La enfermedad de Chagas es una patología endémica de América causada por el parásito Trypanosoma cruzi. Si bien esta enfermedad compromete la salud de millones de personas a nivel mundial, carece de tratamientos efectivos en su etapa crónica y se encuentra catalogada como una enfermedad tropical desatendida. Esta tesis se inscribe en un esfuerzo por desarrollar nuevos fármacos inhibidores de TcMIP (Potenciador de Infectividad Macrófaga de Trypanosoma cruzi), un factor de virulencia del parásito recientemente identificado como blanco terapéutico. TcMIP es una prolil cis/trans isomerasa de la familia de las FKBPs (FK506 binding proteins, por sus siglas en inglés) que participa en la transmigración del parásito por un mecanismo aún desconocido. No obstante, los ensayos de inhibición con fármacos no específicos de la familia de las FKBPs han demostrado que la inhibición de TcMIP reduce fuertemente la capacidad del parásito de infectar las células del huésped. En esta tesis se ha desarrollado un estudio de cribado molecular por RMN (Resonancia Magnética Nuclear) empleando diferentes experimentos, como STD, waterLOGSY y CSP por 1H-15N HSQC para evaluar la afinidad entre TcMIP y moléculas seleccionadas basadas en inhibidores conocidos de proteínas de la misma familia de TcMIP y en modelamiento computacional. Se encontraron nueve moléculas que presentan interacción con TcMIP, tres de las cuales son productos naturales. De esta manera, este estudio supone un primer paso en el diseño de fármacos inhibidores de TcMIP.

La evaluación de los síntomas de la enfermedad de Parkinson tiene un carácter subjetivo ya que se basa en la experiencia y la agudeza visual del médico tratante, quién realiza una puntuación de 0 a 4 según la Escala Unificada para la Evaluación de la Enfermedad de Parkinson Patrocinada por la Sociedad de Trastornos del Movimiento (MDS-UPDRS, por sus siglas en inglés). El presente trabajo de tesis tiene como objetivo evaluar dos algoritmos de flujo óptico y segmentación de imágenes para cuantificar el golpeteo de dedos y movimiento con las manos, basado en la MDS-UPDRS. El punto de partida para cumplir este objetivo fue el diseño de un protocolo de adquisición de videos, el cual se implementó con 30 participantes sanos que realizaron tres secuencias de cada movimiento. Posteriormente, se realizó el procesamiento de datos con los algoritmos propuestos y se obtuvieron las señales de frecuencia y amplitud. Finalmente se hizo el análisis estadístico. Los resultados muestran que los algoritmos fueron codificados con éxito y se apreciaron los cambios de amplitud y frecuencia de los movimientos repetitivos. Finalmente, se discutieron los resultados basándose en mejoras enfocadas en el protocolo de adquisición de datos que permitan su implementación en un ambiente clínico para contribuir al diagnóstico de pacientes que padecen párkinson.

La estructura de poder y la dinámica que trasciende al sistema internacional vienen atravesando una serie de cambios en las últimas décadas. El surgimiento de la República Popular China como el nuevo protagonista del sistema internacional en medio de una pugna por el poder con Estados Unidos, alimentada por la estrategia de política exterior del actual mandatario Xi Jinping, ha generado una nueva forma de actuación en el multilateralismo, principal espacio para la toma de liderazgo y participación de las potencias. Como tal, instancias como los organismos internacionales se vuelven espacios clave para reflejar los cambios en la dinámica de poder. Actualmente uno de los organismos que se ha visto duramente cuestionado por el control y las investigaciones correspondientes al origen de la pandemia de la COVID-19 es la Organización Mundial de la Salud (OMS), dando pie al surgimiento de conspiraciones sobre un supuesto favorecimiento de este organismo hacia China, quien se consolidaría dentro de este con un rol predominante. Considerando que los organismos internacionales reflejan la estructura de poder del sistema internacional, investigar el hecho de que China cuente con mayores capacidades de influencia dentro de la OMS resulta de suma importancia para demostrar el considerable avance y el nuevo papel que ha asumido en el multilateralismo. Asimismo, es relevante profundizar el estudio en el ámbito de la salud, como un nuevo espacio a través del cual los Estados buscan expandir su influencia frente a la actual revalorización de los sistemas de salud a nivel global. A partir de ello, este trabajo buscará explicar cuáles son aquellos factores que han permitido consolidar el protagonismo de China dentro de la OMS en la última década, como parte de su mayor presencia en el multilateralismo en miras a consolidarse como gran potencia.

