A evolução do conhecimento sobre o HIV e seus efeitos sobre as diferentes células do sistema imune possibilitaram a criação e o aperfeiçoamento de um grande arsenal terapêutico. Atualmente, a sobrevida de casos recém-­ diagnosticados é medida em décadas; entretanto, alguns pacientes não apresentam recuperação do sistema imune após a agressão inicial sofrida pelo vírus, a despeito de tratamento adequado. As células NK são identificadas como componentes da imunidade inata, responsáveis pelo combate a infecções virais e tumores. Elas são divididas em CD56dim e CD56hi, com diferentes capacidades citotóxicas e de produção de citocinas; uma terceira subpopulação composta por células CD56neg está presente em proporções mínimas em adultos saudáveis, porém tem maior importância em neonatos e está expandida em indivíduos cronicamente infectados pelo HIV, podendo ser identificada pelos marcadores CD7 e CD16. Dentre diversos outros, as células NK expressam receptores ativadores e inibitórios chamados KIR, que interagem com moléculas HLA, identificando células próprias e aquelas que reduzem sua expressão como mecanismo de escape imunológico; a interação entre KIR e HLA tem papel na evolução clínica da infecção por HIV/AIDS, particularmente envolvendo o receptor KIR3DL1. PD-­ 1 é um checkpoint do sistema imunológico que pode ter sua expressão aumentada em tumores e infecções virais crônicas. A expressão de PD-­1 em células T correlaciona-­se a marcadores prognósticos na infecção por HIV/AIDS; sua expressão em células NK já foi documentada, porém temos poucas informações a respeito. Este trabalho buscou detalhar a expressão de PD-­1 e seu ligante PD-­L1 em células NK e monócitos em participantes infectados pelo HIV e controles. Foram recrutados participantes diagnosticados e acompanhados desde a infecção aguda, participantes diagnosticados após um intervalo de tempo desconhecido desde a soroconversão e controles não infectados sob alto risco por exposição sexual. As amostras foram processadas a fresco no LIM-­60; PD-­1 e outros marcadores foram analisados por citometria de fluxo multicor. A expressão de PD-­1 em células NK correlacionou-­se a contagens de células T CD4+ e expressão de PD-­1 em células T nos participantes infectados; dentre estes, os participantes seguidos desde a infecção aguda tiveram menor expressão de PD-­1. Os participantes seguidos desde a infecção aguda tiveram ainda menor expressão de PD-­L1 em monócitos quando comparados aos participantes diagnosticados em fase desconhecida da doença, e também quando comparados aos controles não infectados. Houve aumento expressivo da proporção de células KIR3DL1+ entre as células CD56neg nos participantes infectados em comparação ao grupo não infectado. Concluímos que a expressão de PD-­1 em células NK está aumentada em pessoas infectadas pelo HIV e correlaciona-­se a outros parâmetros imunológicos, como contagem de células T CD4+ e expressão de PD-­1 em células T. A exaustão das células NK pode, portanto, contribuir para o dano imunológico causado pelo HIV e pode ser explorada como um alvo para novas modalidades terapêuticas / The expansion of our knowledge about the HIV and its effects on the entire immune system has led the development of a vast therapeutic arsenal. Survival for newly diagnosed cases is now measured in decades;? some patients, however, never recover full immune function following the initial aggression inflicted by HIV, despite adequate treatment. NK cells are identified as innate immunity components, responsible for fighting viral infections and tumors. They are separated in CD56dim and CD56hi cells, which present different cytotoxicity and cytokine production capacity. A third distinct subpopulation constituted by CD56neg cells can be found in minimal counts in healthy adults, but is present in newborns and is expanded in chronically HIV-­ infected subjects;? these cells can be identified as CD7+CD16+. Among others, NK cells express activating and inhibitory receptors called KIR, which interact with HLA molecules and identify \"self\" cells and cells that have downregulated its expression as an immunologic evasion strategy. Studies have documented the importance of KIR and HLA interaction in HIV/AIDS infection clinical course, particularly involving the receptor KIR3DL1. PD-­1 is an immune checkpoint that can be upregulated by tumors and chronic viral infections. PD-­ 1 expression on T cells is correlated to prognostic factors in HIV/AIDS infection; NK cells have been shown to express it, but further information is necessary. This study aimed at investigating PD-­1 and its ligand PD-­L1 expression on NK and monocytes in HIV-­infected participants and controls. We recruited a group of participants who were diagnosed during acute phase of HIV infection and have been followed ever since, a group of participants who were diagnosed