Dans le noyau cellulaire, l’ADN est compacté autour de petites protéines appelées histones formant ainsi le nucléosome, unité de base de la chromatine. Les nucléosomes contrôlent la liaison des facteurs de transcription à l’ADN et sont ainsi responsables de la régulation des processus cellulaires tels que la transcription. Afin de permettre l’expression des gènes, la chromatine est remodelée, c’est-à-dire que les nucléosomes sont repositionnés de manière à ce que la machinerie générale de la transcription puisse atteindre l’ADN afin de produire l’ARN messager. La moindre petite modification dans la fonction des facteurs de transcription ou des enzymes responsables du remodelage de la chromatine entraine des variations d’expression des gènes, et donc des maladies telles que les cancers. Le cancer du sein est le cancer le plus couramment développé chez les femmes. Cette maladie est principalement causée par l’activité du récepteur des œstrogènes ERα et de ses co-régulateurs ayant, pour la plupart, un rôle direct sur le remodelage de la chromatine. Afin de mieux comprendre le développement et la progression du cancer du sein, nous avons décidé d’étudier le rôle de deux co-régulateurs de ERα, TLE3 et KDM5A, impliqués dans le remodelage de la chromatine et dont la fonction dans le cancer du sein est indéterminée. Nous avons démontré que TLE3 est un partenaire d’interaction du facteur pionnier FoxA1, facteur nécessaire à la liaison de ERα sur l’ADN pour la transcription des gènes cibles de ce récepteur. L’interaction de TLE3 avec FoxA1 inhibe la liaison de ERα à l’ADN en absence d’œstrogènes, via le recrutement de HDAC2 qui déacétyle la chromatine, empêchant alors l’activation fortuite de la transcription en absence de signal. Quant à KDM5A, malgré sa réputation de répresseur de la transcription, dans le cancer du sein, cette déméthylase de H3K4me2/3 est un coactivateur de ERα, dû à son rôle direct sur l’expression du récepteur.

La différenciation sexuelle du système nerveux central est régie par les hormones stéroïdes sexuelles. Chez la femelle, les ovaires sont silencieux pendant la période fœtale et le cerveau est protégé de l’action masculinisante de l’œstradiol périnatal par l’action de l’α-fœtoprotéine. Des études révèlent un rôle actif de l’œstradiol ovarien postnatal dans la mise en place de la puberté et la féminisation des circuits neuraux gouvernant l’expression du comportement sexuel. A l’âge adulte, l’œstradiol a un rôle activationnel dans la régulation de l’axe hypothalamo-hypophysaire-gonadotrope (HPG) et les comportements reproducteurs. Il agit principalement via les récepteurs des œstrogènes nucléaires ERα et ERβ. L’ERα neural est indispensable à la maturation et la régulation de l’axe HPG et à l’expression du comportement sexuel. Le rôle de l’ERβ neural restait à clarifier. Au cours de ma thèse, nous avons généré un modèle de souris invalidées de manière sélective pour l’ER neural. Les femelles mutantes sont fertiles et ne présentent pas d’altération de l’axe HPG, ni de l’expression du comportement sexuel. Elles présentent un retard de puberté, corrélé à une diminution de l’expression prépubertaire de la kisspeptine dans le noyau rostral périventriculaire du 3e ventricule. Nous avons aussi étudié les effets d’une exposition maternelle au bisphénol A (BPA) sur les fonctions de reproduction femelle. Les résultats obtenus révèlent un rôle de l’ER dans la mise en place de la puberté et la régulation de l’expression de la kisspeptine dans le RP3V, et un effet du BPA probablement pendant la période postnatale/prépubertaire sur les fonctions neuroendocrines et comportementales femelles. / Sexual differentiation of the central nervous system is governed by the sex steroid hormones. In females, the ovaries are inactive during the fetal period, and the brain is protected from the masculinizing action of perinatal estradiol by the action of α-fetoprotein. Recent studies suggest an active role of postnatal ovarian estradiol in the establishment of puberty and feminization of neural circuits involved in the expression of female sexual behavior. In adulthood, estradiol has an activational role in the regulation of the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis and reproductive behaviors. Estradiol acts mainly via nuclear estrogen receptors ERα and ERβ. Neural ERα is essential for the maturation and the regulation of the HPG axis, as well as the expression of sexual behavior. The role of neural ERβ remained to be clarified. During my thesis, we generated a mouse model selectively lacking ERβ in the nervous system. The mutant females show normal fertility, HPG axis regulation, and expression of sexual behavior. However, these mice have delayed puberty, correlated with a significant decrease in prepubertal expression of kisspeptin in the rostral periventricular area of the third ventricle (RP3V). Furthermore, we studied the effects of maternal exposure to bisphenol A (BPA) on the regulation of female reproductive functions. The overall results highlight the importance of ERβ in the postnatal/prepubertal regulation of kisspeptin expression and pubertal onset, as well as the potential effects of BPA during this period on neuroendocrine and behavioral responses.

Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent chez la femme. Sa croissance et sa progression sont dépendantes de signaux hormonaux, tels que les œstrogènes, et de l’interaction des cellules cancéreuses avec le microenvironnement matriciel. La perte d’expression du récepteur aux estrogènes ERα est un marqueur de mauvais pronostic et de non réponse à l’hormonothérapie. Dans ces tumeurs agressives, l’expression du SDC-1, un protéoglycane transmembranaire impliqué dans l’angiogenèse, la prolifération et l’invasion, est augmentée suggérant un antagonisme entre la signalisation œstrogénique et le SDC-1 dans ces tumeurs. En utilisant les cellules de carcinome mammaire ER(+) MCF7, nous avons montré que les œstrogènes via le récepteur ERα sont capables d’inhiber l’expression du SDC 1 par un mécanisme nécessitant une néosynthèse protéique et la phosphorylation d’ERα par la kinase IKK. Parallèlement, nos résultats montrent que la dérégulation de l’expression du SDC-1 affecte la réponse proliférative des œstrogènes dans les cellules MCF7 en modifiant la localisation subcellulaire d’ERα. Nos résultats montrent à la fois l’inhibition tonique et E2-induite de l’expression du SDC-1 par ERα dans les cellules MCF7 et la potentialité du SDC-1 à réduire la réponse œstrogénique de ces cellules. Ainsi, ces résultats sont autant d’arguments qui renforcent l'hypothèse d'un antagonisme entre la signalisation médiée par ERα et le SDC-1 lequel influencerait l'orientation phénotypique des cellules de carcinome mammaire. / Breast cancer is the most common cancer in women. Its growth and progression depend on hormone signals, such as estrogens, and on interactions with the matrix microenvironment. The loss of the estrogen receptor ERα expression is a poor prognosis marker and predicts a resistance to antihormonal therapies. In these aggressive tumors, SDC-1 expression, a transmembrane proteoglycan involved in angiogenesis, proliferation and invasiveness is increased suggesting an antagonism between estrogenic signaling and SDC-1 in breast tumors. Using ER (+) MCF7 mammary carcinoma cells, we have shown that estrogens via the ERα are able to inhibit the expression of SDC-1 by a mechanism requiring protein synthesis and phosphorylation of ERα by the IKK kinase. Additionally, our results show that dysregulation of SDC-1 expression affects the proliferative response to estrogens in MCF7 cells by altering the subcellular localization of ERα. Our results show both a tonic and E2-induced inhibition of SDC-1 expression by ERα in MCF7 cells and the potentiality of SDC-1 to reduce the estrogenic response of these cells. Thus, these results support the hypothesis that an antagonism between ERα signaling and SDC-1 which could influence the phenotypic orientation of mammary carcinoma cells.

