Surfactant-Proteine (SP) sind von kritischer Bedeutung für die physiologische Atmung und besitzen vielfältige Verknüpfungen zur Genese pulmonaler Pathologien. Dagegen ist das Wissen über die Rolle von SP bei Erkrankungen des Gehirns begrenzt. Surfactant-Protein-G (SP-G) als zuletzt bekanntgewordener Vertreter der SP-Familie wird vermutlich als hirneigenes und rheologisch aktives Protein in räumlicher Nähe zur Blut-Hirn-Schranke (BHS) exprimiert. Im Rahmen verschiedener akuter und chronischer zerebraler Pathologien werden die Bedeutung von SP-G-Profilveränderungen und seine möglichen regulatorischen Aufgaben in der zerebralen Flüssigkeitshomöostase bereits vielfältig diskutiert. Naheliegend ist eine räumliche und pathophysiologische Beziehung von SP-G zu Komponenten der Neurovaskulären Einheit (NVU) und zum glymphatischen System (GS) auch bei der fokalen zerebralen Ischämie. Dabei ist die Entwicklung neuer therapeutischer Angriffspunkte und die Überwindung des „translational roadblock“ gerade bei dieser Erkrankung von entscheidender Bedeutung für eine zukünftig bessere klinische Versorgung von Schlaganfall-Patient:innen. Diese Studie stellt die erste räumliche und zeitliche Charakterisierung von SP-G zusammen mit vaskulären, glialen und neuronalen Komponenten der NVU nach fokaler zerebraler, Ischämie in verschiedenen Modellen in Maus, Ratte und Schaf dar. Im Zentrum der Untersuchungen standen immunfluoreszenzbasierte qualitative und quantitative Analysen ischämiebedingter Veränderungen von SP-G und dessen regionale Assoziationen zu Elementen der NVU an unterschiedlichen Zeitpunkten nach zerebraler Ischämie. Mit dem Ziel einer verbesserten Übertragbarkeit wurden mehrere Spezies und Modelle berücksichtigt: ein Filamentmodell in der Maus, ein thromboembolisches Modell in der Ratte und ein koagulationsbasiertes Großtiermodell im Schaf. Um mögliche zeitabhängige Prozesse zu berücksichtigen, wurden mehrere postischämische Beobachtungspunkte gewählt mit einer Spannbreite von 4 h bis 72 h für die Nagermodelle und 14 d für das Schafmodell. Qualitative Dreifach-Fluoreszenzfärbungen kortikaler und subkortikaler Hirnregionen zeigten SP-G als sensitiven Marker der Ischämie mit einem Verlust der Signalintensität sowie charakteristischen morphologischen Signalveränderungen über alle Zeitpunkte, Tiermodelle und Hirnregionen hinweg – in enger Assoziation zu ischämisch veränderten NVU-Elementen und Gefäßen. Bildgestützte quantitative statistische Analysen der inter-hemisphäriellen, im Zusammenhang mit der Ischämie stehenden, Veränderungen der Fluoreszenzsignale von SP-G und dem ischämiesensitiven Basalmembranbestandteil Kollagen IV zu verschiedenen Zeitpunkten untersuchten die zeitliche Dynamik der qualitativen Signalveränderungen von SP-G eingehender. Im Mausmodell zeigte sich eine statistisch signifikante, verminderte SP-G-Immunreaktivität (Ir) in von der Ischämie betroffenen neo- und subkortikalen Hirnregionen, mit einem maximalen Verlust der Signalintensität im Infarktkern 4 h und 24 h nach fokaler zerebraler Ischämie. Beginnend in der ischämischen Grenzzone zeigte sich entlang des Neokortex ein gradueller Verlust der SP-G-Ir, bereits 4 h nach Insult mit zunehmender Effektstärke bei länger andauernder Ischämie von 24 h. SP-G-Ir zeigte zwar keine direkte Überlappung mit dem Gefäßsystem, jedoch eine signifikante negative Korrelation zur invers erhöhten Kollagen IV-Ir in der Ischämie, die analog zu SP-G mit einem Maximum der Signalveränderungen im ischämischen Kerngebiet und gradueller Zunahme der Immunsignale über den Neokortex reagierte. Besonders für die ischämische Grenzzone präsentierte sich SP-G als frühzeitiger sensitiver