of Diradicals by Explicitly Correlated Multireference Coupled Cluster Methods Author: Matej Švaňa Department: Department of Physical and Macromelecular Chemistry Supervisor: Mgr. Jiří Pittner, Dr. rer. nat., J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry Abstract: Total energies of cyclopropane, trimethylene, and propylidene were calculated with conventional post-HF CCSD(T), BWCCSD(T), MkCCSD(T) methods and their explicitly correlated alternatives. Main aims of the the- sis were to compare the basis set convergence of total energies and relative energies between cyclopropane and trimethylene/propylidene, both at the conventional and the explicitly correlated levels. It was shown that use of explicit correlation accelerates the convergence of the total energy by one or- der of basis set quality, resulting in considerable savings in computational times. Also, the MkCCSD(T)-F12/QZ and the BWCCSD(T)-F12/QZ calcula- tions belong to the most sophisticated approaches employed for estimation of the relative energies of cyclopropane and trimethylene/propylidene to date. Keywords: explicitly correlated, coupled cluster, multi-reference, cyclopropane isomerisation, trimethylene, propylidene 1