En el año 2020 el mundo se enfrentó a circunstancias y situaciones imprevistas a consecuencia del brote del COVID-19, cuyo impacto generó la necesidad de plantear alternativas o revisar aquellas que estuvieran disponibles para afrontar la ocurrencia de eventos de tal magnitud. En ese contexto, uno de los sectores con mayores impactos a consecuencia de la pandemia fue el sector construcción, cuyos actores, esto es propietarios o clientes y contratistas tuvieron que encontrar la manera de salvaguardar sus contratos y conservarlos con la finalidad de cumplir con el objeto inicial y fundamental; la ejecución eficiente de la obra y el pago de la contraprestación ante un evento de la magnitud del COVID-19, sin precedentes, irresistible y extraordinario. Es así que, las partes contratantes recurrieron a sus propios contratos en búsqueda de alternativas de mitigación, y es el caso que, no encontraron una respuesta adecuada. Ante ello, en el presente trabajo de investigación surge de la necesidad de las partes de continuar con el contrato en un contexto favorable para ambas. Para lo cual se analiza, mediante el enfoque de riesgos legales, si las herramientas previstas en nuestro Código Civil peruano constituyen las herramientas idóneas que permitan a los intervinientes de un contrato de construcción mitigar de manera eficiente los impactos que un evento de tal magnitud pueda generar sobre este, y, por lo tanto, si con su aplicación se logra la conservación del contrato con los menores costos posibles para las partes.

El contexto de pandemia por la COVID-19 ha sido un evento altamente estresante que ha impactado negativamente a buena parte de la población peruana; por ello es importante incrementar el conocimiento de este evento potencialmente traumático. La presente investigación tuvo como objetivo examinar la relación entre las estrategias de afrontamiento, la sintomatología de estrés postraumático (TEPT) y el crecimiento postraumático (CPT) en 116 adultos residentes en el Perú durante la COVID-19, con edades entre los 18 y 60 años de edad (M= 31.71; DE= 12.15). Se utilizó el Inventario de Estimación de Afrontamiento COPE (Carver et al., 1989), la Escala del Impacto del Estresor - Revisada (Weiss & Marmar, 1997), y la Escala de Crecimiento Postraumático (Tedeschi & Calhoun, 1996). Acorde al objetivo general, se encontró una asociación directa entre las estrategias caracterizadas por la evitación y el TEPT, mientras que las respuestas dirigidas a enfrentar el estresor se vincularon al CPT. Se realizaron análisis de regresión para el TEPT encontrando el rol predictivo de las estrategias de enfocar y liberar emociones, negación y desentendimiento mental (R² =.34, p< .001). Por último, se evidenciaron diferencias según ciertas variables sociodemográficas (sexo, edad, estado civil) y otras relacionadas a la COVID-19. Se discuten los hallazgos, así como las limitaciones del estudio y futuras líneas a seguir. / The COVID-19 pandemic had been a highly stressful event that has negatively impacted peruvian population. For this reason, it’s important to increase the knowledge of this traumatic event. This research aimed to analyze the association between coping strategies, posttraumatic stress disorder symptoms (PTSD), and posttraumatic growth (PTG) in 116 adults from 18 to 60 years (M= 31.71; DE=12.15) that reside in Peru during the COVID-19 pandemic. The COPE Inventory (Carver et al., 1989), Impact of Event Scale-Revised (IES-R) (Weiss & Marmar, 1997) and the Posttraumatic Growth Inventory (Tedeschi & Calhoun, 1996) were used for the measurement. According to the general objective, results show a direct association between avoidant strategies and PTSD, whereas responses oriented to confront the event were linked to PTG. Furthermore, regression analyses were performed finding the predictive role of coping strategies of focus and release emotions, denial and mental disengagement in PTSD (R² =.34, p< .001). Finally, differences were found according to certain sociodemographic variables (sex, age, marital status) and others related to COVID-19. The possible explanations of these findings are discussed, as well as the limitations of the study and future lines to be followed.

Las tecnologías que se basan en Inteligencia Artificial (IA) brindan un gran beneficio a la humanidad, mediante la automatización de tareas con una notable eficiencia y precisión. Por ende, la presente revisión sistemática de la literatura tiene como objetivo examinar e identificar técnicas, plataformas y metodologías de las investigaciones donde se aplique la IA en el tratamiento de la enfermedad del Alzheimer. Para ello, se utilizó la metodología propuesta por Barbara Kitchenham, teniendo como resultado para el análisis, veintiocho estudios seleccionados de la búsqueda en tres bases de datos multidisciplinarias. Dentro de la revisión se identificaron una gran variedad de técnicas de IA, en donde las máquinas de soporte vectorial demostraron su popularidad dentro de las investigaciones con este enfoque. Además, se evidenció a China y Estados Unidos como los países que generan mayores contribuciones a lo largo de los últimos 5 años, mediante el desarrollo de clasificadores y sistemas de detección temprana. Como conclusión de esta revisión, se puede afirmar que la IA tiene un gran potencial de innovación dentro del campo de la medicina, permitiendo mejorar la calidad de vida frente al rápido envejecimiento de la población.

