Orientador: Irene G. H. Lorand-Metze / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-19T08:20:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gilberti_MariadeFatimaPereira_M.pdf: 1633919 bytes, checksum: 29522a830b3d305b63b3953784282de8 (MD5) Previous issue date: 1994 / Resumo: As regiões organizadoras de nucléolo - NORs - são alças de DNA responsáveis pela síntese de RNA ribossomal (RNAr) durante a interfase. Caracterizam-se pela presença de proteínas não histonas ligadas ao RNAr que se coram pela prata proteínas AgNORs - com grande especificidade permitindo, desse modo, a localização e consequente observação das NORs durante o ciclo celular com relação a sua atividade e comportamento. À microscopia ótica podem ser visualizadas como pontos isolados ou agrupados em uma matriz proteica sendo então denominados "clusters". As AgNORs estão relacionadas à taxa de duplicação celular e vários estudos têm demonstrado que sua análise quantitativa é útil na distinção de neoplasias benigna.s e malignas bem como no prognóstico e estadiamento das últimas. Com o objetivo de estudarmos melhor a citocinética celular em L.M.C. analisamos as AgNOR em células da linhagem granulocítica de 43 sangues periféricos e 15 medulas ósseas de pacientes com LMC fase crônica, 16 sangues periféricos de pacientes com LMC em crise blástica e 20 medulas ósseas de pacientes controles. Observamos que os padrões de "clusters" e pontos em LMC foram semelhantes entre sangue periférico e medula óssea de um mesmo caso, permitindo a comparação entre vários grupos. Observamos também que existe um padrão característico de "clusters" e pontos para cada tipo celular da granulopoiese. O número de "clusters" de mieloblastos do grupo controle mostrou-se significativamente maior do que nos casos de LMC analisados ao diagnóstico. O número de pontos mostrou-se semelhante em mieloblastos, porém significativamente menor em promielócitos e mielócitos dos pacientes com LMC fase crônica ao diagnóstico, quando comparados com o grupo controle. (Tabela 11). No grupo com LMC fase crônica os casos analisados ao diagnóstico mostraram número significativamente maior de clusters em mieloblastos quando comparados com os em recaída já tratados e em crise blástica. Os dados obtidos sugerem ser a evolução da doença a responsável pela diminuição do número de clusters. Porém estes dois últimos grupos não diferiram entre si com relação ao número de clusters. O número de pontos mostrou-se semelhante nos mieloblastos dos três grupos estudados. / Abstract: The nucleolar organizer regions (NORs) are loops of DNA, that are responsible for the syntesis of the ribossomal RNA. A special silver-staining technique identifies the acidic non-histones proteins (AgNORs) associated with the sites of r RNA transcription, such as RNA polymerase I, C23 and 823 proteins. This method has been widely used for the observation of the NORs during the cell cycle in different normal and pathologic lesions. The AgNORs show different patterns in interphase nuclei: 1 - solitary rounded argyrophilic structures corresponding to a small nucleolus in resting cells, 2 - clusters of NORs within a matrix, corresponding to nucleoli, 3 - small dots (true AgNORs) scattered throughout the nucleoplasm. The pattern of AgNORs is related to the duplication rate and to maturation stage of cells. Several studies have demonstred that its analysis is usefull in distinguishing benign from malignant lesions and for the grading of tumors. We have analysed the pattern of AgNORs of granulopoietic cells in chronic myeloid leukemia (CML) and compared it to the normal granulopoiesis. The peripheral blood cells of 24 cases of CML in chronic phase at diagnosis, 19 cases with relapse of chronic phase and 16 cases in blast crisis were studied. On the other hand, the granulopoiesis in bone marrow of 15 cases of CML at diagnosis was compared to 20 cases of normal bone marrow. The pattern of AgNORs was similar in the peripheral blood and bone marrow in all granulopoietic precursors of the same maturation stage, in CML at diagnoses. As in the normal bone marrow, the granulopoietic precursors of CML in chronic phase, revealed a characteristic pattern of clusters and dots for the cells in each maturation stage. Compared to normal granulopoiesis only the myeloblasts of CML in chronic phase at diagnosis had significantly less clusters. The dots however showed a similar number in blasts, matamyelocytes, band forms and segmented neutrophils. They were less numerous in promyelocytes and myelocytes. The blasts of CML at diagnoses showed significantly more clusters than those at relapse afier treatment of chronic phase. These, however, had a similar pattern of AgNORs than that seen in blast crisis. The number of clusters wich are only present in proliferative cells is inversely related to cell cycle duration. The number of dots increases with cell maturation in proliferating cells and decreases again after the stop of proliferative activity. In view of these data the analysis of the pattern of AgNORs in CML discloses the discordant maturation described in this disease. On the other hand the number of clusters of blast crisis in CML is lower than in normal myeloblasts and keeps decreasing continuously during the course of the disease. This pattern is similar to that describedin acute myeloid leukemia. / Mestrado / Mestre em Ciências Médicas

Submitted by ROBERTO PAULO CORREIA DE ARAÚJO (ppgorgsistem@ufba.br) on 2016-08-30T16:56:46Z No. of bitstreams: 1 Máilla Rebouças Viana dissertação pdf.pdf: 1628670 bytes, checksum: 0f14f7eed7546953dae78ed1447bf742 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-30T16:56:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Máilla Rebouças Viana dissertação pdf.pdf: 1628670 bytes, checksum: 0f14f7eed7546953dae78ed1447bf742 (MD5) / INTRODUÇÃO: A Leucemia Mielóide Crônica (LMC) é uma doença mieloproliferativa crônica caracterizada pela presença do cromossomo Philadelphia (Ph). Este cromossomo, observado por técnicas citogenéticas convencionais, é resultante da translocação t(9;22)(q34;q11) que justapõe o rearranjo BCR-ABL, observado por técnicas moleculares. A detecção desse cromossomo ou do rearranjo é fundamental, pois não somente contribui para o diagnóstico, mas também interfere no acompanhamento e no sucesso da terapia utilizada. O rearranjo BCR-ABL possui atividade tirosina quinase elevada, o que levou ao desenvolvimento de novos fármacos inibidores desta ação, conhecidos como inibidores de tirosino quinase (TKI). OBJETIVO: O objetivo deste estudo foi demonstrar a importância da utilização da técnica de citogenética molecular (Fluorescent in situ Hybridization - FISH) aliada a citogenética clássica no monitoramento de pacientes com LMC em terapia com TKI, no Estado da Bahia. METODOLOGIA: Foram analisadas amostras de medula óssea de 20 pacientes com LMC, em tratamento com TKI, encaminhados ao Serviço de Genética Médica do Hospital Universitário Prof. Edgard Santos, utilizando as técnicas de citogenética clássica e FISH. RESULTADOS: Resultados obtidos demonstraram que o cromossomo Ph foi observado em 15%, com a citogenética clássica, e o rearranjo BCR-ABL em 90%, com a citogenética molecular. Outro ponto importante foi que em alguns casos o resultado só foi possível com a técnica molecular, pois a técnica convencional não foi suficiente pela impossibilidade na análise das metáfases, devido a fatores como falta de crescimento celular. CONCLUSÃO: A técnica de FISH demonstrou maior sensibilidade nos casos que a citogenética clássica não detectou o cromossomo Ph, entretanto as duas técnicas foram fundamentais para os resultados obtidos por apresentarem vantagens e desvantagens em relação à outra e, portanto, devem ser usadas de maneira complementar no monitoramento de pacientes com LMC em tratamento com TKI.

