O presente estudo compreende 96 transplantes de medula óssea (TMO) de doadores HLA-idênticos em pacientes portadores de Leucemia Mielóide Crônica, no período de Junho de 1986 a Junho de 1998. A autora selecionou diversas covariáveis para serem estudadas como fatores prognósticos de cinco desfechos principais: ocorrência de doença enxerto contra hospedeiro (DECH) aguda e crônica, incidência de recaída, sobrevida livre de doença (SLD) e sobrevida global (SG). As covariáveis estudadas foram: idade, sexo, escolaridade, tempo entre o diagnóstico e o transplante, fase da doença ao transplante, regime de condicionamente, profilaxia de DECH, compatibilidade de sexo entre doador e receptor, sexo do doador, tamanho do baço e do fígado, percentagem de blastos e número de plaquetas no sangue periférico na primeira consulta ao CEMO, ocorrência e grau de DECH aguda, ocorrência de DECH crônica e tempo para recuperação de plaquetas após o TMO. Não foi encontrada associação estatisticamente significativa num nível de 95% de confiança entre qualquer das covariáveis e a ocorrência de DECH crônica ou de recaída. A ocorrência de DECH aguda mostrou-se associada apenas com a fase da doença ao transplante. As covariáveis que se mostraram associadas com a sobrevida global e a sobrevida livre de doença foram: a percentagem de blastos no sangue periférico e tamanho do baço na primeira consulta ao CEMO, a fase da doença ao transplante, o tipo de profilaxia de DECH, a ocorrência e o grau de DECH aguda e o tempo para recuperação de plaquetas num nível acima de 20 x 103/mm3. / This study comprises 96 bone marrow transplantations (BMT) from HLA-identical siblings in patients with Chronic Myeloid Leukaemia (CML), from June 1986 to June 1998. The author selected several covariates to be studied as prognostic factors for five main endpoints: acute and chronic graft versus host disease (GVHD) occurrence, relapse incidence (RI), disease free survival (DFS) and overall survival (OS). The covariates studied were: age, sex, years of schooling, time from diagnosis to transplantation, disease phase at BMT, conditioning regimen, GVHD prophylaxis, sexmatch between donor-receptor, donor sex, spleen and liver size, blasts percentage and platelet counts in peripheral blood at first consultation at CEMO, acute GVHD occurrence and grade, chronic GVHD occurrence and time to platelet recovery after BMT. No statistically significant association was found between the covariates studied and the occurrence of acute or chronic GVHD or of relapse. The covariates found to have an association with overall survival (OS) and disease free survival (DFS) were the percentage of blasts in peripheral blood and the spleen size at first consultation, the disease phase at transplant, type of GVHD prophylaxis, the occurrence and grade of acute GVHD and the time to platelet recovery above 20 x 103/mm3.

Orientadora: Profa. Dra. Ana Carolina Santos de Souza Galvão / Nanoparticulas derivadas de oxidos metalicos, em suas formas livres ou associadas a moleculas organicas ou drogas antineoplasicas, tem sido empregadas no diagnostico e tratamento do cancer. Neste cenario, destaca-se o uso de oxidos nanoestruturados derivados de zinco. Recentes estudos demonstraram a capacidade de nanoparticulas de ZnO, individualmente ou em associacao a agentes quimioterapicos, de sensibilizacao de celulas tumorais resistentes a multiplas drogas (fenotipo MDR), que possuem em sua membrana proteinas de efluxo que impedem o acumulo destas drogas no interior das celulas. A falta de seletividade e dificuldade de internalizacao pelas celulas de alguns compostos utilizados no tratamento de cancer, sao considerados os maiores empecilhos para o tratamento quimioterapico, tornando a modificacao da superficie de materiais nanoestruturados com atividade antitumoral, atraves da funcionalizacao, forma de aumentar a incorporacao e consequente atividade citotoxica destes compostos em celulas tumorais. Neste trabalho, as nanoparticulas foram funcionalizadas com L-glutamina, devido a grande importancia deste aminoacido no metabolismo de celulas cancerigenas e ao fato destas apresentarem maior captacao desse aminoacido que celulas nao tumorais. A citotoxicidade de nanoparticulas funcionalizadas com L-glutamina ou nao funcionalizadas foi avaliada em celulas de leucemia mieloide cronica K562 e sua versao com fenotipo MDR Lucena-1. A atividade citotoxica de ZnO foi comprovada pelos ensaios de exclusao de Trypan Blue e reducao de MTT, com IC50 de 20 evalencia de dupla marcacao nas celulas K562 tratadas com as nanoparticulas ZnO e ZnO_Gln, enquanto que para Lucena-1 observou-se porcentagens semelhantes de celulas duplamente marcadas e marcadas apenas com Anexina V. Para avaliar se ha influencia de especies reativas de oxigenio (EROs), geradas peLucena-1. Atraves das analises das possiveis vias de morte celular via analise de Western Blotting, estudando principalmente as proteinas e os eventos envolvidos no processo de morte celular programada (Bcl2, Bad, Bid, Caspase-3 e PARP) e autofagia (Beclin-1 e P62), observou-se que mais de uma via de morte foi ativada nas celulas tratadas com as nanoparticulas, o que corrobora com o descrito em literatura, considerando autofagia e apoptose sao as principais vias de morte ativadas pela acao citotoxica das nanoparticulas de ZnO. Outro evento observado foi a alteracao da atividade da proteina PgPieloide cronica K562 e a linhagem com fenotipo MDR Lucena-1 e a utilizacao deste aminoacido na funcionalizacao de nanomateriais pode ser uma importante ferramenta a ser explorada. / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2015. / Nanoparticles derived from metal oxides, in their