Marker mit einem signifikanten Verlust der Immunmarkierung noch vor der Demarkierung des Infarkts durch erhöhte Kollagen IV-Ir ischämisch geschädigter Gefäße. Auch für subkortikale Regionen bestätigte sich die statistisch signifikante, negative Korrelation beider Marker in vergleichbarem Ausmaß. SP-G zeigte im nicht von der Ischämie betroffenen Gewebe eine ausgeprägte peri-nukleäre neuronale Zellassoziation und homogene Expression im Neuropil der untersuchten Vorderhirne von Mäusen und Ratten. Im Zusammenhang mit dem ischämischen Insult resultierten zuverlässig Signalveränderungen von SP-G-Ir entlang der subkortikalen ischämischen Grenzzone. Auch war ein Verlust der parenchymatösen Neuropil-Färbung sowie der auffälligen peri-nukleären SP-G-Markierung in allen analysierten ischämischen Hirnregionen erkennbar. Ischämiebedingte Veränderungen der SP-G-Ir gingen einher mit einer Störung der Permeabilitätsbarriere der BHS, bei der SP-G in enger räumlicher Beziehung zu extravasalem Serumalbumin detektiert wurde. Weitere Assoziation zu Komponenten der NVU zeigten sich im ischämiebedingten Signalverlust von SP-G bei gleichzeitigem Anstieg der CNP-Ir von Oligodendrozyten ebenso wie mit gemeinsamen ischämisch-morphologischen Veränderungen von Mikro- und Astroglia (visualisiert durch Iba- bzw. GFAP-Ir). Veränderungen von Aquaporin 4- und SP-G-Ir markierten in gleicher Weise die ischämische Grenzzone, von der aus sich ein Verlust der Fluoreszenzsignale beider Marker in der von maximaler Ischämie betroffenen Zone anschloss. Die ermittelten ischämisch-morphologischen Signalveränderungen der NVU-Marker stimmten mit Beobachtungen früherer Untersuchungen überein. Trotz der engen räumlichen Assoziationen konnte eine sichere Ko-Expression von SP-G mit glialen oder Gefäß-Markern jedoch in keinem Tiermodell gezeigt werden – ein Aspekt, der durch Laserscanning-Mikroskopie verifiziert wurde. Die charakteristischen SP-G-Signalalterationen und ischämiebedingten Veränderungen der NVU im Filamentmodell der Maus bestätigten sich im thromboembolischen Modell der Ratte weitgehend. Untersuchungen im Großtiermodell des Schafs zeigten den Verlust der SP-G-Ir im Infarkt auch 14 d nach koagulationsbedingter Ischämieinduktion und verifizierten SP-G als Marker der Ischämie über einen langen post-ischämischen Zeitraum. Kombinierte Immunmarkierungen von SP-G und Fibronektin zeigten eine regionale Assoziation ischämischer Veränderungen beider Marker und deuteten auf mögliche Verbindungen von SP-G zum extrazellulären Raum auch über klassische NVU-Komponenten hinaus. Die mutmaßlichen rheologischen Eigenschaften von SP-G, seine in früheren Untersuchungen gezeigte Präsenz in perivaskulären bzw. glymphatischen Räumen und bekannte Verknüpfungen zu pathologischen Veränderungen des Liquorsystems suggerierten im Vorfeld mögliche Verknüpfungen von SP-G und flüssigkeitsregulatorischen Systemen im Gehirn. Die beobachteten ischämischen Veränderungen von SP-G sowie seine Assoziation mit vaskulären und glialen Komponenten der NVU weisen auf eine mögliche Beteiligung von SP-G an regulatorischen Aufgaben in der NVU hin, speziell im Kontext mit vaskulärer Integrität, Schutz des Endothels sowie Erhalt der Barrierefunktion der BHS. Eine Beteiligung von SP-G an der Flüssigkeitshomöostase und der Regulation von Fließeigenschaften scheint auch im ischämischen Parenchym denkbar – mit Implikationen im Hinblick auf das klinisch besonders relevante post-ischämische zerebrale Ödem. Die Assoziation von SP-G mit AQP4, sowie Hinweise auf eine Beteiligung in der Beseitigung von Abfallprodukten und der Regulation von Entzündungsreaktionen weisen auf SP-G als möglichen neuen Angriffspunkt in