Orientadores: Carmino Antonio de Souza, Katia Borgia Barbosa Pagnano / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-14T20:51:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mascarenhas_CintiadoCouto_M.pdf: 7297123 bytes, checksum: a5c6ff86609313924a25638b32816a31 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O desenvolvimento da Leucemia Mielóide Crônica (LMC) tem como característica a formação do cromossomo Philadelphia que envolve a quebra do gene BCR gerando um rearranjo molecular denominado BCR-ABL, cujo produto final é uma proteína de fusão citoplasmática que determina a patogenia da doença. Esta proteína é uma tirosina quinase (TK) que possui capacidade de auto-ativação e para a inativação desta proteína, foram desenvolvidos os inibidores da tirosina quinase (ITK), que tem a capacidade de se ligar no mesmo sítio de ligação da molécula de ATP. Esta ligação impede a transferência dos grupos fosfatos aos substratos subseqüentes, bloqueando a cascata de transdução de sinais e prevenindo a ativação das vias mitogênica dependente da quinase Bcr-Abl e anti-apoptóticas levando à morte do fenótipo BCR-ABL.Um dos principais mecanismos de resistência ao tratamento com ITK são as mutações pontuais, sendo a T315I foco de estudos mais detalhados por tornar a proteína mutante altamente insensível a todas as drogas inibidoras da proteína TK disponíveis atualmente Foi utilizado neste trabalho a técnica de D-HPLC para fazer screening de mutações nos pacientes com LMC com resposta sub ótima ou falha de tratamento de acordo com os critérios da Leukemia Net. Para o screening do éxon 6 foram selecionados 93 pacientes com LMC: 5 eram intolerantes, 67 resistentes e 21 com resposta subótima. Como controle negativo foi usado o sangue periférico doadores de sangue do Hemocentro da UNICAMP. Para o screening de mutações de todo o gene BCR-ABL foram estudados 37 pacientes com LMC e como controle negativo, usamos a linhagem celular HL60 que não possui a translocação BCR-ABL. No screening do éxon 6, 23 amostras (25%) mostraram um perfil de eluição no D-HPLC anormal em relação ao controle, o que sugeriu a presença de mutação. A sobrevida global (OS) para todo grupo foi de 80% em uma mediana de tempo de observação de 30 meses. OS para pacientes sem mutações foi de 87% e para os pacientes com mutações foi de 56% em uma mediana de tempo de observação 37 e 10 meses, respectivamente (p <0,0001, RR = 68). No screening de todo o gene BCR-ABL 17 (46%) tiveram perfil cromatográfico diferente do controle Como estávamos estabelecendo a padronização do método, procedemos com o seqüenciamento de todas as amostras e os resultados obtidos foram comparados com a seqüência depositada no banco de dados GenBank (U07563). Das 17 amostras com alteração do perfil cromatográfico, observamos a presença de mutação em 13 amostras. Acreditamos que isso se deva a sensibilidade do método de D-HPLC que é capaz de identificar tanto polimorfismos quanto mutações com maior eficiência que o seqüenciamento. Em resumo, o D-HPLC demonstrou ser um método sensível e prático para o acompanhamento do aparecimento de mutações no domínio da quinase na rotina clínica. Mutações nessa região estudada são clinicamente relevantes e podem conferir um pior prognóstico. A detecção precoce pode ser uma ferramenta importante para otimizar a terapêutica na LMC. / Abstract: The development of chronic myeloid leukemia (CML) is the formation of the characteristic Philadelphia chromosome involving breach of the BCR gene generating a molecular rearrangement called BCR-ABL, whose final product is a cytoplasmic fusion protein that determines the pathogenesis of the disease. This is a protein tyrosine kinase (TK) that has self-ativaçãoe to inactivate this protein have developed the inhibitors of tyrosine kinase (ITK), which has ability to connect on the same site of binding of molecule of ATP. This connection prevents the transfer of phosphate groups to substrates subsequent, blocking the cascade of signal transduction and preventing the activation of mitogenic pathways dependent kinase BCR-ABL and anti leading to apoptotic death phenotype of BCR-ABL.One major mechanisms of resistance to treatment with ITK are mutations off, and the T315I focus of more detailed studies by making mutant protein highly insensitive to all drugs Inhibit TK protein currently available was used in this work to D-HPLC technique to screening for mutations in patients with CML with sub-optimal response or failure of treatment according to the criteria Leukemia Net For the screening of exon 6 were selected 93 CML patients: 5 were intolerant, 67 resistant and 21 with answer sub-optimal. The negative control we used the peripheral blood donors Blood from the blood of UNICAMP. For the screening of mutations throughout the BCR-ABL gene were studied 37 patients with CML and control negative, we used the HL60 cell line that does not have the translocation BCR-ABL. In the screening of exon 6, 23 samples (25%) showed a profile of the D-HPLC elution abnormal in the control, which suggested the presence of mutation. The overall survival (OS) for whole group was 80% in a median time of observation of 30 months. OS for patients with mutations was 87% and for patients with mutations was 56% in the median observation time of 37 and 10 months respectively (p <0.0001, RR = 68). In screening the entire gene BCR-ABL 17 (46%) had chromatographic profile different from the control we were setting the standardization of methods, procedures with the sequencing of all samples and the results were compared with the sequence deposited in the GenBank database (U07563). Of the 17 samples with change the chromatographic profile, we observed the presence of mutation in 13 samples. We believe that this is due to sensitivity of the method of D-HPLC is able to identify the mutations both polymorphisms with greater efficiency to the sequencing. In summary, the D-HPLC has proved a sensitive and practical method for monitoring the appearance of mutations in the kinase domain in the clinical routine. Mutations studied in this region are clinically relevant and may confer worse prognosis. Early detection can be a tool important to optimize therapy in CML. / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica

Orientadores: Carmino Antonio de Souza, Fernando Ferreira Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T11:16:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mascarenhas_CintiadoCouto_D.pdf: 4558328 bytes, checksum: f219d85bc4e15d72a39a7d3242be9ffb (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A elucidação dos mecanismos moleculares envolvidos na fisiopatologia e tratamento das doenças hematológicas, bem como no entendimento do perfil de expressão gênica das linhagens celulares leucêmicas, tem sido objeto de numerosas investigações. Com o uso da técnica SSH (Subtractive Supression Hybridization ou Biblioteca Subtrativa Supressiva) foi possível identificar importantes genes que se encontram diferencialmente expressos em granulócitos de pacientes com Leucemia Mielóide Crônica e indivíduos controle. Foram encontrados 39 genes superexpressos e 173 com expressão diminuída em células de LMC. Ao relacionar esses genes com vias metabólicas que estão reguladas positiva (expressão aumentada) ou negativamente (expressão diminuída) nessa doença, verificou-se que a maioria dos genes estavam relacionados com a regulação de NF-kB, AKT, o Interferon e a IL-4 em células de controle. Entre os genes superexpressos encontrados na LMC, foi observado o SEPT5, RUNX1, MIER1, KPNA6 e FLT3, enquanto PAN3, TOB1 e ITCH estavam com expressão diminuída nessa doença em comparação com indivíduos controle. O TOB1 se mostrou promissor, uma vez que é um gene supressor tumoral, pode estar envolvido na proliferação de células leucêmicas e interage com vários outros genes encontrados neste estudo. Assim, devido à grande heterogeneidade de funções relacionadas com a expressão desse gene, foi investigada a relação entre a expressão de mRNA e as respostas aos ITK's na LMC. A avaliação foi realizada por PCR em tempo real em doentes com CCgR, PCgR, MINCgR e NOCgR após tratamento com TKI's e os resultados foram comparados com a expressão em granulócitos de indivíduos controle, observando que os pacientes NOCgR têm uma expressão de TOB1 significativamente inferior em comparação com doadores saudáveis e pacientes que alcançaram RCgC. Ao comparar pacientes não resistentes e resistentes a diferença foi significativa. Esses resultados sugerem que a expressão diminuída de TOB1 em pacientes NOCgR pode ser indicativo de desregulação da apoptose e de vias de sinalização importantes nessa doença incluindo a via da AKT, conduzindo assim a resistência a ITK's nesses pacientes. Outro objetivo deste trabalho foi caracterizar a função dos genes TOB1 e SEPT5 nos processos celulares e vias de sinalização de apoptose, proliferação, migração e ciclo celular em linhagens celulares leucêmicas. Ao realizar o silenciamento desses genes (utilizando partículas lentivirais) notou-se que o silenciamento de TOB1, como já descrito na literatura em outras doenças, interfere na proliferação celular, clonogenicidade, apoptose, ciclo celular e expressão de proteínas importantes da cascata de sinalização, o que salienta sua importância em células BCR-ABL positivas. Já o gene SEPT5 ao ser silenciado leva a algumas alterações como a apoptose e ciclo celular. Nesse contexto, o silenciamento destes genes chama atenção para as possibilidades de controle da proliferação celular, apoptose, ciclo celular e clonogenicidade em células BCR-ABL positivas. Foi realizada a avaliação da expressão desses genes em células de sangue periférico e medula óssea de pacientes com LMC e indivíduos controles, linhagens celulares de câncer humano e linhagens de murino. Os resultados mostraram um aumento significativo na expressão do gene SEPT5 em todos os tipos celulares analisados em pacientes com LMC. O mesmo padrão foi observado em células de murino que possuem a mutação T315I e em células humanas que possuem a translocação t(9;22) e estão relacionadas com a fase blástica da doença [K562, KU812, NALM]. Quando avaliada a expressão do gene TOB1 nota-se diminuição em todos os tipos celulares analisados em pacientes com LMC e em células BaF3T315I. Também foi observada uma baixa expressão em células com a t(9;22) e estão relacionadas com a fase blástica da doença[K562, KU812, NALM] quando comparadas a expressão em medula óssea controle. Outro resultado interessante foi obtido a partir da análise de adesão celular em granulócitos de pacientes com LMC e controles, evidenciando a diminuição da adesão em granulócitos de pacientes com LMC em relação aos de controles, levando a hipótese de que essa alteração nas propriedades adesivas dos granulócitos em pacientes com LMC pode estar diretamente ligada à liberação de células jovens pela matriz da medula óssea. A criação de estratégias que levam ao melhor entendimento da fisiopatologia da doença e avanço no tratamento da LMC deve ser focada em vários genes alvos e não apenas no BCR-ABL, pois no desenvolvimento da LMC há a ativação e desativação de várias vias de sinalização celular. Os resultados deste estudo podem ajudar na melhor compreensão dessas vias e também para identificar outros genes e vias úteis para a melhora no manejo terapêutico e criação de novas drogas para o tratamento dessa doença / Abstract: The elucidation of the molecular mechanisms involved in the pathophysiology and treatment of blood disorders, as well as the understanding of genes expression profiling of leukemia cell lines has been the focus of numerous investigations. The use of the SSH (Suppression Subtractive Hybridization Library or Suppression Subtractive) technique made available the identification of important genes which are differentially expressed in granulocytes from patients with chronic myeloid leukemia (CML) and healthy controls. 39 genes overexpressed were found, and 173 with decreased expression in CML cells. When correlating these genes with metabolic pathways that are regulated positively (increased expression) or negatively (decreased expression) in this disease, it was found that most of the genes were related to the regulation of NF-kB, AKT, Interferon and IL-4 in control cells. The following genes were found overexpressed in CML: SEPT5, RUNX1, MIER1, KPNA6 and FLT3, while PAN3, TOB1 and ITCH were found with decreased expression in this disease compared with controls. The TOB1 gene showed promising since it is a tumor suppressor, may be involved in the proliferation of leukaemic cells and interacts with several others genes found in this study. Thus, due to the great heterogeneity of functions related to this gene, was investigated the relationship between mRNA expression and TKI's responses. The evaluation was performed by real time PCR in patients with CCgR, PCgR, MINCgR and NOCgR after treatment with TKI and healthy controls. Was observed that patients that have NOCgR, the TOB1 expression is significantly lower compared with healthy donors and patients who achieved CCgR. When comparing non-resistant and resistant patients the difference also was significant. These results suggest that reduced expression of TOB1 in NOCgR patients may indicate apoptosis deregulation and changes in important signaling pathways of CML including the Akt pathway, thereby leading to TKI's resistance of these patients. Another aim of this work was to characterize the function of TOB1 and SEPT5 in cellular processes and signaling pathways of apoptosis, proliferation, migration and cell cycle in leukemic cell lines. After the silencing of these genes (using lentiviral particles), was noted that the silencing TOB1 - as described in the literature for other diseases - interferes in cell proliferation, clonogenicity, apoptosis, cell cycle and in expression of important proteins at signaling cascade, which emphasizes its importance in BCR-ABL positive cells. The SEPT5 silencing leads to some changes such as apoptosis and cell cycle. In this context, the silencing of these genes leads to attention of possibilities of control of cell proliferation, apoptosis, cell cycle and cell clonogenicity in BCR-ABL positive cells. Was assessed the expression of these genes in cells from peripheral blood and bone marrow of CML patients and controls, as well in human and murine cell lines. Results showed a significant increase in SEPT5 gene expression in patients with CML in all cell types evaluated. The same profile was observed in murine cells BAF3T315I and in human cells having the translocation t (9; 22) been related to blast crisis [K562, KU812, NALM]. When measuring expression of TOB1, was noted decrease in all cell types studied in CML patients and cells BaF3T315I. Another interesting result was obtained from the analysis of cell adhesion at granulocytes in CML patients and controls which showed decreased adhesion of granulocytes in CML patients compared to controls, leading to the hypothesis that the change in adhesive properties at CML can be directly linked to the release of young cells by bone marrow. The creation of strategies that lead to better understanding of the pathophysiology of the disease and advance in the treatment of CML should be focused on several target genes and not only in BCR-ABL, since in the development of CML there is an activation and deactivation of multiple signaling pathways . The results of this study may help to better understand these pathways and also to identify other genes and pathways useful for improving the management and development of new therapeutic drugs to treat this disease / Doutorado / Clinica Medica / Doutora em Clínica Médica

A utilização de Inibidores da Tirosino Quinase (ITQ) alterou drasticamente a expectativa de vida do paciente com Leucemia Mielóide Crônica (LMC) e o monitoramento da expressão do oncogene BCR-ABL1 tornou-se um fator prognóstico fundamental para avaliação da resposta ao tratamento. Atualmente, a necessidade de desenvolvimento de metodologias moleculares que facilitem a quantificação rápida, barata e sensível, associada à detecção precoce de baixos níveis de BCR-ABL1, tem proporcionado o surgimento de diversos ensaios comerciais para monitoramento molecular. Entretanto, estes kits possuem uma variabilidade na sua composição, execução e parâmetros analíticos, principalmente com relação à sensibilidade, o que torna os resultados, muitas vezes, não comparáveis. Esse trabalho teve como objetivo revisar a literatura buscando identificar as diferentes opções comerciais disponíveis para o monitoramento do BCR-ABL1, além de comparar os resultados de dois destes ensaios com a metodologia de referência. A partir da revisão realizada, identificamos cinco kits comerciais como principais opções disponíveis para monitoramento de BCR-ABL1 na LMC: GeneXpert® BCR-ABL Assay (Cepheid), Ipsogen® BCR-ABL1 Mbcr Fusion Quant Kit (QIAGEN), BCR-ABL1 Quant RUO™ Assay (Asuragen), LightCycler® t(9;22) Quantification Kit (Roche Molecular Biochemicals) e ODK-1201 (Otsuka Pharmaceutical Co. Ltd.). Posteriormente, comparamos os resultados e avaliamos o desempenho dos ensaios GeneXpert® BCR-ABL e do BCR-ABL1 Quant RUO™ com a metodologia de referência a partir de amostras de 60 pacientes com LMC em uso de ITQ. Identificamos uma concordância global ótima, com coeficientes de correlação de 0,97 (GeneXpert® BCR-ABL Assay) e 0,84 (BCR-ABL1 Quant RUO™ Assay). No entanto, na avaliação da concordância relacionada ao alcance ou não de uma Resposta Molecular Maior (RMM), o ensaio BCR-ABL1 Quant RUO™ apresentou melhores resultados, com uma menor discrepância para respostas moleculares profundas. A análise estratificada por subtipos de transcritos de BCR-ABL1 não mostrou diferença de desempenho entre os dois ensaios. A partir das análises comparativas realizadas e respectivas vantagens de cada teste, aliados aos dados obtidos a partir da revisão da literatura, sugere-se que o GeneXpert® BCR-ABL poderia ser utilizado como um teste primário, devido à rapidez do ensaio, enquanto o BCR-ABL1 Quant RUO™, por apresentar resultados associados a uma maior sensibilidade, poderia ser um teste secundário, a fim de confirmar resultados abaixo de uma RMM ou resultados não detectáveis. Fica evidente que a escolha de um ensaio comercial deve atender às necessidades de cada laboratório, mas que, fundamentalmente, esteja alinhada às recomendações internacionais de quantificação. / The use of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) has drastically changed the life expectancy of patients with chronic myeloid leukemia (CML) and monitoring the expression of the BCR-ABL1 oncogene has become a key prognostic factor for assessing treatment response. The need to development molecular methodologies that facilitate fast, cheap and sensitive quantification associated with the early detection of low levels of BCR-ABL1 has led to the emergence of several commercial assays for molecular monitoring. However, these kits have variability in their composition, performance and analytical parameters, mainly in relation to the sensitivity, which makes the results often not comparable. This work aimed to review the literature in order to identify the different commercial options available for the monitoring of BCR-ABL1, in addition to comparing the results of two of these tests with the reference methodology. From the review, we identified five commercial kits as the main options available for monitoring BCR-ABL1 in the LMC: GeneXpert® BCR-ABL Assay (Cepheid), Ipsogen® BCR-ABL1 Mbcr Fusion Quant Kit (QIAGEN), BCR-ABL1 Quant RUO™ Assay (Asuragen), LightCycler® t (9; 22) Quantification Kit (Roche Molecular Biochemicals) and ODK-1201 (Otsuka Pharmaceutical Co. Ltd.). Subsequently, we compared the results and evaluated the performance of the GeneXpert® BCR-ABL and BCR-ABL1 Quant RUO™ with reference methodology from samples of 60 patients with CML using TKI. We identified an optimal overall agreement for the two trials, with correlation coefficients of 0.97 and 0.84, respectively. However, in the evaluation of the agreement related to the reach of a Major Molecular Response (MMR), the BCR-ABL1 Quant RUO™ assay presented better results, with a smaller discrepancy for deep molecular responses. Analysis stratified by subtypes of BCR-ABL1 transcripts showed no difference in performance between the two assays. From the comparative analyzes performed and the respective advantages of each test, allied to the data obtained from the literature review, it is suggested that GeneXpert® BCR-ABL assay could be used as a primary test, due to the rapidity of the assay, while the BCR-ABL1 Quant RUO™, for presenting results associated with increased sensitivity, could be a secondary test in order to confirm results below an MMR or undetected results. It is clear that the choice of a commercial assay should meet the needs of each laboratory, but that it is fundamentally in line with international quantification recommendations.