free forms or associated with organic molecules or antineoplastic drugs, have been employed in the diagnosis and treatment of cancer. In this scenario, we highlight the use of zinc-based nanostructured oxides. Recent studies demonstrated the ability of ZnO nanoparticles, alone or in combination with chemotherapeutic agents, sensitization of tumor cells multidrug resistant (MDR phenotype), which have on their membrane efflux proteins that prevent the accumulation of these drugs within cells. The lack of selectivity, and difficulty internalization by cells of some compounds used in the treatment of cancer, are considered the major obstacles to chemotherapy, making the nanostructured surface modification of materials having anti-tumor activity through the functionalization way to increase the cytotoxic activity and subsequent incorporation of these compounds in tumor cells. In this work, the nanoparticles were functionalized with L-glutamine, due to the great importance of this amino acid in cancer cell metabolism and the fact that these have higher uptake of this amino acid to non-tumor cells. The cytotoxicity of nanoparticles functionalized with L-glutamine functionalized or not was evaluated in chronic myelogenous leukemia cells K562 and its version with MDR phenotype-Lucena 1. The cytotoxic activity of ZnO was confirmed by Trypan Blue exclusion and MTT reduction assays, with IC50 of 20 d K562 with ZnO nanoparticles and ZnO_Gln, while for Lucena-1 was observed similar percentages of doubly labeled cells and marked only with Annexin V. To assess whether there is influence of reactive oxygen species (ROS) generated by nanoparticles of ZnO and ZnO_Gln in their cytotoxic activity in ceC promoted protection against the cytotoxicity of nanoparticles even in higher concentrations of nanoparticles (30 ug / ml) in both the lines cell. In the potentiation of cell death caused by ZnO nanoparticles in cell lines studied, functionalization with L-glutamine promoted greater incorporation o562 cells treated with pure functionalized nanoparticles and in relation to the control compared to cells of Lucena-1 strain. Through analysis of the possible ways of cell death via Western blot analysis, the proteins and particularly studying the events involved in programmed cell death (Bcl2, Bad, Bid, caspase-3 and PARP) and autophagy (beclin-1 and P62), there was more than one death pathway was activated in cells treated with nanoparticles, which corroborates with what is described in literature, considering autophagy and apoptosis are the main routes of death activated cytotoxic action ofytotoxic effect of ZnO in the chronic myelogenous leukemia line K562 and the line Lucena MDR-1 phenotype and use this amino acid in the functionalization of nanomaterials can be an important tool to be exploited.

O presente estudo compreende 96 transplantes de medula óssea (TMO) de doadores HLA-idênticos em pacientes portadores de Leucemia Mielóide Crônica, no período de Junho de 1986 a Junho de 1998. A autora selecionou diversas covariáveis para serem estudadas como fatores prognósticos de cinco desfechos principais: ocorrência de doença enxerto contra hospedeiro (DECH) aguda e crônica, incidência de recaída, sobrevida livre de doença (SLD) e sobrevida global (SG). As covariáveis estudadas foram: idade, sexo, escolaridade, tempo entre o diagnóstico e o transplante, fase da doença ao transplante, regime de condicionamente, profilaxia de DECH, compatibilidade de sexo entre doador e receptor, sexo do doador, tamanho do baço e do fígado, percentagem de blastos e número de plaquetas no sangue periférico na primeira consulta ao CEMO, ocorrência e grau de DECH aguda, ocorrência de DECH crônica e tempo para recuperação de plaquetas após o TMO. Não foi encontrada associação estatisticamente significativa num nível de 95% de confiança entre qualquer das covariáveis e a ocorrência de DECH crônica ou de recaída. A ocorrência de DECH aguda mostrou-se associada apenas com a fase da doença ao transplante. As covariáveis que se mostraram associadas com a sobrevida global e a sobrevida livre de doença foram: a percentagem de blastos no sangue periférico e tamanho do baço na primeira consulta ao CEMO, a fase da doença ao transplante, o tipo de profilaxia de DECH, a ocorrência e o grau de DECH aguda e o tempo para recuperação de plaquetas num nível acima de 20 x 103/mm3. / This study comprises 96 bone marrow transplantations (BMT) from HLA-identical siblings in patients with Chronic Myeloid Leukaemia (CML), from June 1986 to June 1998. The author selected several covariates to be studied as prognostic factors for five main endpoints: acute and chronic graft versus host disease (GVHD) occurrence, relapse incidence (RI), disease free survival (DFS) and overall survival (OS). The covariates studied were: age, sex, years of schooling, time from diagnosis to transplantation, disease phase at BMT, conditioning regimen, GVHD prophylaxis, sexmatch between donor-receptor, donor sex, spleen and liver size, blasts percentage and platelet counts in peripheral blood at first consultation at CEMO, acute GVHD occurrence and grade, chronic GVHD occurrence and time to platelet recovery after BMT. No statistically significant association was found between the covariates studied and the occurrence of acute or chronic GVHD or of relapse. The covariates found to have an association with overall survival (OS) and disease free survival (DFS) were the percentage of blasts in peripheral blood and the spleen size at first consultation, the disease phase at transplant, type of GVHD prophylaxis, the occurrence and grade of acute GVHD and the time to platelet recovery above 20 x 103/mm3.