der Schlaganfalltherapie hin. Allerdings ist die Ableitung funktioneller SP-G-Aspekte aus den größtenteils morphologischen Ergebnissen dieser Studie begrenzt und birgt die Gefahr der Überinterpretation von Daten. Weitere Limitationen sind die vorhandene Datenquantifizierung in nur einem Tiermodell sowie die auf die Immunfluoreszenz-mikroskopie beschränkte Methodik. Zusätzliche Untersuchungen weiterer ischämierelevanter Marker, die Erweiterung von Tier- und Ischämiemodellen, die Untersuchung auch deutlich längerer oder transienter Ischämiezeiten sowie die Analyse humaner Proben werden nötig sein, um die Rolle von SP-G in der zerebralen Ischämie genauer einordnen zu können. Insgesamt bietet die vorliegende Studie eine erste regionale und zeitliche Charakterisierung von SP-G nach experimenteller fokaler zerebraler Ischämie mit Hinweisen auf mögliche regulatorische Funktionen von SP-G im Rahmen der ischämisch veränderten NVU sowie der Flüssigkeitsregulation des Gehirns. Die Ergebnisse geben somit Anlass, SP-G im Kontext des ischämischen Schlaganfalls künftig noch eingehender zu untersuchen.:1 Abkürzungsverzeichnis 1 2 Einführung 3 2.1 Surfactant und Surfactant-Proteine 3 2.2 Surfactant-Proteine im Zentralen Nervensystem 5 2.3 Surfactant-Protein-G (SP-G) 6 2.4 Ischämischer Schlaganfall 8 2.5 Neurovaskuläre Einheit und Blut-Hirn-Schranke 12 2.6 Glymphatisches System und zerebrales Ödem 15 3 Zielsetzung 17 4 Material und Methoden 18 4.1 Material 18 4.1.1 Primärantikörper 18 4.1.2 Versuchstiere 19 4.2 Methoden 19 4.2.1 Ischämieinduktion und Tiermodelle 19 4.2.2 Gewebeaufarbeitung 21 4.2.3 Fluoreszenzmehrfachfärbungen 22 4.2.4 Histologische Kontrollen 24 4.2.5 Fluoreszenzmikroskopie 25 4.2.6 Bildgestützte Analyse und semiquantitative Auswertung 25 5 Ergebnisse 30 5.1 SP-G und Elemente des Gefäßsystems nach Ischämie in der Maus 30 5.1.1 Semiquantitative Analysen ischämischer Veränderungen von SP-G und Kollagen IV 37 5.2 SP-G und Komponenten der Neurovaskulären Einheit (NVU) nach Ischämie in der Maus 41 5.3 SP-G, Elemente des Gefäßsystems und der NVU nach Ischämie in der Ratte 46 5.4 SP-G und Elemente der NVU nach Ischämie im Schaf 51 6 Diskussion 53 6.1 SP-G und das Gefäßsystem in der Ischämie 53 6.2 Störungen der Blut-Hirn-Schranke und zerebrales Ödem 55 6.3 Aquaporin 4 und glymphatisches System 56 6.4 SP-G im Kontext von NVU und extrazellulärer Matrix 58 6.5 SP-G in verschiedenen Ischämiemodellen 60 6.6 Methodenbedingte Limitationen 61 7 Zusammenfassung 63 8 Literaturverzeichnis 67 9 Selbstständigkeitserklärung 79 10 Verzeichnis der wissenschaftlichen Veröffentlichungen 80 11 Danksagung 81

Kollagen IV assoziierte Nephropathien sind hereditäre Erkrankungen, die die glomeruläre Basalmembran betreffen. Homozygote Aberrationen des COL4A3- oder des COL4A4-Gens zeigen wie X-chromosomal dominant vererbte Mutationen des COL4A5-Gens das klinische Bild des Alport-Syndroms mit frühzeitigem terminalem Nierenversagen. Heterozygote COL4A3-Mutationen sind ursächlich für die benigne familiäre Hämaturie. Ein zusätzlicher Polymorphismus in Nphs2, welches das Schlitzmembranprotein Podocin kodiert, könnte hierbei zu einem aggravierten Krankheitsverlauf führen. Um diese These zu überprüfen, ist eine Analyse des glomerulären Filters, bestehend aus glomerulärer Basalmembran, der zwischen den Podozytenfüßen liegenden Schlitzmembran und Kapillarendothel notwendig. Nidogen-2 ist als Verbindungsprotein essenzieller Bestandteil der glomerulären Basalmembran. Die Ergebnisse der Untersuchungen des Proteins in der Basalmembran COL4A3 heterozygoter Mäuse mit zusätzlichem Podocin-Polymorphismus wichen stark von denen bei einfach COL4A3 heterozygoten Tieren ab. Es ergeben sich daher anhand von Nidogen-2 Hinweise, dass eine Mutation in Nphs2 den Krankheitsverlauf Kollagen IV assoziierter Erkrankungen modifizieren könnte.

RAGE (receptor for advanved glycation endproducts) was identified on endothelial cells as binding partner for AGE-modified molecules. The term "Advanced glycation endproducts" involves a number of structurally diverse molecules, which derive from multiple complex rearrangements of reducing sugars with free amino-groups of proteins. They evolve during food production and also in vivo during ageing and to an accelerated degree in diabetes, where AGEs cause receptor-mediated cellular perturbations. Due to the pathological relevance the aim of this thesis was to generate a "biosensor" for AGEs. To this end, the membrane-expressed receptor (flRAGE) as well as soluble RAGE (sRAGE) were expressed in mammalian cells and investigated in numerous binding studies. These did not reveal a specific interaction of AGE-modified ligands with RAGE. In addition, the expression of RAGE on endothelial cells, as described in the literature, could not be followed neither with the help of newly generated monoclonal anti-RAGE antibodies, nor in quantitative "real time" RT-PCR analysis. These results cast doubts on the meaning of RAGE as a proinflammatory receptor in AGE-mediated pathologies and on the adequacy of RAGE for the "biosensor". At the same time the question concerning a physiological role of the receptor arose. RAGE-expression was analysed in different healthy human tissues by "real time" RT-PCR, which revealed an almost selective expression in lung tissue. An important indication for a possible physiological function of RAGE in lung provided the selective localization of RAGE on alveolar epithelial type I cells as demonstrated in frozen lung sections as well as in in vitro cultivated lung cells. RAGE could be identified as a novel, highly specific marker for the thin, expanded AT I cell, which form part of the air-blood-barrier. In the following, RAGE was found to be an interaction partner for collagen IV, a major component of the alveolar basal lamina. Membrane-expressed RAGE did not only strengthened adherence of cells but also induced cell spreading on collagen IV-coated surfaces. This preferential interaction of RAGE with collagen IV could substantially contribute to the functional morphology of AT I cells in vivo, thereby ensuring an effective bidirectional gas-exchange. The results of this thesis expose a novel, so far unnoticed aspect of the biology of RAGE, which presumably contributes to the phenotypic characteristic und function of normal human lung tissue. / RAGE (receptor for advanced glycation endproducts) wurde als Interaktionspartner auf Endothelzellen für AGE-modifizierte Moleküle identifiziert. Unter den "Advanced glycation endproducts" werden eine Vielzahl strukturell unterschiedlicher Moleküle zusammengefasst, die durch mehrstufige komplexe Umlagerungen zwischen reduzierenden Zuckern und freien Aminogruppen von Proteinen entstehen. Sie entstehen sowohl bei der Herstellung von Lebensmitteln, als auch in vivo während des Alterns und in erhöhtem Maß bei Diabetes, wobei sie Rezeptor-vermittelt Zellstörungen hervorrufen. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst aufgrund der pathologischen Relevanz eine Strategie zur Konzeption eines "Biosensors" für AGEs verfolgt. Hierfür wurde sowohl der membranständige Rezeptor (flRAGE) als auch löslicher RAGE (sRAGE) in Säugerzellen exprimiert und in zahlreichen Bindungs- und Funktionsanalysen getestet. Hierbei konnte keine spezifische Interaktion der AGE-modifizierten Moleküle mit RAGE nachgewiesen werden. Auch die in der Literatur beschriebene Expression von RAGE auf Endothelzellen konnte mit Hilfe neu generierter monoklonaler Antikörper, sowie in quantitativen "real time" RT-PCR-Analysen nicht nachvollzogen werden. Diese Ergebnisse warfen Zweifel an der grundlegenden Bedeutung von RAGE als proinflammatorischer Rezeptor in AGE-bedingten Krankheiten auf und stellten damit auch dessen Eignung für einen AGE-Biosensor in Frage. Gleichzeitig warf diese Skepsis die Frage nach einer möglichen physiologischen Funktion dieses Rezeptors auf. Eine vergleichende Analyse der RAGE-Expression in verschiedenen gesunden Geweben mittels "real time" RT-PCR ergab eine nahezu selektive Expression in Lungengewebe. Wichtige Anhaltspunkte für die Funktion von RAGE in der Lunge ergaben sich aus der selektiven Lokalisation des Rezeptors auf Alveolarepithelzellen Typ I (AT I) sowohl in Gefrierschnitten der Lunge als auch nach in vitro-Kultur von Lungenzellen. RAGE konnte als neuer, hoch spezifischer Marker für die lang gestreckten AT 1 Zellen, die einen Teil der Blut-Luft-Schranke bilden, definiert werden. In folgenden Funktionsanalysen konnte RAGE als spezifischer Interaktionspartner für Kollagen IV, einer Hauptkomponente der Alveolar-Basalmembran, identifiziert werden. Membranständiger RAGE verstärkte nicht nur die Adhärenz von Zellen an Kollagen IV-beschichtete Oberflächen, er induzierte auch Zell-"Spreading". Dies gab Anlass für die Vermutung, dass die beobachtete präferentielle Interaktion von RAGE mit Kollagen IV maßgeblich zu der funktionellen Morphologie der AT I Zellen in vivo beitragen könnte, die die Voraussetzung für einen effektiven bidirektionalen Gasaustausch darstellt. Durch die Ergebnisse dieser Arbeit wurde ein neuer, bisher unbeachteter Aspekt der Biologie des RAGE aufgedeckt, der vermutlich entscheidend zur phänotypischen Ausprägung und Funktion des normalen humanen Lungengewebes beiträgt.

RAGE (receptor for advanved glycation endproducts) was identified on endothelial cells as binding partner for AGE-modified molecules. The term "Advanced glycation endproducts" involves a number of structurally diverse molecules, which derive from multiple complex rearrangements of reducing sugars with free amino-groups of proteins. They evolve during food production and also in vivo during ageing and to an accelerated degree in diabetes, where AGEs cause receptor-mediated cellular perturbations. Due to the pathological relevance the aim of this thesis was to generate a "biosensor" for AGEs. To this end, the membrane-expressed receptor (flRAGE) as well as soluble RAGE (sRAGE) were expressed in mammalian cells and investigated in numerous binding studies. These did not reveal a specific interaction of AGE-modified ligands with RAGE. In addition, the expression of RAGE on endothelial cells, as described in the literature, could not be followed neither with the help of newly generated monoclonal anti-RAGE antibodies, nor in quantitative "real time" RT-PCR analysis. These results cast doubts on the meaning of RAGE as a proinflammatory receptor in AGE-mediated pathologies and on the adequacy of RAGE for the "biosensor". At the same time the question concerning a physiological role of the receptor arose. RAGE-expression was analysed in different healthy human tissues by "real time" RT-PCR, which revealed an almost selective expression in lung tissue. An important indication for a possible physiological function of RAGE in lung provided the selective localization of RAGE on alveolar epithelial type I cells as demonstrated in frozen lung sections as well as in in vitro cultivated lung cells. RAGE could be identified as a novel, highly