A utilização de Inibidores da Tirosino Quinase (ITQ) alterou drasticamente a expectativa de vida do paciente com Leucemia Mielóide Crônica (LMC) e o monitoramento da expressão do oncogene BCR-ABL1 tornou-se um fator prognóstico fundamental para avaliação da resposta ao tratamento. Atualmente, a necessidade de desenvolvimento de metodologias moleculares que facilitem a quantificação rápida, barata e sensível, associada à detecção precoce de baixos níveis de BCR-ABL1, tem proporcionado o surgimento de diversos ensaios comerciais para monitoramento molecular. Entretanto, estes kits possuem uma variabilidade na sua composição, execução e parâmetros analíticos, principalmente com relação à sensibilidade, o que torna os resultados, muitas vezes, não comparáveis. Esse trabalho teve como objetivo revisar a literatura buscando identificar as diferentes opções comerciais disponíveis para o monitoramento do BCR-ABL1, além de comparar os resultados de dois destes ensaios com a metodologia de referência. A partir da revisão realizada, identificamos cinco kits comerciais como principais opções disponíveis para monitoramento de BCR-ABL1 na LMC: GeneXpert® BCR-ABL Assay (Cepheid), Ipsogen® BCR-ABL1 Mbcr Fusion Quant Kit (QIAGEN), BCR-ABL1 Quant RUO™ Assay (Asuragen), LightCycler® t(9;22) Quantification Kit (Roche Molecular Biochemicals) e ODK-1201 (Otsuka Pharmaceutical Co. Ltd.). Posteriormente, comparamos os resultados e avaliamos o desempenho dos ensaios GeneXpert® BCR-ABL e do BCR-ABL1 Quant RUO™ com a metodologia de referência a partir de amostras de 60 pacientes com LMC em uso de ITQ. Identificamos uma concordância global ótima, com coeficientes de correlação de 0,97 (GeneXpert® BCR-ABL Assay) e 0,84 (BCR-ABL1 Quant RUO™ Assay). No entanto, na avaliação da concordância relacionada ao alcance ou não de uma Resposta Molecular Maior (RMM), o ensaio BCR-ABL1 Quant RUO™ apresentou melhores resultados, com uma menor discrepância para respostas moleculares profundas. A análise estratificada por subtipos de transcritos de BCR-ABL1 não mostrou diferença de desempenho entre os dois ensaios. A partir das análises comparativas realizadas e respectivas vantagens de cada teste, aliados aos dados obtidos a partir da revisão da literatura, sugere-se que o GeneXpert® BCR-ABL poderia ser utilizado como um teste primário, devido à rapidez do ensaio, enquanto o BCR-ABL1 Quant RUO™, por apresentar resultados associados a uma maior sensibilidade, poderia ser um teste secundário, a fim de confirmar resultados abaixo de uma RMM ou resultados não detectáveis. Fica evidente que a escolha de um ensaio comercial deve atender às necessidades de cada laboratório, mas que, fundamentalmente, esteja alinhada às recomendações internacionais de quantificação. / The use of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) has drastically changed the life expectancy of patients with chronic myeloid leukemia (CML) and monitoring the expression of the BCR-ABL1 oncogene has become a key prognostic factor for assessing treatment response. The need to development molecular methodologies that facilitate fast, cheap and sensitive quantification associated with the early detection of low levels of BCR-ABL1 has led to the emergence of several commercial assays for molecular monitoring. However, these kits have variability in their composition, performance and analytical parameters, mainly in relation to the sensitivity, which makes the results often not comparable. This work aimed to review the literature in order to identify the different commercial options available for the monitoring of BCR-ABL1, in addition to comparing the results of two of these tests with the reference methodology. From the review, we identified five commercial kits as the main options available for monitoring BCR-ABL1 in the LMC: GeneXpert® BCR-ABL Assay (Cepheid), Ipsogen® BCR-ABL1 Mbcr Fusion Quant Kit (QIAGEN), BCR-ABL1 Quant RUO™ Assay (Asuragen), LightCycler® t (9; 22) Quantification Kit (Roche Molecular Biochemicals) and ODK-1201 (Otsuka Pharmaceutical Co. Ltd.). Subsequently, we compared the results and evaluated the performance of the GeneXpert® BCR-ABL and BCR-ABL1 Quant RUO™ with reference methodology from samples of 60 patients with CML using TKI. We identified an optimal overall agreement for the two trials, with correlation coefficients of 0.97 and 0.84, respectively. However, in the evaluation of the agreement related to the reach of a Major Molecular Response (MMR), the BCR-ABL1 Quant RUO™ assay presented better results, with a smaller discrepancy for deep molecular responses. Analysis stratified by subtypes of BCR-ABL1 transcripts showed no difference in performance between the two assays. From the comparative analyzes performed and the respective advantages of each test, allied to the data obtained from the literature review, it is suggested that GeneXpert® BCR-ABL assay could be used as a primary test, due to the rapidity of the assay, while the BCR-ABL1 Quant RUO™, for presenting results associated with increased sensitivity, could be a secondary test in order to confirm results below an MMR or undetected results. It is clear that the choice of a commercial assay should meet the needs of each laboratory, but that it is fundamentally in line with international quantification recommendations.