A leucemia mielóide crônica (LMC) é uma doença mieloproliferativa caracterizada citogeneticamente pela presença do cromossomo Philadelfia (Ph) e molecularmente pelo neogene bcr-abl1 que codifica a oncoproteína BCR-ABL com alta atividade de tirosina-quinase. A célula leucêmica BCR-ABL+ apresenta baixa adesão ao estroma medular, resistência à apoptose e potencial mitogênico exacerbado. A LMC possui curso evolutivo trifásico (fase crônica, acelerada e blástica) e seu tratamento pode ser realizado por meio de diferentes modalidades terapêuticas, destacando-se o mesilato de imatinibe (MI) que inibe a TK BCR-ABL induzindo altas taxas de remissão citogenética dos pacientes na fase crônica da doença. Apesar do MI ser eficiente, os pacientes na fase acelerada e blástica da doença são comumente refratários a essa terapia e na fase crônica há casos de resistência ao MI descritos. Nesse contexto, potenciais novos fármacos são investigados para melhorar a eficiência da terapia da LMC. Nesse estudo, investigamos o efeito do veneno bruto (VB) e da enzima L-amino-ácido-oxidase (LAAO) da Bothrops pirajai em desencadear apoptose em células BCR-ABL+. A apoptose das células HL-60 e HL-60.BCR-ABL foi quantificada pela detecção da percentagem de células com núcleos hipodiplóides pela da citometria de fluxo e confirmada pela observação da ativação das caspases 3, 8 e 9 por western-blot. Os resultados obtidos indicam que a LAAO é capaz de induzir apoptose em células HL-60 e HL-60.BCR-ABL por ativação das vias extrínseca e intrínseca. Além disso, foi verificado que a LAAO diminui a fosforilação de BCR-ABL em células HL-60.BCR-ABL e quando associada ao MI potencializou a inibição da atividade quinase de BCR-ABL. Os dados da presente investigação indicaram ainda que a LAAO é capaz de modular a expressão de bad, bak, bax, bid, bimel, fas,fasl, a1, bcl-2, bcl-xl, bcl-w e c-flip, genes reguladores da apoptose celular. Apesar do pouco conhecimento acerca do mecanismo de ação dessa toxina, os dados obtidos sugerem que a LAAO possui o potencial de estimular a apoptose nas linhagens HL-60 e HL-60.BCR-ABL e aumentar o efeito do inibidor da atividade quinase, MI, dados relevantes para estudos futuros associados a descrição de novos fármacos contra leucemia mielóide crônica. / Chronic myeloid leukemia (CML) is a myeloproliferative disorder cytogenetically characterized by the presence of Philadelphia chromosome (Ph) and molecularly by bcr-abl1 neogene that encodes the BCR-ABL oncoprotein with high tyrosine kinase (TK) activity. The leukemic cell BCR-ABL+ presents poor adhesion to bone marrow stroma, resistance to apoptosis and exacerbated mitogenic potential. The CML has a three-phase course (chronic, accelerated and blastic phase) and its treatment can be performed by different therapeutic modalities, especially the imatinib mesylate (IM) that inhibits the TK BCR-ABL inducing high rates of cytogenetic remission in chronic phase. Although MI is effective, patients in accelerated and blastic phases of the disease are often refractory to this therapy and there are also cases of resistance to MI described in chronic phase. In this context, potential new drugs are investigated to improve the efficiency of the therapy of CML. In this study, we investigated the effect of crude venom (CV) and of the enzyme L-amino acid oxidase (LAAO) from Bothrops pirajai in triggering apoptosis in BCR-ABL+. The apoptosis of HL-60 cells and HL-60. BCR-ABL was quantified by detecting the percentage of cells with hypodiploid nuclei by flow cytometry and confirmed by observation of the activation of caspases 3, 8 and 9 by Western blot. The results indicate that LAAO is able to induce apoptosis in HL-60 cells and HL-60. BCR-ABL by activation of the extrinsic and intrinsic pathways. Furthermore, it was found that LAAO decreases phosphorylation of BCR-ABL in HL-60 cells. BCR-ABL when associated with MI potencialized the inhibition of kinase activity of BCR-ABL. The data from this study also indicated that the LAAO is able to modulate the expression of bad, bak, bax, bid, bimel, fas, FasL, A1, bcl-2, bcl-xl, bcl-w and c-flip, regulatory genes of apoptosis. Even though there is little knowledge about the mechanism of action of this toxin, the data obtained suggests that LAAO has the potential to stimulate apoptosis in HL-60 lines and HL-60. BCR-ABL and increase the effect of the inhibitor of protein kinase activity, MI, relevant data for future studies associated with the description of new drugs against chronic myeloid leukemia.