It is well established that the 17-estradiol is involved in the development and homeostasis of reproductive and extra-reproductive tissues, particularly the mammary gland. Estradiol classically binds to Estrogen Receptor (ERα), which is a member of the nuclear receptor superfamily. ER mediates nuclear (transcription) and plasma membrane (signaling) ERα function. Interestingly, the membrane initiated steroid signaling (MISS) required a post translational modification of the receptor: palmitoylation of the human Cys-447 or the murine Cys-451 counterpart. The main objectives of my PhD thesis were to decipher the physiological role of membrane ERα in mammary gland development and to understand how the membrane ER signaling impact breast cancer. To do so, we used the transgenic mouse model C451A-ER in which the single point mutation (C451A) was introduced to abolish palmitoylation of ER (membrane addressing signal). We demonstrate that the point mutation of the palmitoylation site of ER alters the paracrine signaling of luminal epithelial cells and by consequence the repopulation properties of the mammary stem cells. We also studied the involvement of the membrane effects of the Estrogen Receptor ERα in the 17β-estradiol response dose of the mammary gland. Finally, by breeding the C451A-ER mice with the widely used transgenic mice model of tumorigenesis (PyMT), we provide the first evidence that the membrane ERα influences tumorigenesis. These findings pave the way on an unexpected role of non-genomic function of ERα in the mammary gland physiology and physiopathology. / It is well established that the 17-estradiol is involved in the development and homeostasis of reproductive and extra-reproductive tissues, particularly the mammary gland. Estradiol classically binds to Estrogen Receptor (ERα), which is a member of the nuclear receptor superfamily. ER mediates nuclear (transcription) and plasma membrane (signaling) ERα function. Interestingly, the membrane initiated steroid signaling (MISS) required a post translational modification of the receptor: palmitoylation of the human Cys-447 or the murine Cys-451 counterpart. The main objectives of my PhD thesis were to decipher the physiological role of membrane ERα in mammary gland development and to understand how the membrane ER signaling impact breast cancer. To do so, we used the transgenic mouse model C451A-ER in which the single point mutation (C451A) was introduced to abolish palmitoylation of ER (membrane addressing signal). We demonstrate that the point mutation of the palmitoylation site of ER alters the paracrine signaling of luminal epithelial cells and by consequence the repopulation properties of the mammary stem cells. We also studied the involvement of the membrane effects of the Estrogen Receptor ERα in the 17β-estradiol response dose of the mammary gland. Finally, by breeding the C451A-ER mice with the widely used transgenic mice model of tumorigenesis (PyMT), we provide the first evidence that the membrane ERα influences tumorigenesis. These findings pave the way on an unexpected role of non-genomic function of ERα in the mammary gland physiology and physiopathology.

Les facteurs de transcription sont des protéines spécialisées qui jouent un rôle important dans différents processus biologiques tel que la différenciation, le cycle cellulaire et la tumorigenèse. Ils régulent la transcription des gènes en se fixant sur des séquences d’ADN spécifiques (éléments cis-régulateurs). L’identification de ces éléments est une étape cruciale dans la compréhension des réseaux de régulation des gènes. Avec l’avènement des technologies de séquençage à haut débit, l’identification de tout les éléments fonctionnels dans les génomes, incluant gènes et éléments cis-régulateurs a connu une avancée considérable. Alors qu’on est arrivé à estimer le nombre de gènes chez différentes espèces, l’information sur les éléments qui contrôlent et orchestrent la régulation de ces gènes est encore mal définie. Grace aux techniques de ChIP-chip et de ChIP-séquençage il est possible d’identifier toutes les régions du génome qui sont liées par un facteur de transcription d’intérêt. Plusieurs approches computationnelles ont été développées pour prédire les sites fixés par les facteurs de transcription. Ces approches sont classées en deux catégories principales: les algorithmes énumératifs et probabilistes. Toutefois, plusieurs études ont montré que ces approches génèrent des taux élevés de faux négatifs et de faux positifs ce qui rend difficile l’interprétation des résultats et par conséquent leur validation expérimentale. Dans cette thèse, nous avons ciblé deux objectifs. Le premier objectif a été de développer une nouvelle approche pour la découverte des sites de fixation des facteurs de transcription à l’ADN (SAMD-ChIP) adaptée aux données de ChIP-chip et de ChIP-séquençage. Notre approche implémente un algorithme hybride qui combine les deux stratégies énumérative et probabiliste, afin d’exploiter les performances de chacune d’entre elles. Notre approche a montré ses performances, comparée aux outils de découvertes de motifs existants sur des jeux de données simulées et des jeux de données de ChIP-chip et de ChIP-séquençage. SAMD-ChIP présente aussi l’avantage d’exploiter les propriétés de distributions des sites liés par les facteurs de transcription autour du centre des régions liées afin de limiter la prédiction aux motifs qui sont enrichis dans une fenêtre de longueur fixe autour du centre de ces régions. Les facteurs de transcription agissent rarement seuls. Ils forment souvent des complexes pour interagir avec l’ADN pour réguler leurs gènes cibles. Ces interactions impliquent des facteurs de transcription dont les sites de fixation à l’ADN sont localisés proches les uns des autres ou bien médier par des boucles de chromatine. Notre deuxième objectif a été d’exploiter la proximité spatiale des sites liés par les facteurs de transcription dans les régions de ChIP-chip et de ChIP-séquençage pour développer une approche pour la prédiction des motifs composites (motifs composés par deux sites et séparés par un espacement de taille fixe). Nous avons testé ce module pour prédire la co-localisation entre les deux demi-sites ERE qui forment le site ERE, lié par le récepteur des œstrogènes ERα. Ce module a été incorporé à notre outil de découverte de motifs SAMD-ChIP. / Transcription factors (TF) play important roles in various biological processes such as differentiation, cell cycle progression and tumorigenesis. They regulate gene expression by binding to specific DNA sequences (TFBS). Identifying these cis-regulatory elements is a crucial step to understand gene regulatory networks. Technological developments have enhanced DNA sequencing at genomic scale. On the basis of the resulting sequences, computational biologists now attempt to localize the most important functional regions, starting with genes, but also importantly the whole genome characterization of transcription factor binding sites and allow the development of several computational DNA motif discovery tools. Although these various tools are widely used and have been successful at discovering novel motifs, they are not adapted to ChIP-chip and ChIP-sequencing data. The main drawback of these approaches is that most of the predicted motifs represent artifacts due to an inefficient assessment of their enrichment. This thesis is about transcription factor proteins and statistical analysis of their binding sites in ChIP-chip and ChIP-sequencing data. The first objective was to develop a new do novo DNA motif discovery tool adapted to ChIP-chip and ChIP-sequencing data. SAMD-ChIP combines enumerative and stochastic strategies to predict enriched motifs in the vicinity of the ChIP peak summits. Our approach is an automated pipeline that includes motif discovery, motif clustering, motif optimization and finally motif identification using transcription factor (TF) databases. SAMD-ChIP outperforms state-of-the-art motif discovery tools in term of the number of predicted motifs and the prediction of rare and degenerate motifs. In particular, SAMD-ChIP efficiently identifies gapped motifs such as inverted or direct repeats bound by nuclear receptors and composite motifs resulting from the association of different single TF binding sites. The underlying assumption of the second objective is that in regulatory regions, binding sites of interacting transcription factors co-occur more often than expected by chance in the vicinity of the ChIP-peak summits. We proposed an approach to predict transcription factor binding sites co-localization based on the prediction of single motifs by do novo motif discovery tools or by using TFBS models from TF data bases.

Deux tiers des cancers du sein expriment le récepteur des œstrogènes alpha (ERα), un facteur de transcription ligand dépendant responsable de la prolifération oncogénique de ces cellules. Ces tumeurs, dites ER positives (ER+), bénéficient de thérapies endocrines comme les antiœstrogènes (AE). Les AE sont des ligands compétitifs de ERα qui inhibent son activité transcriptionnelle. Le tamoxifène est l’antiœstrogène le plus utilisé en première ligne de traitement chez les patientes ayant un cancer du sein ER+. Malgré un bon pronostique initial, plus du tiers d’entre elles finiront par développer une résistance, parfois après de nombreuses années. L’absence de résistance croisée avec le tamoxifène place le fulvestrant comme seul dé-régulateur sélectif de ER (SERD) autorisé en clinique contre les tumeurs mammaires avancées résistantes. Malgré son profil antagoniste pur, le fulvestrant ne s’est pas révélé supérieur au tamoxifène en première ligne de traitement, cela étant attribué à sa faible biodisponibilité. D’autres SERD oralement disponibles sont en cours d’évaluation clinique. Des mutations du gène ESR1 (ERα) sont retrouvées dans environ 20% des tumeurs avancées résistantes à l’hormonothérapie et contribuent à la résistance au fulvestrant. Les mutations sont toutes retrouvées dans le domaine de liaison au ligand. La maladie progressera éventuellement avec le développement de métastases qui sont incurables. Il