Made available in DSpace on 2016-08-29T15:34:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_6281_Dissertação_Roberta Bitencourt Moreira_2013.pdf: 2949871 bytes, checksum: 0c46a98a4735b38e93978376b508fac6 (MD5) Previous issue date: 2013-03-06 / A Leucemia mielóide crônica (LMC) é caracterizada por uma alteração citogenética conhecida, o cromossomo Philadelphia (Ph),resultado da translocação recíproca t(9;22)(q34;q11).O gene de fusão bcr-abl codifica uma proteína de fusão com atividade tirosina cinase aumentada que desregula vias de transdução de sinais ligadas a proliferação, apoptose e diferenciação celular. A evolução natural da LMC quando não tratada é trifásica, mas atualmente, esta dinâmica foi alterada a partir do desenvolvimento dos inibidores de tirosina cinase (ITC). O imatinibe (Glivec®, Novartis) foi o primeiro ITC aprovado para o tratamento da LMC. A atualização de oito anos do estudo internacional randomizado do interferon e imatinibe (IRIS), ratificou a eficácia e a segurança do uso de imatinibea longo prazo com uma sobrevida global de 85% e uma sobrevida livre de evento de 81%.Entretanto, algumas mutações no domínio cinasedo gene bcr-ablconferem resistência elevada a um ou mais ITC influenciando a escolha da terapia subsequente como no caso de uma mutação T315I, que é altamente resistente ao imatinibe.Apesar de múltiplos fatores contribuírem para a resistência ao imatinibe, a presença de mutação é mais prevalente e tem sido a mais investigada. Diante disso, foram selecionados pacientes de dois hospitais da Região da Grande Vitória que realizam atendimento aos pacientes portadores de LMC pelo Sistema Único de Saúde (SUS) que são encaminhados para o Laboratório de Biologia Molecular do Centro de Transplante de Medula Óssea (CEMO) do Instituto Nacional de Câncer (INCA) para avaliação da resposta molecular aos ITCs, para análise de mutação. Também foi desenvolvido um banco de dados no Microsoft Access® para LMCque permite relacionar informações clínicas e laboratoriais de citogenética e biologia molecular, facilitando o acompanhamento de pacientes com LMC, a compreensão da evolução da doença e o desenvolvimento de pesquisas biotecnológicas. / The chronic myeloid leukemia (CML) is characterized by a cytogenetic alteration known as Philadelphia chromosome (Ph), a result of reciprocal translocation t (9; 22) (q34; q11). The resulting fusion bcr-abl gene encodes a protein with tyrosine kinase constitutive activity that deregulates signal transduction inducing proliferation, apoptosis, and cellular differentiation. The natural evolution of CML is currently changing with the development of tyrosine kinase inhibitors (TKI). Imatinib (Gleevec® , Novartis) was the first TKI approved for the treatment of CML. The eight-year update of the international randomized study of interferon and imatinib (IRIS), confirmed the efficacy and safety of imatinib in the long term with an overall survival of 85% and an event-free survival of 81%. However, some mutations in the kinase domain BCR-ABL confer resistance to one or more TKI, influencing the choice of therapy, as in the case of a T315I mutation, which is highly resistant to imatinib. Although many factors contribute to the resistance to imatinib, the presence of mutations is more prevalent and has been further investigated. Therefore, were aimed to perform mutation analysis in patients with a resistant phenotype of two cancer reference hospitals in Vitoria, ES, Brazil. We also developed a CML database relating clinical information and laboratory cytogenetics and molecular biology results, facilitating the monitoring of CML patients, as well as the understanding of disease progression.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:07Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-26Bitstream added on 2014-06-13T19:49:53Z : No. of bitstreams: 1 souza_mp_me_botfm.pdf: 6711737 bytes, checksum: 1ecb9df853dbd806868302e90e1916ee (MD5) / Fundação Amaral Carvalho / Estudo retrospectivo com a finalidade de avaliar o impacto da introdução de um regime alternativo de condicionamento para transplantes de medula óssea alogênicos com doadores aparentados, totalmente compatíveis, portadores de Leucemia Mielóide Crônica, em Fase Crônica. No período de agosto de 1996 a julho de 2008, foram incluídos 158 pacientes, analisados em dois diferentes momentos: o primeiro inclui os pacientes transplantados antes de 2004, quando 72(45%) deles, foram tratados com a combinação Busulfano e Ciclofosfamida (BUCY). Neste período inicial os dados demonstraram melhores resultados nos pacientes abaixo de 30 anos. No segundo período (após 2004) o regime de condicionamento era orientado em função da idade do receptor, condições clínicas, e pelo histórico individual de comorbidades. Com um total de 86 pacientes, transplantados até o final da análise, 44(28%) deles receberam a combinação BUCY e 42(27%) indivíduos foram alocados para o protocolo envolvendo Busulfano e Fludarabina (FLUBU). As informações do grupo transplantado antes de 2004 mostram forte influência da idade do receptor, acima ou abaixo de 30 anos, na Sobrevida Global (p=0, 005), na Sobrevida Livre de Doença (p=0, 001) e na Mortalidade não Relacionada à Recaída (p=0,01). Outra observação nessa população foi a ocorrência da Doença Enxerto contra o Hospedeiro crônica, aos cinco anos, mais freqüentemente observada entre os pacientes que receberam Células Progenitoras Periféricas (92% vs 49% quando foi utilizada a Medula Óssea como fonte, p= 0, 004). Após 2004 os dois grupos de tratamento foram muito heterogêneos em relação a sua composição etária, com idade mediana superior no grupo que recebeu FLUBU (45 (28 a 54) anos vs. 28 (16 a 51) anos... / This is a retrospective study that aims to assess the impact of the introduction of an alternative conditioning regimen in stem celltransplants with allogeneic fully matched related donors, in patients with Chronic Myeloid Leukemia in Chronic Phase. From August 1996 to July 2008 we included 158 patients, tested during two different periods: the first period includes patients transplanted before 2004, when 72 (45%) of them were treated with the combination of Busulfan and Cyclophosphamide (BUCY). These data demonstrated that the outcome was better among patients below the age of 30 years. The second period comprised all patients transplanted after 2004. In this second period the choice of the conditioning regimen was based on recipient age, clinical condition and the individual history of comorbidities . With a total of 86 patients transplanted by the end of the analysis, 44 (28%) of them received the BUCY combination and 42 (27%) patients were allocated to the protocol with Busulfan and Fludarabine (FLUBU). For the group transplanted before 2004 a strong influence of recipient age (above or below 30 years old) on Overall Survival (p = 0.005), Disease-free Survival (p = 0.001) and Mortality Related to Transplantation (p = 0.01) could be demonstrated. Graft Versus Host Disease, at five years, was most frequently observed among patients receiving Peripheral blood Progenitor Cells (92% vs 49%) when compared with the use of Bone Marrow as a stem cell source, p = 0.004). After 2004 the two treatment groups were very heterogeneous in relation to their age structure, with older patients receiving FLUBU (45 (28 to 54) years vs 28 (16 to 51), p < 0.0001). Although we analyzed two distinct age groups , the results were comparable in terms of Overall Survival at 3 years (p = 0.49) in Disease-free Survival at 3 ... (Complete abstract click electronic access below)