A leucemia mielóide crônica (LMC) é uma doença mieloproliferativa e sua patogênese está associada à expressão de um neogene, bcr-abl, que codifica uma proteína tirosina quinase Bcr-Abl. Esse trabalho tem como objetivos o estudo dos mecanismos envolvidos na resistência à morte das células Bcr-Abl positivas e a identificação de alterações gênicas nessas células. Dados de expressão gênica global obtidos por \"microarray\" mostraram uma superexpressão nas células HL-60.Bcr-Abl com relação a HL-60 dos genes faim e nipa, que foi confirmada por qRT-PCR em diferentes linhagens celulares Bcr-Abl positivas. Já os genes de trail e osm, apresentaram uma diminuição significativa em HL-60.Bcr-Abl, que foi confirmada para trail, porém osm não teve seu resultado validado. A avaliação da expressão dos genes em células de pacientes portadores de LMC, em diferentes fases da doença também foi estudada. Com esses resultados, o presente estudo visa a melhor compreensão de como alterações na expressão desses genes contribuem na fisiopatologia da LMC. / Chronic myelogenous leukemia (CML) is a stem cell disease characterized by the presence of the Bcr-Abl oncoprotein, which is the cause of the malignant transformation and the extreme resistance to apoptosis displayed by CML patients. Our aim was to analyze the alteration in global gene expression in Bcr-Abl expressing cells. Data obtained from microarray analysis showed significant up-regulation of nipa and faim in HL60.Bcr-Abl and down-regulation of osm and trail. These results were further confirmed by Real-Time PCR to nipa, faim and trail, but not for osm expression in HL-60.Bcr-Abl cells. To evaluate the potential of some of the modified genes as therapeutic targets or prognostic markers for CML, we also analyzed the expression of these genes in samples from CML patients.

Orientador: Fernando Ferreira Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-08T16:15:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alberto_FernandoLopes_D.pdf: 5633645 bytes, checksum: 7354434461195623d47c6efe24126229 (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: Câncer é o resultado de anomalias no genoma acumuladas ao longo do tempo e corresponde a doença genética mais freqüente na população humana. Os últimos anos têm presenciado enormes avanços tecnológicos que facilitaram o desenvolvimento de técnicas para análise em larga escala do conjunto dos genes expressos nos diferentes tecidos, sendo responsável pela explosão do conhecimento em medicina molecular. No presente trabalho avaliamos o transcriptoma da leucemia mielóide crônica através da técnica de ORESTES (Open Reading Frame Expressed Sequence Tags). As seqüências geradas foram agrupadas de acordo com sua homologia através do pacote de bioinformática Phrap. Essa estratégia aumentou o grau de cobertura genômica, já que as seqüências originais apresentavam tamanho máximo de 500 a 700 bases. Após a retirada dos contaminantes, obtivemos 2933 agrupamentos de seqüências (contigs) e 11568 seqüências isoladas. Cada contig representa um gene em potencial e o seu conjunto foi submetido a comparação com o banco de dados público nr para possibilitar a anotação e classificação funcional. Os agrupamentos ORESTES foram classificados em comunicação celular (19%); crescimento, desenvolvimento e manutenção celular (9%); metabolismo celular (30%); estrutura, motilidade e transporte celular (15%); função desconhecida (28%). Adicionalmente, estabelecemos o mapeamento cromossômico dos contigs obtidos, observando distribuição relativamente homogênea e proporcional representada em todos os cromossomos humanos. O mapeamento dos contigs gerados por ORESTES apresentou-se com padrão de distribuição semelhante ao observado por Venter e colaborasores, 2001. Comparamos o padrão de expressão obtido com o transcriptoma de medula óssea de paciente portador de anemia hemolítica hereditária (doença hematológica não neoplásica) gerado por SAGE (Serial Analysis of Gene Expression). Os genes encontrados foram ordenados de acordo com sua representatividade ou nível de expressão. Não houve correlação entre os padrões de expressão observados pos SAGE e por ORESTES. Do conjunto dos 100 genes mais representados nos ORESTES, dez foram selecionados para validação da expressão por PCR quantitativo em tempo real, utilizando o agente fluorescente SybrGreen I. Identificamos e confirmamos o aumento da expressão em nove genes na LMC. Destes, sete tinham aumento superior a 10 vezes o controle (CAMP, ABR, DEFA3, CSF3R, MLL2, S100A8 e MS4A3), com dois deles (DEFA3 e ABR) com aumento de cerca de 50 vezes ou mais. A análise funcional particularizada para cada um deste genes em LMC tem o potencial de identicar possíveis alvos para novas intervenções terapeuticas. O método mostrou-se poderoso para evidenciar e validar as diferenças de expressão gênica observadas pelas técnicas de seqüenciamento utilizadas anteriormente. Os dados deste trabalho constituem a primeira descrição do transcriptoma da leucemia mielóide crônica / Abstract: The complete collection of transcripts generated from the human genome cannot be predicted from the genome