En el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer con tomografía por emisión de positrones (PET), la principal problemática radica en el uso de radioisótopos tradicionales (18F, 11C) los cuales limitan el correcto desempeño de los agentes de imagen PET sobre las placas Aβ-amiloides. El [11C]-PIB, el [18F]-florbetapir y el [18F]-florbetaben representan algunos ejemplos de lo mencionado. Actualmente, los complejos quelatos de radioisótopos de metales de transición prometen ser una tentadora y potencial solución para tal problemática. De este grupo destacan los quelatos radiomarcados con 64Cu y compatibles con las placas Aβ. Sin embargo, la gran mayoría de estos casos todavía no son del todo exitosos. Por esta razón, y en base a las nuevas necesidades, se propone un nuevo complejo de cobre(II) basado en un ligando con grupos afines a las placas Aβ-amiloides cuya formación involucra cuatro etapas sintéticas. La formación del nuevo complejo se basa en la aplicación del efecto template o “plantilla” por parte del cobre(II); de esta manera, se logra producir un producto de alta pureza y con un rendimiento de 92 %. En base a los resultados de la caracterización por espectroscopías FT-IR, UV-VIS y de fluorescencia, y espectrometría ESI-MS, se concluye que el nuevo complejo de cobre(II) presenta una estructura del tipo quelato, cuyo centro metálico es probablemente tetracoordinado, con geometría cuadrada plana dada por los átomos dadores (N,N,O,O) de un ligando tipo base de Schiff simétrico y derivatizado con restos de benzotiazol con potencial capacidad de afinidad sobre las placas Aβ-amiloides. De esta manera y en base a la nueva propuesta química, se podría establecer un futuro radiomarcador “PET” de interés para el diagnóstico del Alzheimer. / In the diagnosis of Alzheimer’s disease with positron emission tomography (PET), the main problem lies in the use of traditional radioisotopes (18F, 11C) which limit the correct performance of imaging agents PET on Aβ-amyloid plaques. [11C]-PIB, [18F]-florbetapir and [18F]-florbetaben represent some examples of the above. Currently, complex chelates of transition metal radioisotopes show promise as a potential solution to this problem. In this group, the chelates radiolabelled with 64Cu and compatible with the Aβ plaques stand out. However, the majority of them are still not entirely successful. For this reason, and based on the current demands, a novel copper(II) complex with a ligand based on the same groups that have showed affinity for the Aβ-amyloid plaques have been synthesized in four synthetic steps. The formation of this complex is based on the application of the template effect by copper(II) to produce a compound of high purity and with a yield of 92 %. Based on the results of the characterization by FT-IR, UV-VIS and fluorescence spectroscopy and ESI-MS spectrometry, we can conclude that the new copper(II) complex has a chelate type structure, whose metal center is likely tetracoordinated showing a flat square geometry imposed by the donor atoms (N,N,O,O) of a symmetric Schiff base ligand derivatized with benzothiazole residues, with potential affinity for Aβ-amyloid plaques. Therefore, we propose this compound could be a future possible “PET” radioagent for the diagnosis of Alzheimer's disease. / Tesis

El cuidado espiritual al familiar del recién nacido crítico, constituye un pilar fundamental en el ámbito de enfermería, ya que cuando el recién nacido se encuentra en una incubadora a causa de una enfermedad grave, se convierte en una situación de dolor y sufrimiento para el familiar, principalmente la madre, siendo uno de los mayores miedos la muerte de su bebé, de esta manera afloran necesidades espirituales para enfrentar tal situación. Por lo tanto, el cuidado brindado por el profesional de enfermería debe abarcar todas las dimensiones de la persona; tanto física, psicológica y espiritual; sin embargo, esta última es poco estudiada y desarrollada. Ante ello, se planteó como objetivos: Describir y comprender el cuidado espiritual al familiar del recién nacido crítico en un hospital local de Chiclayo, 2019. Se utilizó la metodología cualitativa exploratoria descriptiva; la muestra fue no probabilística y el tamaño se determinó por la técnica de saturación y redundancia, siendo los sujetos de estudio las madres que tienen a sus hijos hospitalizados en la Unidad de Cuidados Intensivos Neonatales, y las enfermeras, esto permitió triangular la información; además los datos se recolectaron a través de la entrevista semiestructurada a profundidad, para luego ser procesados mediante el análisis de contenido. En el desarrollo de la investigación se consideró los principios éticos y criterios de rigor científico. Como resultados surgieron 3 categorías: Valoración y respeto por credo religioso, creencias y prácticas religiosas que favorecen el cuidado espiritual y apoyo espiritual en el duelo anticipado. Se concluye que las enfermeras neonatólogas enfocan su cuidado no sólo al neonato crítico sino también al familiar cultivando el aspecto espiritual; en este sentido, fortalece la fe a través de recursos espirituales y/o religiosos para que afronten el sufrimiento ante la hospitalización prolongada y/o la muerte de su hijo.