specific marker for the thin, expanded AT I cell, which form part of the air-blood-barrier. In the following, RAGE was found to be an interaction partner for collagen IV, a major component of the alveolar basal lamina. Membrane-expressed RAGE did not only strengthened adherence of cells but also induced cell spreading on collagen IV-coated surfaces. This preferential interaction of RAGE with collagen IV could substantially contribute to the functional morphology of AT I cells in vivo, thereby ensuring an effective bidirectional gas-exchange. The results of this thesis expose a novel, so far unnoticed aspect of the biology of RAGE, which presumably contributes to the phenotypic characteristic und function of normal human lung tissue. / RAGE (receptor for advanced glycation endproducts) wurde als Interaktionspartner auf Endothelzellen für AGE-modifizierte Moleküle identifiziert. Unter den "Advanced glycation endproducts" werden eine Vielzahl strukturell unterschiedlicher Moleküle zusammengefasst, die durch mehrstufige komplexe Umlagerungen zwischen reduzierenden Zuckern und freien Aminogruppen von Proteinen entstehen. Sie entstehen sowohl bei der Herstellung von Lebensmitteln, als auch in vivo während des Alterns und in erhöhtem Maß bei Diabetes, wobei sie Rezeptor-vermittelt Zellstörungen hervorrufen. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst aufgrund der pathologischen Relevanz eine Strategie zur Konzeption eines "Biosensors" für AGEs verfolgt. Hierfür wurde sowohl der membranständige Rezeptor (flRAGE) als auch löslicher RAGE (sRAGE) in Säugerzellen exprimiert und in zahlreichen Bindungs- und Funktionsanalysen getestet. Hierbei konnte keine spezifische Interaktion der AGE-modifizierten Moleküle mit RAGE nachgewiesen werden. Auch die in der Literatur beschriebene Expression von RAGE auf Endothelzellen konnte mit Hilfe neu generierter monoklonaler Antikörper, sowie in quantitativen "real time" RT-PCR-Analysen nicht nachvollzogen werden. Diese Ergebnisse warfen Zweifel an der grundlegenden Bedeutung von RAGE als proinflammatorischer Rezeptor in AGE-bedingten Krankheiten auf und stellten damit auch dessen Eignung für einen AGE-Biosensor in Frage. Gleichzeitig warf diese Skepsis die Frage nach einer möglichen physiologischen Funktion dieses Rezeptors auf. Eine vergleichende Analyse der RAGE-Expression in verschiedenen gesunden Geweben mittels "real time" RT-PCR ergab eine nahezu selektive Expression in Lungengewebe. Wichtige Anhaltspunkte für die Funktion von RAGE in der Lunge ergaben sich aus der selektiven Lokalisation des Rezeptors auf Alveolarepithelzellen Typ I (AT I) sowohl in Gefrierschnitten der Lunge als auch nach in vitro-Kultur von Lungenzellen. RAGE konnte als neuer, hoch spezifischer Marker für die lang gestreckten AT 1 Zellen, die einen Teil der Blut-Luft-Schranke bilden, definiert werden. In folgenden Funktionsanalysen konnte RAGE als spezifischer Interaktionspartner für Kollagen IV, einer Hauptkomponente der Alveolar-Basalmembran, identifiziert werden. Membranständiger RAGE verstärkte nicht nur die Adhärenz von Zellen an Kollagen IV-beschichtete Oberflächen, er induzierte auch Zell-"Spreading". Dies gab Anlass für die Vermutung, dass die beobachtete präferentielle Interaktion von RAGE mit Kollagen IV maßgeblich zu der funktionellen Morphologie der AT I Zellen in vivo beitragen könnte, die die Voraussetzung für einen effektiven bidirektionalen Gasaustausch darstellt. Durch die Ergebnisse dieser Arbeit wurde ein neuer, bisher unbeachteter Aspekt der Biologie des RAGE aufgedeckt, der vermutlich entscheidend zur phänotypischen Ausprägung und Funktion des normalen humanen Lungengewebes beiträgt.