sequence, but should be directly determined for each tissue, due to variations of gene expression in different tissues and disease states, and because genes can encode multiple transcripts derived from alternate splicing and polyadenylation sites. As part of larger project that produced up to 1.2 million ORESTES (open reading frames expressed sequence tags) from different cancer tissues, we constructed a set of cDNAs obtained from bone marrow cells of patients with CML, that represented partial expressed gene sequences that are biased toward the central coding regions of the resulting transcripts (Dias-Neto E et al, Proc Nat Acad Sci USA 97:3491, 2000). The 27,361 ESTs were assembled into contigs using the Phrap package producing 2933 clusters containing 2 to 210 ESTs (leaving 11568 isolated sequences). Functional categories were attributed to the contigs on the basis of the annotation of the matched sequences in nr, into 5 major functional categories and 22 subcategories (cell communication (19%); cell growth, development and m contigs formed by the larger number of EST in bone marrow cells was co mpared with a control bone marrow sample obtained from a non-neoplastic hematologic condition (hereditary hemolytic anemia) and evaluated with SAGE (serial analysis of gene expression). Ten out of 100 most representative contigs had their expression data evaluated further by realtime quantitative PCR with Sybr Green I reagent, confirming the ORESTES data. Seven out of the 10 genes were more than 10-fold upregulated (CAMP, ABR, DEFA3, CSF3R, MLL2, S100A8 e MS4A3) and two additional genes were 50-fold or higher upregulated in CML (DEFA3 e ABR). The wealthy of information provided by this approach demonstrates its usefulness for the analysis of gene expression in specific hematopoietic tissues and diseases / Doutorado / Clinica Medica / Doutor em Clínica Médica

Orientadores: Katia Borgia Barbosa Pagnano, Afonso Celso Vigorito / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-14T18:14:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Machado_MelissaPereira_M.pdf: 1144638 bytes, checksum: c55a80d3cce151782b16b741b0f21149 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A leucemia mieloide crônica (LMC) e uma desordem mieloproliferativa caracterizada pela presença do cromossomo Philadelphia (Ph), resultado da fusão do gene abl e do gene bcr cujo produto e uma proteína de atividade de tirosina quinase, inibida pelo mesilato de imatinibe. O imatinibe e hoje o tratamento de primeira linha da LMC e o monitoramento molecular dos transcritos BCR-ABL e fundamental no acompanhamento dos pacientes e na detecção precoce da perda de resposta ao tratamento. O objetivo deste trabalho foi realizar a padronização do método de PCR quantitativo (RQPCR) para o monitoramento molecular dos transcritos BCR-ABL de pacientes com LMC em tratamento com imatinibe. Foram coletadas amostras de sangue periferico de pacientes com LMC para RQ-PCR ao diagnostico e a cada três meses apos o tratamento com imatinibe. Foi utilizado o método Taqman. Como gene controle foi utilizado o ABL. Foi criada uma curva standard com diluições de 108 a 103 de um plasmideo com os transcritos b3a2 e b2a2 e com ABL. As quantificações foram feitas em duplicatas, assim como a curva standard. O threshold utilizado foi de 0,05 e a eficiência foi determinada em 99%. Os resultados foram reportados como uma relação entre BCR-ABL/ABL. Para o valor de referencia basal do laboratório foram analisadas 30 amostras de pacientes ao diagnostico, e calculada a mediana, sendo esse valor 83,66%. Resposta molecular maior (RMM) foi definida como redução dos transcritos BCR-ABL em 3 log a partir do valor basal do laboratório. Os valores foram ajustados a escala internacional, usando-se um fator de conversão de 1.19. Apos a padronização do método, foram avaliados 60 pacientes com LMC, cujas amostras foram coletadas ao diagnostico e a cada 3 meses. Respostas hematológica, citogenetica maior e citogenetica completa foram obtidas em 57 (95%), 45 (75%) e 38 (63%) dos pacientes, respectivamente. Vinte e quatro de 60 pacientes atingiram a RMM (40%), numa mediana de 8,5 meses. A sobrevida global foi superior nos pacientes com RCC (100%) vs pacientes sem RCC (77%) em 48 meses. Pacientes com RCC e com RMM tiveram uma sobrevida livre de eventos superior em relação aos pacientes que não atingiram os dois tipos de reposta (100% vs 60% respectivamente) (p= 0.007). Em resumo, neste estudo demonstramos o impacto prognostico em atingir RCC e RMM e também a importância do acompanhamento molecular nos pacientes com LMC. / Abstract: Chronic myeloid leukemia (CML) is a myeloproliferative disorder characterized by the presence of Philadelphia chromosome (Ph), the result of bcr and abl gene fusion, which product is a protein with kinase activity, inhibited by imatinib. Imatinib is currently the first-line treatment of CML and molecular monitoring of BCRABL transcripts is essential in monitoring of patients and for the early detection of loss of response to treatment. The aim of this study was to standardize quantitative PCR (RQ-PCR) method for molecular monitoring of BCR-ABL transcripts in patients with CML treated with imatinib. Peripheral blood samples from chronic phase patients were collected for RQ-PCR at diagnosis and every three months after treatment with imatinib. Taqman method was used for RQ-PCR. A standard curve with dilutions of 108 to 103 of a plasmid with the b3a2 and b2a2 transcripts and ABL gene, used as the control gene, was constructed. The runs were made in duplicates. The threshold used was 0.05 and the efficiency was determined as 99%. The results were reported as a BCR-ABL/ABL ratio (%). For the reference value of the baseline of the laboratory 30 samples from patients at diagnosis were quantified and the median value calculated was 83.66%. Major molecular response (MMR) was considered a three log reduction from the baseline value. MMR values were adjusted to international scale, using a conversion factor of 1.19. After standardization, BCR-ABL levels of 60 CML patients in chronic phase treated with imatinib were measured at diagnosis and then every three months. Hematological, major cytogenetic and complete cytogenetic responses were achieved in 57 (95%), 45 (75%) and 38 (63%) patients, respectively. Twenty-four out of 60 patients achieved a MMR (40%), in a median time of 8.5 months. Overall survival was superior for patients with CCR (100%) versus patients with no CCR (77%) (p= 0.01) in 48 months. Patients with CCR and with MMR had a superior event free-survival (EFS) in comparison with patients with CCR and no MMR (p= 0.007). In conclusion, we could demonstrate the prognostic impact of achieving CCR and a major molecular response and also the importance of molecular monitoring in the follow-up of CML patients. / Mestrado / Ciencias Medicas / Mestre em Clinica Medica

A leucemia mielóide crônica (LMC) é uma doença mieloproliferativa clonal caracterizada pela presença do cromossomo Philadelphia e o oncogene BCR-ABL1. Este oncogene codifica a oncoproteína Bcr-Abl com atividade tirosina-quinase constitutiva. A proteína Bcr-Abl é responsável pela resistência das células leucêmicas a apoptose. Atualmente, os pacientes com LMC são tratados com os inibidores de tirosina-quinase - mesilato de imatinibe, dasatinibe e nilotinibe. Apesar de o tratamento ser eficiente, pacientes em fases avançadas e mesmo na fase crônica da doença, apresentam resistência à terapia. Desta forma, novos fármacos devem ser investigados para melhorar o tratamento da LMC. As L-aminoácido oxidases (LAAOs) têm sido descritas como substâncias citotóxicas e indutoras de apoptose. Assim, o principal objetivo do presente estudo foi investigar o potencial antitumoral da LAAO isolada da serpente Calloselasma rhodostoma (CR-LAAO) nas células Bcr-Abl positivas. Avaliou-se a citotoxicidade da CR-LAAO nas linhagens HL-60 (linhagem Bcr-Abl negativa), HL-60.Bcr-Abl, K562 e KCL22 (linhagens Bcr-Abl positivas) e nas células mononucleares (MNC) de sangue periférico de indivíduos saudáveis, na presença ou ausência da catalase. Para investigar os mecanismos da ação citotóxica da CR-LAAO, realizou-se os ensaios de indução de apoptose por meio da quantificação das percentagens de núcleos hipodiplóides e anexina V-FITC, nas linhagens celulares e nas células MNC de indivíduos saudáveis e pacientes com LMC. Avaliou-se também os níveis de expressão das caspases 3, 8 e 9, o potencial de membrana mitocondrial, danos no DNA e o efeito apoptótico da toxina combinada com os inibidores de tirosina-quinase nas linhagens Bcr-Abl positivas. Além disso, investigamos se a CR-LAAO foi capaz de modular a expressão dos apoptomiRs miR-15a, miR-16, miR-145, miR-26a, hsa-let-7d, miR-142-3p, miR-29c, miR-146a, miR-21, miR-130a e miR-130b, assim como das proteínas pro- e anti-apoptóticas Bak, Bax, Bid, Bim, A1, Bcl-2, c-Flip, Ciap-2 e Mcl-1 nas linhagens Bcr-Abl positivas. Nossos resultados mostraram que o efeito citotóxico da CR-LAAO foi mais potente nas linhagens Bcr-Abl positivas em relação às células MNC de indivíduos saudáveis, e está associado ao peróxido de hidrogênio produzido durante a reação enzimática da CR-LAAO. Demonstrou-se também que a CR-LAAO induziu apoptose nas linhagens Bcr-Abl postivas testadas e nas células MNC de pacientes com LMC na fase crônica da doença. Em todas as linhagens celulares detectou-se danos no DNA, perda do potencial de membrana e ativação das caspases 3, 8 e 9. A percentagem de apoptose aumentou quando as células HL-60.Bcr-Abl foram tratadas com a CR-LAAO combinada com os inibidores de tirosina-quinase. A CR-LAAO modulou a expressão dos apoptomiRs miR-15a, miR-16, miR-145, miR-26a, hsa-let-7d, miR-142-3p, miR-29c, miR-21, miR-130a e miR-130b e de possíveis proteínas alvos nas linhagens Bcr-Abl positivas. Sendo assim, os resultados obtidos sugerem que a CR-LAAO apresenta uma ação antitumoral capaz de destruir as células leucêmicas / Chronic myeloid leukemia (CML) is a clonal myeloproliferative disease characterized by the presence of Philadelphia chromosome and BCR-ABL1 oncogene. This oncogene encodes the Bcr-Abl tyrosine kinase (TK) which presents a constitutive activity. The Bcr-Abl is responsible for leukemic cells resistance to apoptosis. The CML patients are currently treated with tyrosine kinase inhibitors (TKI) - imatinib mesylate, dasatinib and nilotinib. Although TKI are efficient for CML treatment, patients in advanced phases and even in chronic phase of the disease present resistance to therapy. Thus, potential new drugs must be investigated to improve the CML treatment. The L-amino acid oxidases (LAAOs) have been described as cytotoxic and apoptosis-inducing substances. Here, we investigated the LAAO from Calloselasma rhodostoma (CR-LAAO) antitumoral potential against Bcr-Abl positive cells. We evaluated the CR-LAAO cytotoxic effect against HL-60 (Bcr-Abl negative cell line), HL-60.Bcr-Abl, K562, KCL22 (Bcr-Abl positive cell lines) and the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy subjects, in the presence or absence of catalase. To investigate the mechanisms underlying the CR-LAAO cytotoxic action, we performed the apoptosis induction assays through the hypodiploid nuclei and annexin-V quantification in the cell lines and PBMC from healthy subjects and CML patients. We also evaluated the levels of caspases 3, 8 and 9 expression, the mitochondrial membrane potential, DNA damage and the apoptotic effect of CR-LAAO combined with TKI on Bcr-Abl positive cells. In addition we investigated if CR-LAAO was capable of modulating the apoptomiRs miR-15a, miR-16, miR-29c, hsa-let-7d, miR-145, miR-146a, miR-21, miR-130a, miR-130b, miR-142-3p and miR-26a, the pro- and anti-apoptotic proteins (Bak, Bax, Bid, Bim, A1, Bcl-2, c-Flip, Ciap-2 and Mcl-1 expression in HL-60, HL-60.Bcr-Abl, K562 and KCL22 cells. Our results showed that the CR-LAAO cytotoxic effect was more potent in Bcr-Abl positive cell lines than in PBMC from healthy subjects and it is linked to hydrogen peroxide produced during the enzymatic action of CR-LAAO. It was also demonstrated that CR-LAAO was capable of inducing apoptosis in Bcr-Abl positive cell lines and CML patient\'s cells in chronic phase of the disease. In all tested cell lines, the loss of mitochondrial membrane potential, DNA damage and caspases 3, 8 and 9 activation were detected. The apoptosis percentage was improved when HL-60.Bcr-Abl cells were treated with CR-LAAO combined with TKI. The CR-LAAO modulated the apoptomiRs miR-15a, miR-16, miR-145, miR-26a, hsa-let-7d, miR-142-3p, miR-29c, miR-21, miR-130a and miR-130b expression as well the predict target proteins levels on Bcr-Abl positive cells. Thus, our results suggest that CR-LAAO presents an antitumoral action capable of destroying the CML cells.

INTRODUÇÃO: O impacto do aumento de expressão do fator de crescimento endotelial no curso da Leucemia Mielóide Crônica (LMC) ainda é desconhecido, porém há relatos de que estes pacientes apresentam maior densidade vascular em medula óssea do que em indivíduos saudáveis, principalmente em crise blástica. Outro fator recentemente associado ao aumento da angiogênese é a expressão anormal da proteína hsecurina, que, por sua vez, inibi uma protease denominada separase, responsável pela separação das cromátides irmãs durante a anáfase da mitose. Por esses motivos, quantificamos células endoteliais circulantes e VEGF em portadores de LMC como marcador de angiogênese e expressão do gene hsecurina. MÉTODOS: Realizamos análise prospectiva e consecutiva de uma coorte de 31 pacientes com LMC em fase crônica ao diagnóstico, 23 em crise blástica, 30 em fase acelerada, atendidos no ambulatório de Hematologia da FMUSP e 50 indivíduos saudáveis, doadores de plaquetas por aférese, para quantificação da porcentagem de células endoteliais circulantes e subtipos pelo método de citometria de fluxo no laboratório de Imunopatologia HC/FMUSP. Desta coorte 25 pacientes em fase crônica, 14 em crise blástica, 26 em fase acelerada e 32 indivíduos saudáveis foram analisados para os genes hsecurina e VEGF por PCR quantitativo em tempo real. RESULTADOS: A mediana da porcentagem das células endoteliais circulantes foi de 0, 0146% em LMC em crise blástica e 0,0059% no grupo controle, p < 0,01 às custas das células endoteliais maduras (p < 0,01). A mediana de células endoteliais circulantes em crise blástica foi de 0, 0146%, superior à da fase acelerada (0,0059%), p < 0,01 com predomínio de células endoteliais maduras (p < 0,01). Em relação à expressão do gene VEGF observamos aumento estatisticamente significativo nas fases crônica (p < 0,01), acelerada (p < 0,01) e crise blástica (p = 0,04). Encontramos aumento significativo da expressão do gene hsecurina na crise blástica da doença, com mediana de 0,390 em relação aos grupos controle com mediana de 0,125 (p < 0,01) e fase acelerada, com mediana de 0,230 (p = 0,04). Os pacientes na fase crônica da doença apresentaram mediana de 0,260 e p = 0,03 quando comparados com o grupo controle. CONCLUSÃO: Observamos neste estudo que a quantificação de CEC é uma ferramenta útil para predizer e identificar precocemente a progressão da LMC para fase blástica, diferentemente da variável VEGF que foi elevado em todas as fases da doença. A expressão do gene hSecurina na fase crônica da doença foi significantemente alta, demonstrando provável relação com a elevação