La enfermedad de Parkinson (PD) es un desorden progresivo del movimiento y es la segunda enfermedad relacionada con la edad más común, luego de la enfermedad de Alzheimer. Se la considera como un desorden multifactorial y complejo que involucra tanto factores epidemiológicos como genéticos y toxicológicos, y cuya principal característica es la pérdida progresiva de las neuronas dopaminérgicas. A pesar de los recientes avances que intentan comprender las bases moleculares de esta patología, el mecanismo exacto que desencadena la degeneración de las neuronas dopaminérgicas todavía no se conoce. Numerosos estudios previos destacan dos características comunes de las lesiones de la substancia nigra pars compacta de los cerebros con PD: i) alteraciones en el contenido de los metales de transición y, en consecuencia, aumento del estrés oxidativo (OS) y ii) sobreexpresión y agregación patológica de la proteína α-sinucleína (α-sin). El desbalance en los niveles de los metales de transición ha sido reportado como uno de los principales factores que contribuyen a la degeneración de las neuronas dopaminérgicas en la PD. Específicamente, se ha descripto que la sobrecarga de hierro (Fe) y la desregulación de los niveles de cobre (Cu) estarían involucradas en el daño de las neuronas dopaminérgicas en esta patología. En la primera parte de este trabajo de tesis, nuestro objetivo fue caracterizar los mecanismos de reparación de membrana mediante el estudio de las reacciones de acilación y deacilación y su rol en la injuria oxidativa en la neuronas dopaminérgicas N27 expuestas a sobrecarga de Fe y suplementación con Cu. Las neuronas N27 incubadas en presencia de Fe2+ (1 mM) por 24 hs mostraron elevados niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS), peroxidación lipídica y aumentada permeabilidad de membrana plasmática. Por otro lado, en las neuronas que fueron suplementadas con Cu2+ (10,50 μM) no se observaron alteraciones en los marcadores de OS. Se observó un perfil de acilación diferencial en las neuronas N27 premarcadas con [3H]ácido araquidónico (AA) o [3H]ácido oleico (OA). En las neuronas expuestas a Fe2+, la incorporación de AA aumentó en la fracción de triacilglicéridos (TAG), mientras que su incorporación en la fracción de fosfolípidos (PL) se vio disminuida. El contenido de TAG resultó más elevado (40 %) en las neuronas expuestas a Fe2+ que en los controles. Este aumento fue acompañado por la aparición de cuerpos lipídicos Nile Red positivos. En contraposición, la incorporación de OA se vio incrementada en la fracción de PL y no mostró cambios en los TAG. El perfil de acilación lipídica en las neuronas que fueron suplementadas con Cu mostró una mayor acumulación de AA en el PL fosfatidilserina y ningún cambio con respecto a su incorporación en TAG. La inhibición de las reacciones de acilación/deacilación desencadenaron un aumento en los niveles de los marcadores de OS y disfuncionalidad mitocondrial en las neuronas expuestas a sobrecarga de Fe2+. Estos hallazgos brindan evidencia acerca de la participación de los mecanismos de acilación frente a la injuria oxidativa inducida por Fe2+ y postulan que las neuronas dopaminérgicas preservan, inteligentemente, el AA en los TAG en respuesta al OS. Como se mencionó anteriormente, la sobreexpresión patológica de la α-sin está involucrada en la muerte de las neuronas dopaminérgicas en la PD. En la segunda parte de este trabajo, caracterizamos el rol de dos variantes de la α-sin, WT (en su forma nativa) y A53T (una mutación que se encuentra en la PD familiar de aparición temprana), durante el OS inducido por Fe2+ y estudiamos como el metabolismo lipídico estaría involucrado en el destino neuronal. Para ello, utilizamos la línea celular neuronal dopaminérgica N27 sin transfectar (UT) y dos líneas celulares N27 transfectadas de forma estable con WT-α-sin (WT) o A53T-α-sin (A53T). Estas células fueron expuestas a daño inducido por Fe2+ y luego, se analizaron los marcadores de OS y el estado del metabolismo lipídico. Dependiendo del tipo de α-sin expresado, se obtuvieron distintas respuestas neuronales a la sobrecarga de Fe2+. Las células A53T expuestas a injuria inducida por Fe2+ mostraron menores niveles de ROS y menor alteración en la permeabilidad de la membrana plasmática respecto a las neuronas WT. La presencia de A53T-α-sin provocó un aumento en el contenido de TAG, el cual fue aún mayor luego de la exposición de las neuronas a sobrecarga de Fe2+. Por otro lado, las neuronas WT no mostraron alteraciones en el contenido de TAG, respecto a las células UT. Las neuronas A53T también presentaron un aumento en la expresión de la sintasa de ácidos grasos (FAS), junto con una mayor resistencia a la cerulenina, un potente inhibidor de la FAS. El contenido de PL y colesterol (Chol) fue similar en las neuronas UT, WT y A53T. La inhibición farmacológica de la síntesis de novo de los TAG provocó un aumento en la muerte celular de las células A53T durante el daño inducido por Fe2+ mientras que la inhibición de los mecanismos de acilación/deacilación no afectaron ni el contenido de TAG ni la viabilidad celular en la medida en que se afectaron estos parámetros en las células UT. Nuestros resultados brindan nueva evidencia acerca del rol diferencial de las variantes de α-sin en el