est donc crucial de (1) comprendre les mécanismes moléculaires médiant l’antiestrogénicité pure et l’impact des altérations génétiques impliquées dans la résistance aux AE pour (2) développer des thérapies ciblées plus efficaces qui pourraient lutter contre les tumeurs avancées résistantes. Les résultats prometteurs de plusieurs études in vitro et en clinique combinant un AE avec un inhibiteur d’histones désacétylases (HDACi) ont mené à la création de molécules hybrides combinant les deux fonctionnalités en une seule molécule. Nos travaux montrent que ces molécules hybrides dérivées du tamoxifène démontrent des propriétés inhibitrices améliorées par l’ajout d’un groupe fonctionnel inhibiteur des HDAC sur le squelette du tamoxifène. Ces composés sont antagonistes contre ERα et plusieurs HDAC et l’un d’eux possède une activité antiproliférative accrue par rapport aux composés parentaux dans les cellules de cancer du sein ER+ MCF-7. Notre étude fournit une preuve de concept que la combinaison d’une fonction pharmacologique HDACi sur le noyau d’un AE est prometteuse. Afin de mieux comprendre les déterminants moléculaires liés à l’induction de la SUMOylation de ERα et l’inhibition de son activité transcriptionnelle par le fulvestrant, nous avons testé l’impact de différentes mutations sur l’activité de plusieurs SERD, comprenant le fulvestrant. Nos résultats valident l’importance du résidu L536 dans la SUMOylation et la répression transcriptionnelle de ERα en réponse aux SERD. Les mutations ponctuelles L536P, Q et R, trouvées en clinique, compromettent la réponse au fulvestrant et à une sélection de SERD oraux in vitro. En résumé, nos résultats participent à une meilleure compréhension des caractéristiques moléculaires liées au mécanisme d’action du fulvestrant et de plusieurs SERD oraux de nouvelle génération. L’ensemble de nos résultats devraient aider au développement de nouvelles molécules plus efficaces contre les tumeurs résistantes, y compris des composés avec une double fonction inhibitrice AE-HDACi. / Two thirds of breast tumors are classified as positive for estrogen receptor alpha (ERα), a ligand-dependent transcription factor driving breast cancer cell proliferation. ER-positive (ER+) tumors benefit from endocrine therapies such as antiestrogens (AE). AE compete with ERα natural ligands and inhibit its transcriptional activity. Tamoxifen is the gold-standard for antiestrogenic therapy in patients with primary ER+ breast cancer. Despite a good initial prognosis, more than one-third will eventually develop resistance, sometimes after long periods of latency. Fulvestrant, known as a “pure” AE, is the only selective ER deregulator (SERD) approved in advanced breast cancer even after development of resistance to tamoxifen. Despite its pure antagonistic profile, fulvestrant has not proven superior to tamoxifen in first-line treatment, which is attributed to poor pharmacological properties. New generation SERDs with orally bioavailable properties are currently tested in the clinic. Mutations of ERα are found in about 20% of hormone-resistant advanced tumors and contribute to resistance to fulvestrant. The mutations are all located in the ligand binding domain. Resistant tumors will eventually progress and develop metastases which are deadly. It is therefore crucial to (1) understand the molecular determinants of pure antiestrogenicity and the impact of genetic alterations involved in AE resistance to (2) develop treatments with improved cytotoxic activities to achieve a more efficient suppression of advanced tumors. Promising results from several in vitro and clinical studies combining an AE with a histone deacetylase inhibitor (HDACi) have led to the design of hybrid molecules combining both functionalities into a single molecule. Our work shows that tamoxifen-derived hybrids display properties by the addition of an HDAC inhibitory functional group (HDACi) on the tamoxifen backbone. These compounds have inhibitory activities against ERα and several HDACs. One hybrid exhibits an improved cytotoxic activity against ER+ MCF-7 breast cancer cells compared to parental molecules. Our study provides proof of concept that combining HDACi function to the core of an AE is promising. To better understand the molecular determinants related to the induction of ERα SUMOylation and transcriptional repression by fulvestrant, we evaluated the impact of different mutations on the activity of several SERDs, including fulvestrant. Our results validate the importance of residue L536 in SUMOylation and transcriptional repression of ERα in response to SERDs. L536P, Q, and R point mutations are found in the clinic compromise the response to fulvestrant and to several oral SERDs in vitro. In summary, our results give better insights into the mechanism of action of fulvestrant and new generation oral SERDs and on the impact of naturally occurring mutations on transcriptional responses to these AE. Taken together, our results should help in the design of more efficient molecules, including compounds with dual AE-HDACi inhibitory function.