A utilização de Inibidores da Tirosino Quinase (ITQ) alterou drasticamente a expectativa de vida do paciente com Leucemia Mielóide Crônica (LMC) e o monitoramento da expressão do oncogene BCR-ABL1 tornou-se um fator prognóstico fundamental para avaliação da resposta ao tratamento. Atualmente, a necessidade de desenvolvimento de metodologias moleculares que facilitem a quantificação rápida, barata e sensível, associada à detecção precoce de baixos níveis de BCR-ABL1, tem proporcionado o surgimento de diversos ensaios comerciais para monitoramento molecular. Entretanto, estes kits possuem uma variabilidade na sua composição, execução e parâmetros analíticos, principalmente com relação à sensibilidade, o que torna os resultados, muitas vezes, não comparáveis. Esse trabalho teve como objetivo revisar a literatura buscando identificar as diferentes opções comerciais disponíveis para o monitoramento do BCR-ABL1, além de comparar os resultados de dois destes ensaios com a metodologia de referência. A partir da revisão realizada, identificamos cinco kits comerciais como principais opções disponíveis para monitoramento de BCR-ABL1 na LMC: GeneXpert® BCR-ABL Assay (Cepheid), Ipsogen® BCR-ABL1 Mbcr Fusion Quant Kit (QIAGEN), BCR-ABL1 Quant RUO™ Assay (Asuragen), LightCycler® t(9;22) Quantification Kit (Roche Molecular Biochemicals) e ODK-1201 (Otsuka Pharmaceutical Co. Ltd.). Posteriormente, comparamos os resultados e avaliamos o desempenho dos ensaios GeneXpert® BCR-ABL e do BCR-ABL1 Quant RUO™ com a metodologia de referência a partir de amostras de 60 pacientes com LMC em uso de ITQ. Identificamos uma concordância global ótima, com coeficientes de correlação de 0,97 (GeneXpert® BCR-ABL Assay) e 0,84 (BCR-ABL1 Quant RUO™ Assay). No entanto, na avaliação da concordância relacionada ao alcance ou não de uma Resposta Molecular Maior (RMM), o ensaio BCR-ABL1 Quant RUO™ apresentou melhores resultados, com uma menor discrepância para respostas moleculares profundas. A análise estratificada por subtipos de transcritos de BCR-ABL1 não mostrou diferença de desempenho entre os dois ensaios. A partir das análises comparativas realizadas e respectivas vantagens de cada teste, aliados aos dados obtidos a partir da revisão da literatura, sugere-se que o GeneXpert® BCR-ABL poderia ser utilizado como um teste primário, devido à rapidez do ensaio, enquanto o BCR-ABL1 Quant RUO™, por apresentar resultados associados a uma maior sensibilidade, poderia ser um teste secundário, a fim de confirmar resultados abaixo de uma RMM ou resultados não detectáveis. Fica evidente que a escolha de um ensaio comercial deve atender às necessidades de cada laboratório, mas que, fundamentalmente, esteja alinhada às recomendações internacionais de quantificação. / The use of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) has drastically changed the life expectancy of patients with chronic myeloid leukemia (CML) and monitoring the expression of the BCR-ABL1 oncogene has become a key prognostic factor for assessing treatment response. The need to development molecular methodologies that facilitate fast, cheap and sensitive quantification associated with the early detection of low levels of BCR-ABL1 has led to the emergence of several commercial assays for molecular monitoring. However, these kits have variability in their composition, performance and analytical parameters, mainly in relation to the sensitivity, which makes the results often not comparable. This work aimed to review the literature in order to identify the different commercial options available for the monitoring of BCR-ABL1, in addition to comparing the results of two of these tests with the reference methodology. From the review, we identified five commercial kits as the main options available for monitoring BCR-ABL1 in the LMC: GeneXpert® BCR-ABL Assay (Cepheid), Ipsogen® BCR-ABL1 Mbcr Fusion Quant Kit (QIAGEN), BCR-ABL1 Quant RUO™ Assay (Asuragen), LightCycler® t (9; 22) Quantification Kit (Roche Molecular Biochemicals) and ODK-1201 (Otsuka Pharmaceutical Co. Ltd.). Subsequently, we compared the results and evaluated the performance of the GeneXpert® BCR-ABL and BCR-ABL1 Quant RUO™ with reference methodology from samples of 60 patients with CML using TKI. We identified an optimal overall agreement for the two trials, with correlation coefficients of 0.97 and 0.84, respectively. However, in the evaluation of the agreement related to the reach of a Major Molecular Response (MMR), the BCR-ABL1 Quant RUO™ assay presented better results, with a smaller discrepancy for deep molecular responses. Analysis stratified by subtypes of BCR-ABL1 transcripts showed no difference in performance between the two assays. From the comparative analyzes performed and the respective advantages of each test, allied to the data obtained from the literature review, it is suggested that GeneXpert® BCR-ABL assay could be used as a primary test, due to the rapidity of the assay, while the BCR-ABL1 Quant RUO™, for presenting results associated with increased sensitivity, could be a secondary test in order to confirm results below an MMR or undetected results. It is clear that the choice of a commercial assay should meet the needs of each laboratory, but that it is fundamentally in line with international quantification recommendations.

Orientadores: Fabiola Traina, Sara Teresinha Olalla Saad / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T21:51:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MachadoNeto_JoaoAgostinho_M.pdf: 23849071 bytes, checksum: df78354ffdd25c98c274422937e03f93 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A ocorrência da leucemia aguda resulta de uma combinação de mutações e alterações em funções protéicas que conferem a capacidade de proliferação, defeito na diferenciação e apoptose celular. Síndromes mielodisplásicas (SMD) são desordens hematopoéticas resultantes de alterações na célula pluripotente, caracterizadas por hematopoese ineficaz e alta taxa de evolução para leucemia mieloide aguda (LMA). Células leucêmicas expressam uma variedade de receptores de fatores de crescimento e citocinas, como o receptor do Insulin-like growth factor 1 (IGF-1R). A via de sinalização do IGF-1 inicia-se através da ativação de seu receptor e subsequente ativação de seus substratos, como os substratos do receptor de insulina (IRS). Algumas evidências indicam a participação das proteínas IRS em doenças hematológicas: (1) IRS1 foi descrito como constitutivamente fosforilado e associado ao BCR-ABL em células K562; (2) a expressão de IRS1 foi relacionada com pior prognóstico em leucemia linfóide aguda (LLA) BCR-ABL positiva; (3) IRS2 associa-se ao receptor de eritropoetina; (4) a expressão de IRS2 foi modulada durante estímulos com eritropoetina e IGF-1 e em processos de diferenciação em células hematopoéticas normais e leucêmicas. Neste estudo, foi observada a presença da expressão gênica e protéica de IRS1 e IRS2 em células hematopoéticas normais, mielodisplásicas e leucêmicas, entretanto, o padrão de expressão das duas