metabolismo lipídico neuronal, que está relacionado a la respuesta neuronal a la sobrecarga de Fe2+. En conclusión, hemos demostrado que la respuesta neuronal al daño oxidativo y a la sobreexpresión de A53T-α-sin, es dependiente de los mecanismos de acilación/deacilación lipídica e involucra acumulación de TAG. Aunque la inhibición de la síntesis de TAG en las neuronas A53T promueva la muerte celular, nuestros resultados sugieren que la aparición de TAG, algo inusual para el fenotipo neuronal, podría constituir un marcador temprano de daño neuronal. / Parkinson’s disease (PD) is a progressive movement disorder and is the second most common age-related neurodegenerative illness after Alzheimer’s disease. PD is a multifactorial and complex disorder including epidemiological, genetic and toxicological factors whose main characteristic is the progressive loss of dopaminergic neurons. Despite all the effort to understand the molecular basis of this pathology, the exact molecular mechanism that triggers the degeneration of dopaminergic neurons remains still unknown. Cumulative evidence highlights two common facts that occur in the substantia nigra pars compacta lesions in the brain of PD patients: i) alterations in transition metal content and, in consequence, increased oxidative stress (OS) and ii) overexpression and pathological aggregation of the protein α-synuclein (α-syn). Metal-imbalance has been reported as one of the main contributing factor for the degeneration of dopaminergic neurons in PD. Specifically, iron (Fe) overload and copper (Cu) mis-compartmentalization have been reported to be involved in the injury of dopaminergic neurons in this pathology. In the first part of this work, our aim was to characterize the mechanisms of membrane repair by studying lipid acylation and deacylation reactions and their role in oxidative injury in N27 dopaminergic neurons exposed to Fe-overload and Cu-supplementation. N27 dopaminergic neurons incubated with Fe2+ (1 mM) for 24 hs displayed increased levels of reactive oxygen species (ROS), lipid peroxidation and elevated plasma membrane permeability. Cu2+-supplemented neurons (10, 50 μM) showed no evidence of OS markers. A different lipid acylation profile was observed in N27 neurons pre-labeled with [3H]arachidonic acid (AA) or [3H]oleic acid (OA). In Fe-exposed neurons, AA uptake was increased in triacylglycerols (TAG) whereas its incorporation into the phospholipid (PL) fraction was diminished. TAG content was 40 % higher in Feexposed neurons than in controls. This increase was accompanied by the appearance of Nile red positive lipid bodies. Contrariwise, OA incorporation increased in the PL fractions and showed no changes in TAG. Lipid acylation profile in Cu-supplemented neurons showed AA accumulation into phosphatidylserine and no changes in TAG. The inhibition of deacylation/acylation reactions prompted an increase in OS markers and mitochondrial dysfunction in Fe-overloaded neurons. These findings provide evidence about the participation of lipid acylation mechanisms against Fe-induced oxidative injury and postulate that dopaminergic neurons cleverly preserve AA in TAG in response to OS. As previously mentioned, pathological α-syn overexpression is involved in the death of dopaminergic neurons in PD. In the second part of this work, we characterized the role of α-syn variants, Wild Type (WT) and A53T (a dominant mutation found in familial early onset PD) during Fe-induced OS and investigated whether lipid metabolism has implications for neuronal fate. To this end, we used the N27 dopaminergic neuronal cell line non-transfected (UT) and two stably transfected N27 cell lines with WT α-syn (WT) or mutated A53T α-syn (A53T). Cells were exposed to Fe-induced injury and OS markers and the status of lipid metabolism were analyzed. Neuronal response to Fe-induced overload is dependent on the type of α-syn expressed. A53T cells exposed to Fe-induced injury showed lower ROS levels and diminished plasma membrane permeability alteration than WT neurons. The presence of A53T α-syn promoted an increase in TAG content that was enhanced during Fe-induced OS. On the contrary, WT neurons did not display changes in TAG levels with respect to UT cells. A53T neurons also exhibited an increase in fatty acid synthase (FAS) expression, and higher resistance to the potent FAS inhibitor cerulenin. PL and cholesterol (Chol) content were similar in UT, WT and A53T neurons. Pharmacological inhibition of de novo synthesis of TAG increased A53T cell death during Fe-induced injury whereas the blockage of PL and Chol acylation/deacylation affected neither TAG content nor cell viability to the same extent as that observed in UT neurons. Our results bring new evidence about a differential role of α-syn variants on neuronal lipid metabolism that is related to the neuronal response to Fe-overload. In conclusion, we have demonstrated that the neuronal response to OS injury and A53T α-syn overexpression is dependent on lipid acylation and deacylation mechanisms and also involves TAG accumulation. Even though the inhibition of TAG synthesis in A53T neurons promoted cell death, our findings suggest that TAG appearance, rather unusual for the neuronal phenotype, could constitute an early marker of neuronal injury.

Dentro de la superfamilia de los canales iónicos activados por ligando (LGIC) se encuentra la familia de los receptores Cys-loop que incluye a canales catiónicos, como los receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs) y los receptores 5-HT3 de serotonina; y canales aniónicos, como los activados por GABA (GABAA) y glicina. Estos receptores revisten importancia tanto en la fisiología normal como así también en diversas y muy variadas patologías, entre las que se pueden mencionar las enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer (EA). Este hecho los posiciona como blancos moleculares importantes para el desarrollo de nuevos fármacos, y es por esto que el conocimiento de su función y modulación resulta un aspecto clave. Los receptores Cys-loop son proteínas transmembrana, por lo que su función se encuentra condicionada por su entorno lipídico y estímulos propios de la membrana celular, además de por distintos estímulos o factores externos a ella. Están formados por 5 subunidades organizadas pseudo-simétricamente alrededor de un poro o canal central. En estos receptores pueden distinguirse un dominio extracelular (ECD, del inglés extracellular domain), donde se encuentran los sitios de unión al agonista y/o antagonistas, un dominio transmembrana (TMD, del inglés transmembrane domain), que contiene el canal iónico y que se encuentra en extenso contacto con los lípidos de la membrana, y un dominio pequeño intracelular (ICD, del inglés intracellular domain), que contiene distintos sitios de regulación y señalización intracelular. En esta Tesis Doctoral se profundizó en el estudio de la función y modulación de 2 receptores de neurotransmisores pertenecientes a los receptores Cys-loop: los nAChRs, muscular y α7 neuronal, y los receptores 5-HT3. En el capítulo I se estudió la modulación del nAChR muscular por el entorno lipídico de la membrana en la que se encuentra. Se hizo foco especialmente en el colesterol (Col), lípido clave para el correcto funcionamiento del nAChR y que presenta distintas asimetrías laterales y transmembrana en diferentes momentos de la vida y en condiciones de salud o enfermedad. Se trabajó con distintos sistemas modelo: vesículas unilamelares grandes (LUVs), vesículas unilamelares gigantes (GUVs), membranas ricas en nAChR de T. californica o células BOCSC 23 expresando heterologamente el nAChR muscular. A cada uno se le realizaron distintos tratamientos para modificar las condiciones de Col con el fin de obtener sistemas que presenten: i) un aumento del contenido de Col, ii) un aumento de esteroles en la hemicapa externa (por agregado de colesterol hemisuccinato (CHEMS)), o iii) transformación de parte del Col a colestenona (por la enzima colesterol oxidasa (Cox)). Mediante estudios de fluorescencia utilizando las sondas DPH, TMA-DPH y Laurdan se determinó que el orden de membrana aumentó cuando se incorporó CHEMS. Mediante estudios de espectrofotometría utilizando la sonda cristal violeta (CrV) y la técnica de patch-clamp se detectaron, respectivamente, modificaciones conformacionales en el nAChR y cambios en la activación del mismo cuando los diferentes sistemas habían sido incubados con CHEMS o Cox, no así con Col. Tratando LUVs con Tritón, y posterior centrifugación y separación por SDS-PAGE, se determinó que luego de la incorporación de Col o CHEMS al sistema, el nAChR se localizó mayoritariamente en fracciones ordenadas, mientras que cuando se produjo la transformación del Col a colestenona el receptor se localizó principalmente en fracciones desordenadas. Por último, estudios de microscopía confocal utilizando GUVs mostraron que alteraciones en el Col causaron cambios significativos en la presencia y distribución de dominios ordenados y desordenados; y que la presencia de un componente proteico en el sistema, como es un péptido representativo del segmento transmembrana yTM4 del nAChR, alteró las características de la membrana, llevando a todo el sistema a un mayor orden. De acuerdo con estos resultados, distintas modificaciones del Col en la membrana llevan a cambios de su orden y asimetría, y al mismo tiempo a cambios en la localización del nAChR en un determinado entorno, hecho que repercute directamente en su funcionalidad. Su localización en dominios ordenados ocasiona una disminución de su actividad, mientras que su presencia en dominios más desordenados lleva a un aumento de su función. De esta manera, la localización del nAChR en uno u otro dominio podría explicar los cambios en la señal colinérgica reportados en situaciones de envejecimiento y/o patologías como la EA. Existen numerosas evidencias de interacciones funcionales entre los péptidos β-amiloide (Aβ), involucrados en la enfermedad de Alzheimer, y el nAChR α7. En el capítulo II se estudió la modulación del nAChR α7 neuronal por oligómeros de Aβ1-40 y Aβ1-42. Se ha postulado que la acumulación excesiva de estos péptidos en el cerebro provoca la formación de placas seniles, directamente relacionadas con el proceso de neurodegeneración e inflamación característico de esta enfermedad. Sin embargo, evidencias más recientes sugieren que las especies más neurotóxicas serían las formas oligoméricas de Aβ. Mediante estudios de fluorescencia utilizando la sonda CrV se demostró que los oligómeros de Aβ provocan cambios conformacionales en el receptor α7. Utilizando la técnica de patch clamp se determinó que dichos oligómeros son capaces de activar al receptor α7 en muy bajas concentraciones y que, a concentraciones más altas, disminuyen la potenciación de α7 por moduladores alostéricos positivos (PAMs, positive allosteric modulators). Estos resultados muestran un rol dual de los oligómeros de Aβ dependiente de su concentración, como agonistas y como moduladores negativos de α7. El efecto agonista, potenciador de la señal colinérgica, podría tener un rol importante en la fisiología normal del individuo, mientras que el efecto inhibitorio, dado por su exacerbada producción, podría contribuir a la deficiencia en la memoria y cognición asociada a la EA. Teniendo en cuenta las características