after unknown interval since seroconversion, and a group of uninfected controls who have a high risk due to sexual exposure. Samples were freshly processed at LIM-­60; PD-­1 and other markers were analyzed by multicolor flow cytometry. We found PD-­1 expression on NK cells was correlated to T CD4+ cell counts and PD-­1 expression on T cells, in infected participants; among them, participants followed since acute infection expressed less PD-­1. They also expressed less PD-­L1 in monocytes, as compared to participants diagnosed after unknown interval since seroconversion, as well as compared to the uninfected group. We found significant increase in proportion of KIR3DL1-­expressing cells among CD56neg cells in infected participants compared to the uninfected group. We concluded that PD-­1 expression on NK cells is increased in people infected by HIV and correlated to other immunologic parameters such as T CD4+ counts and PD-­1 expression on T cells. NK cell exhaustion may, therefore, contribute to the immune damage induced by HIV-­1 infection and can be also explored as a target to find new ways to restore antiviral immunity

A evolução do conhecimento sobre o HIV e seus efeitos sobre as diferentes células do sistema imune possibilitaram a criação e o aperfeiçoamento de um grande arsenal terapêutico. Atualmente, a sobrevida de casos recém-­ diagnosticados é medida em décadas; entretanto, alguns pacientes não apresentam recuperação do sistema imune após a agressão inicial sofrida pelo vírus, a despeito de tratamento adequado. As células NK são identificadas como componentes da imunidade inata, responsáveis pelo combate a infecções virais e tumores. Elas são divididas em CD56dim e CD56hi, com diferentes capacidades citotóxicas e de produção de citocinas; uma terceira subpopulação composta por células CD56neg está presente em proporções mínimas em adultos saudáveis, porém tem maior importância em neonatos e está expandida em indivíduos cronicamente infectados pelo HIV, podendo ser identificada pelos marcadores CD7 e CD16. Dentre diversos outros, as células NK expressam receptores ativadores e inibitórios chamados KIR, que interagem com moléculas HLA, identificando células próprias e aquelas que reduzem sua expressão como mecanismo de escape imunológico; a interação entre KIR e HLA tem papel na evolução clínica da infecção por HIV/AIDS, particularmente envolvendo o receptor KIR3DL1. PD-­ 1 é um checkpoint do sistema imunológico que pode ter sua expressão aumentada em tumores e infecções virais crônicas. A expressão de PD-­1 em células T correlaciona-­se a marcadores prognósticos na infecção por HIV/AIDS; sua expressão em células NK já foi documentada, porém temos poucas informações a respeito. Este trabalho buscou detalhar a expressão de PD-­1 e seu ligante PD-­L1 em células NK e monócitos em participantes infectados pelo HIV e controles. Foram recrutados participantes diagnosticados e acompanhados desde a infecção aguda, participantes diagnosticados após um intervalo de tempo desconhecido desde a soroconversão e controles não infectados sob alto risco por exposição sexual. As amostras foram processadas a fresco no LIM-­60; PD-­1 e outros marcadores foram analisados por citometria de fluxo multicor. A expressão de PD-­1 em células NK correlacionou-­se a contagens de células T CD4+ e expressão de PD-­1 em células T nos participantes infectados; dentre estes, os participantes seguidos desde a infecção aguda tiveram menor expressão de PD-­1. Os participantes seguidos desde a infecção aguda tiveram ainda menor expressão de PD-­L1 em monócitos quando comparados aos participantes diagnosticados em fase desconhecida da doença, e também quando comparados aos controles não infectados. Houve aumento expressivo da proporção de células KIR3DL1+ entre as células CD56neg nos participantes infectados em comparação ao grupo não infectado. Concluímos que a expressão de PD-­1 em células NK está aumentada em pessoas infectadas pelo HIV e correlaciona-­se a outros parâmetros imunológicos, como contagem de células T CD4+ e expressão de PD-­1 em células T. A exaustão das células NK pode, portanto, contribuir para o dano imunológico causado pelo HIV e pode ser explorada como um alvo para novas modalidades terapêuticas / The expansion of our knowledge about the HIV and its effects on the entire immune system has led the development of a vast therapeutic arsenal. Survival for newly diagnosed cases is now measured in decades;? some patients, however, never recover full immune function following the initial aggression inflicted by HIV, despite adequate treatment. NK cells are identified as innate immunity components, responsible for fighting viral infections and tumors. They are separated in CD56dim and CD56hi cells, which present different cytotoxicity and cytokine production capacity. A third distinct subpopulation constituted