da taxa de proliferação celular. Entretanto, estudos complementares do gene hSecurina deverão ser realizados na crise blástica da LMC, para entendermos com precisão o real significado nesta fase da doença. / INTRODUCTION: The impact of the increased expression of vascular endothelial growth factor in the course of chronic myeloid leukemia (CML) is still unknown, but there are reports that those patients have higher vascular density in bone marrow than healthy individuals, particularly in blast crisis. Another factor recently associated with increased angiogenesis is the abnormal expression of protein hSecurin, which, in turn, inhibits a protease called separase, responsible for the separation of sister chromatids during the anaphase of mitosis. For these reasons, we quantified circulating endothelial cells and VEGF in patients with CML as a marker of angiogenesis and hSecurin gene expression. METHODS: We performed a prospective analysis of consecutive cases in a cohort of 31 patients with CML in chronic phase at diagnosis, 23 in blast crisis, 30 in accelerated phase who attended the outpatient Hematology FMUSP ward, and 50 healthy subjects, platelet apheresis donors, for quantification of the percentage of circulating endothelial cells and subtypes through the flow cytometry method, at HC/FMUSP Immunopathology laboratory. In this cohort, 25 patients in chronic phase, 14 in blast crisis, 26 in accelerated phase, and 32 healthy subjects were tested for the genes VEGF and hSecurin by quantitative real-time PCR. RESULTS: The median percentage of circulating endothelial cells was 0.0146% in CML in blast crisis and 0.0059% in the control group, p <0.01 at the expense of mature endothelial cells (p <0.01). The median circulating endothelial cells in blast crisis was 0.0146% higher than in accelerated phase (0.0059%), p <0.01 with predominance of mature endothelial cells (p <0.01). Regarding the expression of the VEGF gene, a statistically significant increase was observed in chronic phase (p <0.01), accelerated (p <0.01) and blast crisis (p = 0.04). We found a significant increase in hSecurin gene expression in blast crisis disease, with a median of 0.390 compared to control groups, with a median of 0.125 (p <0.01) and accelerated phase, with a median of 0.230 (p = 0.04). Patients with chronic disease had a median of 0.260 and p = 0.03 compared with the control group. CONCLUSION: In this study, we observed that the quantification of CPB is a useful tool to predict and identify the early progression of CML to blast phase, unlike the VEGF variable, which was elevated in all stages of the disease. The expression of hSecurin gene in chronic phase was significantly higher, demonstrating a likely relationship with the increased cell proliferation rate. However, further studies of hSecurin gene should be made in the blastic crisis of CML to understand precisely the real meaning at this stage of the disease.

As leucemias cromossomo Ph-positivas estão intimamente associadas à expressão da tirosina-quinase Bcr-Abl. Esta oncoproteína promove independência de fatores de crescimento, alterações na adesão e inibição da apoptose por mecanismos ainda não totalmente elucidados. O objetivo desse estudo foi avaliar a contribuição da atividade quinase de Bcr-Abl para seu potencial anti-apoptótico e identificar alterações moleculares envolvidas na transformação celular induzida por essa proteína. Nossos resultados sugerem que a resistência à apoptose não depende da manutenção constante da atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl, tampouco da presença de proteínas fosforiladas em tirosina. A comparação do proteoma de células HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl revelou que a presença de Bcr-Abl causa alterações profundas no padrão de expressão protéica. As proteínas afetadas estão associadas a diversos processos celulares, como adesão, transdução de sinais, proliferação e morte celular. Esses achados devem contribuir para a identificação de novos marcadores de prognóstico e alvos terapêuticos. / Ph chromosome-positive leukemias are closely associated with the expression of Bcr-Abl tyrosine kinase. This oncoprotein promotes growth factor independence, alters cell adhesion and confers resistance to apoptosis by mechanisms that are not fully understood. The aim of this study was to evaluate the contribution of Bcr-Abl kinase activity for its antiapoptotic potential and identify molecular alterations involved in Bcr-Abl-induced cell malignant transformation. Our results suggest that Bcr-Abl is not required to be constantly active to maintain the resistance to apoptosis and pY-containing proteins may not be responsible for the antiapoptotic effect of Bcr-Abl. The comparison between the proteome of HL-60.vector and HL-60.Bcr-Abl cells revealed that the presence of Bcr-Abl alters the expression of a great variety of proteins. The affected molecules are associated with several cellular processes, including cell adhesion, signal transduction, proliferation and cell death. Our findings might help the identification of new prognostic markers and therapeutic targets.