multifactoriales de la EA, la estrategia de búsqueda de nuevas moléculas apunta al descubrimiento y desarrollo de “multitarget drugs”, es decir de moléculas activas en varios blancos moleculares, por lo que el capítulo III se centró en el descubrimiento y optimización de nuevas moléculas bifuncionales que sean capaces de activar al nAChR e inhibir a la acetilcolinesterasa (ACE). Partiendo de un screening de extractos obtenidos de distintas plantas medicinales, mediante técnicas cromatográficas y de resonancia magnética nuclear se identificó a la molécula de cafeína como una molécula sumamente interesante para la EA. Además de confirmar su ya conocida actividad inhibidora de la ACE, utilizando técnicas de espectrofotometría con la sonda fluorescente CrV y de patch-clamp, en este trabajo se postula su actividad agonista sobre los nAChRs muscular y α7 neuronal. Caracterizada la actividad de la cafeína sobre el sistema colinérgico, se obtuvieron luego 5 análogos sintéticos de esta molécula mediante diseño racional. Se determinó que todos los análogos presentan actividad sobre ambos blancos moleculares, la ACE y los nAChRs, y cuya potencia es mayor a la de la cafeína. Mediante estudios de modelado molecular y docking se identificaron los sitios de inhibición de los análogos de la cafeína en la ACE y de interacción con el nAChR permitiendo postular a estos compuestos como agonistas parciales. Estos hallazgos resultan prometedores en la búsqueda de nuevos fármacos como una estrategia terapéutica para la EA. El otro receptor estudiado en este trabajo de Tesis fue el receptor 5-HT3, uno de los menos conocidos de la familia de los Cys-loop, el cual a nivel presináptico participa de la finalización de la señal nerviosa, tornándose un blanco molecular novedoso tanto en la EA como en otras patologías neurodegenerativas que requieran una potenciación de dicha señal. En el capítulo IV, utilizando el receptor de alta conductancia 5-HT3AHC, se descifraron por primera vez las diferencias entre la activación ortostérica del mismo y su activación alostérica por timol y carvacrol. Mediante la técnica de patch clamp, combinando registros de corrientes macroscópicas en la configuración whole-cell y de canal único en la configuración cell-attached, se caracterizó en primer lugar la activación del receptor humano 5-HT3AHC por los agonistas ortostericos 5-HT y triptamina, y luego la activación alostérica mediada por 2 terpenoides, carvacrol y timol. Se confirmó que tanto el carvacrol como el timol se comportan macroscópicamente como agonistas menos eficaces que 5-HT. Sin embargo, a nivel de canal único, estos 2 terpenoides activan a los receptores 5-HT3A con mayor eficacia que 5-HT. Más aún, se determinó que además de actuar como agonistas, el carvacrol y el timol actúan como modulares alostéricos positivos del receptor 5-HT3AHC humano, y que el efecto potenciador es evidente a concentraciones menores que el efecto agonista. De esta manera, los resultados de este capítulo permitieron definir las bases mecanísticas que subyacen a las diferencias entre la activación y potenciación alostérica u ortostérica del receptor humano 5-HT3A. En resumen, en este trabajo de Tesis se profundizó en el conocimiento de distintas formas de modulación de los nAChRs y del receptor 5-HT3, ya sea por moléculas exógenas o por el entorno lipídico en el que se encuentran, brindando bases moleculares para el entendimiento de su función, su modulación y su afección en determinadas patologías como la EA. En este trabajo se lograron avances significativos, con resultados de gran relevancia, ya sea para el estudio o tratamiento de esta enfermedad. / The Cys-loop receptor family, which belongs to the Ligand-gated ion channel (LGIC) superfamily, includes cation channels, such as nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) and serotonin 5-HT3 receptors, and anion channels, such as those activated by GABA (GABAA) and glycine. These receptors are important in normal physiology and in various pathologies, among which neurodegenerative diseases, such as Alzheimer's disease (AD), are included. They are therefore important molecular targets for the development of new drugs, this being the reason why the knowledge of their function is indeed a very interesting aspect worth exploring. Cys-loop receptors are integral membrane proteins whose function is conditioned by their lipid environment as well as by different extrinsic factors. These receptors are formed by five subunits organized pseudo-symmetrically around a central pore. Three different domains can be distinguished: an extracellular domain (ECD), where the agonist and/or antagonist binding sites are localized, a transmembrane domain (TMD), which contains the ion pore and is in extensive contact with membrane lipids, and a small intracellular domain (ICD), which is important for the conductance of the channel and modulation. In this Doctoral Thesis, the function and modulation of two neurotransmitter receptors that belong to the Cys-loop receptor family, nAChRs and 5-HT3 receptors, were explored by using a large variety of fluorescence, confocal microscopy and electrophysiological approaches. In Chapter I, modulation of the muscle nAChR by its lipid environment was studied. Special attention was put on cholesterol (Chol), which displays different lateral and transmembrane asymmetries all throughout life as well as under health and disease conditions. This lipid is crucial for the proper functioning of the nAChR. Different model systems were used: large unilamellar vesicles (LUVs), giant unilamellar vesicles (GUVs), T. californica nAChR rich membranes and BOSC 23 cells heterologously expressing the muscle nAChR. The experimental systems were subjected to different treatments to modify their Chol conditions resulting in: i) an increment in Chol content, ii) an increment in sterols in the outer layer (after addition of cholesteryl hemisuccinate (CHEMS)), and iii) conversion of part of the Chol to cholestenone (through the enzyme Cholesterol Oxidase (ChOx)). Through fluorescence studies using DPH, TMA-DPH and Laurdan probes it was determined that the membrane order increased when CHEMS was incorporated. By using the fluorescent probe Crystal Violet (CrV) and patch-clamp recordings, conformational changes of the nAChR associated to changes in its activation properties were detected after incubation with either CHEMS or ChOx, but not with Chol. By treating LUVs with Triton, and subsequent centrifugation and separation by SDS-PAGE, it was determined that after incorporation of Chol or CHEMS to the system the nAChR was located mostly in ordered fractions, while after the conversion of Chol to cholestenone the receptor was found in disordered fractions. Confocal microscopy studies using GUVs showed that Chol alterations caused significant changes in the presence and distribution of ordered and disordered domains, and that the mere presence of a protein component in the system, specifically a peptide corresponding to the forth transmembrane segment of the nAChR (M4), led to a higher order of the entire system. According to our results, we conclude that modifications of membrane Chol lead to changes in membrane order and asymmetry, and, at the same time, in the location of the nAChR, a fact that would directly affect its functionality. The location of the nAChR in ordered domains causes a decrease in its activity whereas its location in more disordered domains enhances its function. In this way, the location of the nAChR in one or another domain fine-tunes its function and could explain the changes in the cholinergic signal reported in situations of aging and/or pathologies, such as AD. There is increasing evidence of functional interactions between β-Amyloid (Aβ) peptides, involved in Alzheimer's disease, and α7 nAChR. In Chapter II, modulation of α7 nAChR by Aβ1-40 and Aβ1-42 oligomers was studied. It has been postulated that the accumulation of these peptides in the brain causes the formation of senile plaques, which are directly related to the neurodegeneration and inflammation observed in AD. However, more recent evidence suggests that the most neurotoxic species are the oligomeric forms of Aβ. Fluorescence studies using the CrV probe demonstrated that Aβ oligomers cause conformational changes in the α7 receptor, which were dependent on the concentration. Accordingly, single channel recordings revealed that whereas at very low concentrations (pM to nM range) these oligomers are capable of activating the α7 receptor, at higher concentrations, which are compatible with those found in AD patients, they decrease the enhancement of α7 by positive allosteric modulators (PAMs). These results show a dual role of Aβ oligomers depending on their concentration, as agonists and as negative modulators of α7. The agonist effect, which enhances the cholinergic signal, could have an important role in normal physiology, while the inhibitory effect, given by the exacerbated production of Aβ, could contribute to the failure in memory and cognition associated with AD. Taking into account that Alzheimer’s is a multifactorial disease, the search for new molecules aims at discovering and developing “multitarget drugs”. Chapter III is focused on the discovery and optimization of new bifunctional molecules capable of activating the nAChR and inhibiting the AChE. Starting from a screening of extracts obtained from different medicinal plants and using chromatographic techniques and nuclear magnetic resonance, the caffeine molecule was identified as a highly interesting molecule for AD. In addition to its already known AChE inhibitory activity, using CrV fluorescence probe and patch-clamp techniques we postulated its agonist activity in the muscle and α7 nAChRs. After having characterized the activity of caffeine in the cholinergic system, five synthetic analogs of this molecule were obtained by rational design. It was determined that all the analogs have activity in both molecular targets, the AChE and the nAChRs, and that they have a greater potency than caffeine. Through docking studies, the sites of inhibition of caffeine analogs in the AChE and the sites of interaction with the nAChRs were proposed. These compounds are promising as new drugs for a therapeutic strategy for AD. The other receptor explored in this Thesis was the 5-HT3 receptor, one of the least known of the Cys-loop family, which has been recently proposed as a novel molecular target both in AD and in other neurodegenerative pathologies. In Chapter IV, by taking advantage of the high-conductance receptor 5-HT3AHC, differences between orthosteric and allosteric activation of the human 5-HT3A receptor were deciphered for the first time. By using the patch clamp technique, and combining macroscopic current recordings in the whole-cell configuration and single channel recordings in the cell-attached configuration, the activation of the human 5-HT3AHC receptor by the orthosteric agonists, 5-HT and tryptamine, and the allosteric activation, by carvacrol and thymol, were described. Both carvacrol and thymol were less effective agonists than 5-HT at the macroscopic level. However, at the single channel level, these two terpenoids activated 5-HT3A receptors more efficiently than 5-HT. Furthermore, it was demonstrated that in addition to acting as agonists, carvacrol and thymol behave as positive allosteric modulators of the human 5-HT3AHC receptor at low concentrations. In this way, these results made it possible to define the mechanistic bases underlying the differences between orthosteric and allosteric activation and potentiation of the human 5-HT3A receptor. Summing up, in this Doctoral Thesis we deepened into the knowledge of modulation of the nAChRs and the 5-HT3 receptor, either by extrinsic molecules or by the lipid environment in which they are located. Our findings provide molecular bases for the understanding of the function and modulation of these receptors and their implication in certain pathologies, such as AD. In this work, significant advances with highly relevant results were made for the study or treatment of this disease.