proteínas foi diferente. Em linhagens celulares de leucemia aguda, IRS1 foi expresso em linhagens de leucemia aguda mieloide (P39, K562, NB4, KG-1, e HL60) e linfoide (MOLT4, Jurkat, Raji e Daudi), enquanto que IRS2 foi expresso preferencialmente em linhagens mieloides. Em células hematopoéticas primárias, não houve diferença na expressão de IRS1 entre células hematopoéticas de pacientes com SMD e LMA e controles normais, e a expressão gênica de IRS1 apresentou-se aumentada em amostras de medula óssea de pacientes com LLA em relação aos controles normais. A expressão de IRS2 foi menor nas amostras de medula óssea de pacientes com SMD, LMA e LLA em relação aos controles normais, e a expressão de IRS2 foi menor em pacientes com SMD de alto risco se comparados com SMD baixo risco, de acordo com a classificação FAB, WHO e com número de citopenias. A participação de IRS2 na diferenciação eritróide de células hematopoéticas normais e mielodisplásicas foi evidenciada através da avaliação da expressão de IRS2 durante a diferenciação eritroide de células progenitoras de medula óssea de doadores normais e de pacientes com SMD. O estudo evidenciou o aumento da expressão de IRS2 durante a diferenciação eritroide, sendo que nas células mielodisplásicas, IRS2 apresentou um menor aumento se comparado às células hematopoéticas normais. Em células BCR-ABL positivas, a inibição da expressão de IRS1 (realizada através do uso de shRNA mediado por lentivírus específico para IRS1) resultou em inibição da proliferação celular e crescimento clonal, acúmulo de células na fase G0/G1 e redução de células na fase S do ciclo celular. A inibição de IRS1 resultou na inibição da fosforilação das proteínas Akt, P70S6K e ERK. Entretanto, a inibição de IRS1 não modulou a apoptose e as proteínas BCL2, BAX e BAD, assim como não modulou a fosforilação de BCR-ABL e CRKL e não apresentou sinergismo quando associado ao inibidor de tirosina quinase do BCR-ABL (imatinib). Estes dados indicam que IRS1 participa dos processos celulares de proliferação celular e clonogenicidade em células BCR-ABL positivas, através da modulação de Akt, P70S6K e ERK. Os achados aqui descritos sugerem que IRS1 é expresso em células hematopoéticas normais, mielodisplásicas e leucêmicas, destacando-se sua elevada expressão em células de LLA e sua participação na via de sinalização BCR-ABL. Estes dados indicam que IRS1 pode ser um alvo terapêutico em LLA e leucemia mieloide crônica (LMC), especialmente nas leucemias BCR-ABL positivas e resistentes a inibidores da atividade tirosina quinase do BCR-ABL. Adicionalmente, IRS2 é expresso em células hematopoéticas, destacando-se a sua expressão reduzida em células mielodisplásicas e leucêmicas quando comparadas às células hematopoéticas normais. A reduzida expressão de IRS2 em células hematopoéticas de pacientes com SMD de alto risco quando comparados aos de baixo risco e o reduzido aumento da expressão de IRS2 na diferenciação eritroide de progenitores de pacientes com SMD sugerem que a expressão de IRS2 participa da fisiopatologia das SMD e pode ser um marcador prognóstico nesta doença / Abstract: Acute leukemia results from a combination of mutations and changes in protein functions that confer the ability of proliferation, and defect in differentiation and apoptosis. Myelodysplastic syndromes (MDS) are hematopoietic disorders caused by alterations in pluripotent cells, characterized by ineffective hematopoiesis and a high rate of progression towards acute myeloid leukemia (AML). Leukemia cells express a variety of receptors for growth factors and cytokines, such as Insulin-like growth factor 1 (IGF-1R). The signaling pathway is initiated by activating its receptor and subsequent activation of its substrates such as insulin receptor substrate (IRS). There is evidence that suggests an involvement of IRS proteins in hematopoeitic disease: (1) IRS1 was described as constitutively phosphorylated and associated with BCR-ABL in K562 cells, (2) the IRS1 expression was associated with a poorer prognosis in BCR-ABL positive acute lymphoblastic leukemia (ALL), (3) IRS2 bind to erythropoietin receptors, (4) IRS2 expression was modulated during stimulation with erythropoietin and IGF-1 during cell differentiation in normal and leukemia hematopoietic cells. In this study, we observed the presence of the gene and protein of IRS1 and IRS2 in normal hematopoietic, leukemia, and myelodysplastic cells, however, the expression pattern of these proteins was different. In acute leukemia cell lines, IRS1 was expressed in myeloid leukemia cells (P39, K562, NB4, KG-1 e HL60) and lymphoid leukemia cells (MOLT4, Junkat, Raji e Daudi), whereas IRS2 expression was more evident in myeloid cell lines. In primary hematopoietic cells, no difference was observed in IRS1 expression between normal, MDS and AML cells, and the IRS1 expression was increased in bone marrow samples from ALL patients compared to normal controls. IRS2 expression was lower in bone marrow samples from patients with MDS, AML and ALL compared to normal controls, and the IRS2 expression was lower in high risk compared with low risk MDS patients, according to FAB and WHO classification, and number of cytopenias. The participation of IRS2 in erythroid differentiation of normal and myelodysplastic hematopoietic cells was evidenced by evaluating IRS2 expression during erythroid differentiation of progenitor cells from the bone marrow of normal donors and patients with MDS. The study demonstrated an increase in IRS2 expression during erythroid differentiation, whereas in myelodysplastic cells, IRS2 showed a smaller increase compared to normal hematopoietic cells. In BCR-ABL positive cells, IRS1 inhibition (by lentivirus-mediated shrunk specific for IRS1) resulted in inhibition of cell proliferation and clonal growth, accumulation of the cells in G0/G1 phase and reduction of cells in S phase of cell cycle. The IRS1 silencing resulted in inhibition of Akt, P70S6K and ERK phosphorylation. However, IRS1 inhibition did not modulate apoptosis; and the proteins BCL2, BAX and BAD, did not modulate the phosphorylation of BCR-ABL and CRKL, nor did they show synergism when combined with tyrosine kinase inhibitor of BCR-ABL (Imatinib). These data indicate that IRS1 participates in the proliferation and clonogenic of BCRABL positive cells by modulation of Akt, P70S6K and ERK. The findings reported herein suggest that IRS1 is expressed in normal hematopoietic, leukemia and myelodysplastic cells, highlighting its high expression in ALL cells and involvement in the BCR-ABL pathway. These data indicate that IRS1 may be a therapeutic target in ALL and chronic myeloid leukemia (CML), especially in BCR-ABL positive leukemias resistant to inhibitors of tyrosine kinase activity of BCRABL. In addition, IRS2 is expressed in hematopoietic cells, highlighting its reduced expression in myelodysplastic and leukemia cells compared to normal hematopoietic cells. The reduced IRS2 expression in high risk when compared to low risk MDS and the lower increase in IRS2 expression during the erythroid differentiation of progenitor cells from MDS patients suggest that the expression of IRS2 participates in the pathophysiology of MDS and may be a prognostic marker in this disease / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica