Dans le noyau cellulaire, l’ADN est compacté autour de petites protéines appelées histones formant ainsi le nucléosome, unité de base de la chromatine. Les nucléosomes contrôlent la liaison des facteurs de transcription à l’ADN et sont ainsi responsables de la régulation des processus cellulaires tels que la transcription. Afin de permettre l’expression des gènes, la chromatine est remodelée, c’est-à-dire que les nucléosomes sont repositionnés de manière à ce que la machinerie générale de la transcription puisse atteindre l’ADN afin de produire l’ARN messager. La moindre petite modification dans la fonction des facteurs de transcription ou des enzymes responsables du remodelage de la chromatine entraine des variations d’expression des gènes, et donc des maladies telles que les cancers. Le cancer du sein est le cancer le plus couramment développé chez les femmes. Cette maladie est principalement causée par l’activité du récepteur des œstrogènes ERα et de ses co-régulateurs ayant, pour la plupart, un rôle direct sur le remodelage de la chromatine. Afin de mieux comprendre le développement et la progression du cancer du sein, nous avons décidé d’étudier le rôle de deux co-régulateurs de ERα, TLE3 et KDM5A, impliqués dans le remodelage de la chromatine et dont la fonction dans le cancer du sein est indéterminée. Nous avons démontré que TLE3 est un partenaire d’interaction du facteur pionnier FoxA1, facteur nécessaire à la liaison de ERα sur l’ADN pour la transcription des gènes cibles de ce récepteur. L’interaction de TLE3 avec FoxA1 inhibe la liaison de ERα à l’ADN en absence d’œstrogènes, via le recrutement de HDAC2 qui déacétyle la chromatine, empêchant alors l’activation fortuite de la transcription en absence de signal. Quant à KDM5A, malgré sa réputation de répresseur de la transcription, dans le cancer du sein, cette déméthylase de H3K4me2/3 est un coactivateur de ERα, dû à son rôle direct sur l’expression du récepteur.

Recent advances in high throughput technology have opened the door to systematic studies of epigenetic mechanisms. One of the key components in the regulation of the cell cycle and differentiation is the retinoblastoma protein (pRB), a component of the RB/E2F tumor suppressor pathway that is frequently deregulated in cancer. The RBP2/KDM5A histone demethylase was shown to interact with pRB and regulate pRB function during differentiation. However, how precisely differentiation is coupled with halted cell cycle progression and whether an epigenetic mechanism is involved remain unknown. In the present study, I analyzed gene expression levels of human histone methyltransferases (HMT) and demethylases (HDM), as well as their targets in human cancers; and focused on RB/KDM5A connection in control of cell cycle and differentiation. In particular, I used Drosophila as a model to describe a novel mechanism where the RB/E2F pathway interacts with the Hippo tumor suppressor pathway to synergistically control cell cycle exit upon differentiation. Studying the role of miR-11, I found that the inhibition of dE2F1-induced cell death is its highly specialized function. Furthermore, I studied the induction of differentiation and apoptosis as the consequences of KDM5A deletion in cells derived from Rb knockout mice. I concluded that during differentiation, KDM5A plays a critical role at the enhancers of cell type-specific genes and at the promoters of E2F targets; in cooperation with other repressor complexes, it silences cell cycle genes. I found that KDM5A binds to transcription start sites of the majority of genes with H3K4 methylation. These are highly expressed genes, involved in certain biological processes, and occupied by KDM5A in an isoform-specific manner. KDM5A plays a unique and non-redundant role in histone demethylation and its promoter binding pattern highly overlaps with the opposing enzyme, MLL1. Finally, I found that HMT and HDM enzymes exhibit a distinct co-expression pattern in different cancer types, and this determines the level of expression of their target genes. / Los avances recientes en las tecnologías de alto flujo han abierto el camino a los estudios sistemáticos de los mecanismos epigenéticos. La proteína retinoblastoma (pRB), uno de los elementos de la ruta de supresión de tumores RB/E2F que se encuentra desregulado con frecuencia en el cáncer, es uno de los componentes esenciales de la regulación del ciclo celular y la diferenciación. Sin embargo, aún no se conoce de qué manera precisa la diferenciación se acopla a la detención del avance del ciclo celular y si hay algún mecanismo epigenético vinculado a este proceso. En este estudio, he analizado los niveles de expresión de histona metiltransferasas (HMT) y desmetilasas humanas (HDM), así como sus dianas en cánceres humanos, y me he centrado en la conexión de RB/KDM5A en el control del ciclo celular y la diferenciación. Específicamente, utilicé Drosophila como modelo para describir un mecanismo nuevo mediante el cual RB/E2F interactúa con la ruta Hippo de supresión de tumores para controlar de manera sinérgica la detención del ciclo celular relacionada con la diferenciación. Mediante la investigación del papel de miR-11, determiné que su función altamente especializada es la inhibición de la muerte celular inducida por dE2F1. Además, estudié la inducción de la diferenciación y la apoptosis como consecuencia de la pérdida de KDMA5 en células obtenidas a partir de ratones sin Rb. Extraje como conclusión que, durante la diferenciación, KDMA5 desempeña un papel esencial sobre los estimuladores de los genes específicos de los tipos celulares, así como en los promotores de las dianas de E2F; en cooperación con otros complejos represores silencia a los genes del ciclo celular. Investigué el mecanismo de reclutamiento de KDM5A y encontré que se une al sitio de inicio de la transcripción de la mayoría de los genes que poseen metilación en H3K4. Estos genes tienen elevados niveles de expresión, están involucrados en determinados procesos biológicos y están ocupados por diferentes isoformas de KDM5A. KDM5A desempeña un papel único y no redundante en la desmetilación de las histonas y que en gran medida se solapa con la enzima con la función opuesta, MLL1. Para terminar, encontré que las enzimas HMT y HDM muestran patrones de co-expresión distintos en diferentes tipos de cáncer, y que este hecho determina los niveles de expresión de sus genes diana.

Acute myeloid leukemia (AML) is a genetically heterogeneous disease and represents about 20% of pediatric leukemias. Survival rates vary depending on subtypes but are particularly unfavorable for acute megakaryoblastic leukemia (AMKL), a rare subtype of AML that usually affects children under 3 years old (≤ 30% survival for certain subtypes of AMKL). In pediatrics, genetic rearrangement leading to the expression of a chimeric fusion gene are present in many cases and are considered initiator events in the development of leukemia. In AMKL cases, more than 70% of them exhibit such rearrangement. Several of these chimeric transcripts, such as NUP98::KDM5A and CBFA2T3::GLIS2, occur in a higher proportion of cases. The analysis of the transcriptome from pediatric leukemic cases allowed us to identify new chimeric fusion transcripts in pediatric leukemias. Specifically, we discovered BPTF as a new fusion partner of NUP98 in the case of acute megakaryoblastic leukemia (AMKL), and the ACIN1::NUTM1 fusion in B-cell lymphoid leukemias. These studies have refined the molecular classification of these leukemias and provided tools for diagnosis and disease monitoring. The hypothesis of my thesis is that the NUP98::KDM5A and CBFA2T3::GLIS2 fusions are oncogenic and their expression in normal human hematopoietic and progenitor cells leads to transformation into acute megakaryoblastic leukemia in immunodeficient recipient mice, allowing for the generation of renewable xenograft models. My work has contributed to the generation of AMKL models with NUP98::KDM5A (N5A) and CBFA2T3::GLIS2 (CG2) fusions. To do this, we optimized a pipeline for transducing these chimeric genes in CD34+ cells isolated from cord blood, followed by transplantation into immunodeficient mice. These xenograft models phenocopy the leukemia of patients from a morphological, immunophenotypic, and transcriptomic standpoint. These synthetic AMKL models can be serially transplanted into mice and have a high frequency of leukemic stem cells. I also contributed to the development of a unique patient-derived xenograft (PDX) model derived from primary cells of a patient with an NUP98::BPTF genotype AMKL leukemia. These synthetic and PDX models then served as substrates for my experiments and those of several members of our laboratory. My research has allowed us to identify and characterize new biomarkers specific to NUP98- rearranged and CBFA2T3::GLIS2 positive AMKL. Taking advantage of the biomass generated by these AMKL leukemia models, we conducted transcriptomic and proteomic studies of the membrane surface. These results were compared to normal cells isolated from cord blood to identify several surface proteins specific to each leukemia genotype and shed light on new potential biomarkers. Furthermore, we confirmed the sensitivity of our AMKL models to JAK-STAT pathway inhibitors and performed synergy assays between JAK-STAT and the PI3K-AKT-mTOR pathway inhibitors. These experiments demonstrated the synergistic induction of apoptosis in our models upon the combine exposure to JAK-STAT and PI3K-AKT-mTOR pathway inhibitors. These works allowed us to identify potential therapeutic vulnerabilities of AMKL. Finally, since research on AMKL is affected by the limited number of patient samples, the human models and molecular data presented in this thesis constitute an invaluable resource to accelerate translational research for these high-risk leukemias. / La leucémie myéloïde aiguë (LMA) est une maladie hétérogène sur le plan génétique et représente environ 20% des leucémies pédiatriques. Les taux de survie varient selon les sous- types mais sont particulièrement défavorables pour les leucémies aiguës mégacaryoblastiques (AMKL), un sous-type rare de LMA touchant généralement les enfants de moins de 3 ans (≤ 30% de survie pour certains sous-types d’AMKL). En pédiatrie, les réarrangements génétiques entraînant l’expression d’un gène de fusion chimérique sont présentes dans un grand nombre de cas et sont considérées comme des événements initiateurs à l’origine de la leucémie. Chez les leucémies de type AMKL, c’est plus de 70% des cas qui présentent un tel réarrangement. Quelques-uns de ces transcrits chimériques, tels que NUP98::KDM5A et CBFA2T3::GLIS2, surviennent dans une plus grande proportion des cas. Dans le cadre de mes recherches, l’analyse du transcriptome de leucémies pédiatriques nous ont permis de mettre en évidence de nouveaux transcrits chimériques. Notamment, nous avons découvert BPTF comme étant un nouveau partenaire de fusion de NUP98 dans le cas d’une AMKL, ainsi que la fusion ACIN1::NUTM1 chez des leucémies lymphoïdes à cellules B. Ces travaux ont permis de raffiner la classification moléculaire de ces leucémies et propose de nouvelles approches pour le diagnostic et le suivi de la maladie. L’hypothèse de ma thèse est que les fusions NUP98::KDM5A et CBFA2T3::GLIS2 sont oncogéniques et leur expression chez des cellules souches hématopoïétiques et progénitrices humaines normales entraîne une transformation en leucémie aiguë mégacaryoblastique dans les souris receveuses immunodéficientes, permettant de générer des modèles de xénogreffe. Mes travaux ont contribué à la génération de modèles d’AMKL arborant les fusions NUP98::KDM5A ainsi que CBFA2T3::GLIS2. Pour ce faire, nous avons optimisé un processus de transduction de ces gènes chimériques chez des cellules CD34+ isolées de sang de cordon, suivi de transplantation chez la souris immunodéficiente. Ces modèles de xénogreffe récapitulent la leucémie des patients aux points de vue morphologique, immunophenotypique et transcriptomique. Ces modèles synthétiques d’AMKL peuvent être transplantés de manière sériée en souris et présentent une fréquence élevée de cellules souches leucémiques. De plus, nous avons aussi développé un modèle pdx unique (patient derived xenograft) dérivé des cellules primaires d’un patient atteint d’une leucémie AMKL présentant la fusions NUP98::BPTF. Ces modèles synthétiques et pdx ont ensuite servi de substrats à mes expériences ainsi que celles de plusieurs membres du laboratoire. Mes recherches ont permis d’identifier et de caractériser de nouveaux biomarqueurs spécifiques aux AMKL présentant un transcrit de NUP98 réarrangé et CBFA2T3::GLIS2. Tirant avantage de la biomasse générée par ces modèles de leucémie AMKL, nous avons fait des études transcriptomiques et protéomiques de la surface membranaire de nos modèles. Ces résultats furent comparés aux cellules normales isolées de sang de cordon afin d’identifier plusieurs protéines de surface spécifiques aux leucémies initiées par NUP98 réarrangé et CBFA2T3::GLIS2 afin de mettre en lumière de nouveaux biomarqueurs potentiels. De plus, nous avons aussi confirmé la sensibilité de nos modèles AMKL aux inhibiteurs de la voie JAK-STAT ainsi que démontré l’induction synergique de l’apoptose de nos modèles en présence des inhbitieurs combinés des voies JAK-STAT et PI3K-AKT-mTOR. Finalement, puisque la recherche sur les AMKL est ralentie par la quantité limitante d’échantillons de patient, les modèles humains et les données moléculaires présentés dans cette thèse constituent une ressource inestimable afin d’accélérer la recherche translationnelle pour ces leucémies à haut risque.