by CD56neg cells can be found in minimal counts in healthy adults, but is present in newborns and is expanded in chronically HIV-­ infected subjects;? these cells can be identified as CD7+CD16+. Among others, NK cells express activating and inhibitory receptors called KIR, which interact with HLA molecules and identify \"self\" cells and cells that have downregulated its expression as an immunologic evasion strategy. Studies have documented the importance of KIR and HLA interaction in HIV/AIDS infection clinical course, particularly involving the receptor KIR3DL1. PD-­1 is an immune checkpoint that can be upregulated by tumors and chronic viral infections. PD-­ 1 expression on T cells is correlated to prognostic factors in HIV/AIDS infection; NK cells have been shown to express it, but further information is necessary. This study aimed at investigating PD-­1 and its ligand PD-­L1 expression on NK and monocytes in HIV-­infected participants and controls. We recruited a group of participants who were diagnosed during acute phase of HIV infection and have been followed ever since, a group of participants who were diagnosed after unknown interval since seroconversion, and a group of uninfected controls who have a high risk due to sexual exposure. Samples were freshly processed at LIM-­60; PD-­1 and other markers were analyzed by multicolor flow cytometry. We found PD-­1 expression on NK cells was correlated to T CD4+ cell counts and PD-­1 expression on T cells, in infected participants; among them, participants followed since acute infection expressed less PD-­1. They also expressed less PD-­L1 in monocytes, as compared to participants diagnosed after unknown interval since seroconversion, as well as compared to the uninfected group. We found significant increase in proportion of KIR3DL1-­expressing cells among CD56neg cells in infected participants compared to the uninfected group. We concluded that PD-­1 expression on NK cells is increased in people infected by HIV and correlated to other immunologic parameters such as T CD4+ counts and PD-­1 expression on T cells. NK cell exhaustion may, therefore, contribute to the immune damage induced by HIV-­1 infection and can be also explored as a target to find new ways to restore antiviral immunity

Variation in the sequence of T cell epitopes between dengue virus (DENV) serotypes is believed to alter memory T cell responses during second heterologous infections contributing to pathology following DENV infection. We identified a highly conserved, novel, HLA-B57-restricted epitope on the DENV NS1 protein, NS126-34. We predicted higher frequencies of NS126-34-specific CD8+ T cells in PBMC from individuals undergoing secondary, rather than primary, DENV infection due to the expansion of memory CD8+T cells. We generated a tetramer against this epitope (B57-NS126-34TET) and used it to assess the frequencies and phenotype of antigen-specific T cells in samples from a clinical cohort of children with acute DENV infection established in Bangkok, Thailand. High tetramer-positive T cell frequencies during acute infection were seen in only 1 of 9 subjects with secondary infection. B57-NS126-34-specific, other DENV epitope-specific CD8+ T cells, as well as total CD8+ T cells, expressed an activated phenotype (CD69+ and/or CD38+) during acute infection. In contrast, expression of CD71 was largely limited to DENV-specific CD8+ T cells. In vitro stimulation of CD8+ T cell lines, generated against three different DENV epitopes, indicated that CD71 expression was differentially sensitive to stimulation by homologous and heterologous variant peptides with substantial upregulation of CD71 detected to peptides which also elicited strong functional responses. CD71 may therefore represent a useful marker of antigenspecific T cell activation. During the course of our analysis we found substantial binding of B57-NS126-34 TET to CD8- cells. We demonstrated that the B57-NS126-34 TET bound KIR3DL1, an inhibitory receptor on natural killer (NK) cells. NK sensitive target cells presenting the NS126-34 peptide in the context of HLA-B57 were able to dampen functional responses of only KIR3DL1+ NK cells. Analysis of the activation of an NK enriched population in our Thai cohort revealed peak activation during the critical time phase in patients with severe dengue illness, dengue hemorrhagic fever, compared to people with mild illness. Our data identified CD71 as biologically useful marker to study DENV-specific CD8+ T cell responses and highlighted the role of viral peptides in modulating NK cell activation through KIR-MHC class I interactions during DENV infection.

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第23775号 / 医博第4821号 / 新制||医||1057(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 河本 宏, 教授 永井 純正, 教授 濵﨑 洋子 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM