Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) és un patògen intracel·lular gram negatiu que provoca gastroenteritis en humans però que en ratolins provoca una infecció sistèmica similar a la febre tifoidea humana (provocada en aquest cas per S. Typhi). Una de les característiques principals de la infecció per S. enterica és la capacitat que presenta per envair activament cèl·lules epitelials i sobreviure i proliferar a l'interior dels macròfags.S. Typhimurium presenta codificades en el seu genoma tres tipus de ribonucleotidil reductases (RNRs): classe Ia, Ib i III. Les RNRs són enzims essencials ja que són els responsables de la síntesi de novo dels desoxirribonucleòtids (dNTPs), necessaris per a la síntesi i reparació del DNA, a partir de la reducció dels ribonucleòtids (NTPs). Fins ara s'han descrit tres classes de RNRs que es diferencien pel mecanisme de generació del radical que utilitzen, l'estructura que presenten, la seva regulació al·lostèrica i la seva dependència de l'oxigen. Tot i així, totes tenen en comú el mecanisme de reacció i la utilització d'un radical lliure orgànic per a iniciar la catàlisi.En aquest treball s'ha estudiat la regulació transcripcional de les tres classes de RNRs presents en S. Typhimurium, centrant-nos en dos reguladors: NrdR i Fur. S'ha estudiat l'efecte de la deleció de NrdR sobre l'expressió gènica de les tres classes de RNRs. NrdR és un repressor de les tres classes de RNRs i presenta un major efecte sobre l'expressió de l'operó nrdHIEF. També s'han descrit les seves caixes d'unió i s'han obtingut proteïnes mutants en determinats residus que afecten la funcionalitat de NrdR in vivo, possiblement degut a la participació d'aquests residus en la unió de dATP/ATP. La mutació de Fur provoca un agument de l'expressió de l'operó nrdHIEF de fins a cinc vegades respecte la soca salvatge. A la regió promotora de l'operó nrdHIEF hi hem detectat una possible caixa d'unió de Fur, la mutació de la qual provoca un augment en l'expressió similar a l'observat en la soca amb Fur delecionat. Mitjançant assajos de retardament electroforètic hem confirmat la unió de Fur a la regió promotora de l'operó nrdHIEF.En condicions normals, S. Typhimurium utilitza la RNR de la classe Ia per a la síntesi de novo de desoxirribonucleòtids en presència d'oxígen. La classe Ia és essencial per al seu creixement i la classe Ib no és capaç de complementar-ne la seva mutació a no ser que se li introdueixi una còpia extra. La presència de dues RNRs amb activitats redundants en un mateix microorganisme, el fet que en altres espècies bacterianes la síntesi de desoxirribonucleòtids en presència d'oxigen la dugui a terme la classe Ib, i que tant en E. coli com S. Typhimurium la classe Ib s'hagi conservat al llarg de l'evolució fa pensar que aquesta classe de RNR ha d'expressar-se en algunes condicions molt concretes de creixement.En aquest treball s'ha estudiat la participació de les RNRs en la virulència de S. Typhimurium SL1344 mitjançant la construcció de mutants de cada una de les tres classes així com de dobles mutants i mutants en els seus reguladors (Fur, NrdR). Mitjançant assajos d'infecció de línies cel·lulars de macròfags i també de cèl·lules epitelials hem intentat desvetllar quina de les RNRs és la responsable del creixement de S. Typhimurium durant el procés d'infecció. Els resultats obtinguts indiquen que la RNR responsable de la invasió i de la proliferació a l'interior de macròfags és la classe Ia, mentre que les classes Ib i III no semblen ser essencials. No obstant, observant el comportament de la soca mutant en la classe Ia que presenta la classe Ib sobreexpressada, durant les primeres hores d'infecció (2-6 h) sí que és capaç de sobreviure. Creiem que en aquesta etapa inicial de la infecció, quan es produeix l'explosió respiratoria, es generen unes condicions que activen l'expressió de l'operó nrdHIEF, possiblement la concentració de peròxid d'hidrogen és capaç d'inhibir l'activitat repressora de Fur. La gran demanda de dNTPs a causa del dany al DNA que s'està produint fa necessari un subministrament extra de dNTPs que aportarà la reductasa NrdEF. / Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) is a gram negative intracellular human pathogen causing gastroenteritis in humans as well as a systemic infection in mice similar to human typhoid fever (which is caused by S. Typhi). One of the main features of S. enterica infection is its capacity to actively invade epithelial cells and proliferate inside macrophages.S. Typhimurium presents three classes of ribonucleotide reductases (RNRs) in its genome: class Ia, class Ib and class III. RNRs are essential enzymes because they carry out the de novo synthesis of deoxyribonucleotides (dNTPs), needed for DNA synthesis and repair, by reducing ribonucleotides (NTPs). Up to date, three different classes of RNRs have been described, differing in their mechanism of radical generation, their three-dimensional structure, allosteric regulation and their oxygen dependence. Nevertheless, they all have in common the mechanism of reaction and the use of an organic free radical to initiate catalysis.This work has studied the transcriptional regulation of the three RNR classes present in S. Typhimurium, giving importance to two main regulators: NrdR and Fur. We have studied the effects of NrdR deletion in each class of RNR gene expression. Our results indicate that NrdR is a repressor of all three classes, but it shows a stronger repression when regulating nrdHIEF expression. We have also described NrdR recognition sites (NrdR boxes) and we have obtained mutant proteins in some residues that affect NrdR functionality in vivo, possibly due to their participation in dATP/ATP union.Mutation of Fur causes an upregulation of nrdHIEF expression up to five fold compared to the wild type strain. We have detected a putative Fur recognition sequence within the nrdHIEF promoter region. Mutation of this recognition sequence causes an upshift in nrdHIEF expression similar to the level observed in the fur mutant. Using electrophoretic mobility shift assays (EMSA) we have confirmed that Fur interacts with the nrdHIEF promoter region.Under normal conditions, S. Typhimurium uses class Ia RNR to de novo synthesize dNTPs in the presence of oxygen. Class Ia is essential for normal growth and class Ib is not able to complement its mutation unless an extra copy of nrdHIEF is introduced. The presence of two RNRs with redundant activities in the same organism, the fact that other bacterial species use class Ib for dNTP synthesis in then presence of oxygen, and that both E. coli and S. Typhimurium have retained class Ib enzymes during evolution, suggest that this class might be expressed under specific growth conditions.We have studied the role of RNRs in the virulence of S. Typhimurium SL1344 by means of different mutants and double mutants in each RNR class as well as mutants in their transcriptional regulators (Fur, NrdR). Infection assays performed in macrophage cell lines and epithelial cell lines have allowed to elucidate which RNR is responsible for S. Typhimurium growth during infection. Our results indicate that class Ia is the RNR responsible for invasion and proliferation inside macrophages, while class Ib and class III do not seem to be essential. However, class Ia mutants overexpressing class Ib are capable of surviving the first hours of infection (2-6 h). We think that is in this first stage of the infection process (when the oxidative burst takes place), specific conditions generate and activate nrdHIEF expression. It is possible that hydrogen peroxide concentrations are responsible for the inhibition of the Fur repressor activity. The highest demand of dNTPs due to DNA lesions makes it necessary for an extra dNTP supply that will be provided by the NrdEF enzyme.

La majoria de les proteïnes d'interès biomèdic com hormones, enzims, factors de creixement o antígens s'obtenen en proporcions molt petites de les seves fonts naturals i fa que la seva comercialització no sigui viable. Per això la producció de proteïnes heteròlogues en bacteris ha estat un gran avenç i actualment és un procés molt utilitzat per la indústria farmacològica, ja que és un procés ràpid i de baix cost. El bacteri Escherichia coli ha estat l'organisme productor més usat com a fàbrica cel·lular degut a l'exhaustiu coneixement que se'n té, la seva fàcil i econòmica manipulació i la gran varietat de sistemes i vectors d'expressió que s'han dissenyat específicament per aquest. Un dels principals obstacles que ens trobem quan utilitzem E.coli com a organisme productor és la dificultat de plegar la proteïna correctament, el que implica la seva degradació o la seva agregació en forma de cossos d'inclusió. La formació de cossos d'inclusió és un dels majors problemes d'aquests processos i per això es té un gran interès en evitar que es formin i en buscar estratègies per a millorar l'expressió de la proteïna soluble. En aquest treball s'ha estudiat profundament els mecanismes involucrats en la formació dels cossos d'inclusió amb l'objectiu de buscar solucions a la problemàtica que representa i d' entendre millor les bases moleculars que porten a l'agregació de proteïnes. Per això, s'ha estudiat la naturalesa dels agregats des de diferents punts de vista, des de l'anàlisi del seu creixement dins del citoplasma d'E. coli, l'estudi dels factors cel·lulars que hi estan implicats, com s'estructura la proteïna agregada a nivell molecular i com es pot recuperar la proteïna dels agregats en el seu estat natiu.Els resultats obtinguts ens han portat a proposar un model de construcció dels cossos d'inclusió, que ens demostra que l'agregació proteica és reversible i no irreversible com es creia prèviament. La formació dels cossos d'inclusió és el resultat d'un equilibri dinàmic entre l'agregació i la solubilització, que està desplaçat cap a l'agregació durant la sobreproducció d'una proteïna recombinant, però que és invertit quan aquesta s'atura. Per altra banda, també s'ha detectat que els agregats presenten plasticitat molecular, que es correspon amb un estat d'agregació reversible. El procés de formació i solubilització dels cossos d'inclusió és un mecanisme íntimament associat amb el sistema de control de qualitat proteic, on proteases i xaperones s'encarreguen d'assegurar el correcte estat conformacional de les noves cadenes polipeptídiques sintetitzades. Aquesta vinculació ens suggereix que l'agregació proteica pot representar un mecanisme de resposta a l'estrés desenvolupat per a reduir la toxicitat produïda per la presència d'estructures proteiques mal plegades en el citoplasma d'E. coli. Les xaperones DnaK i GroEL tenen un paper rellevant en la formació dels cossos d'inclusió. Mentre que DnaK evita la seva formació, sembla que GroEL indueix l'aglutinació dels petits preagregats que interaccionen per a formar un únic cos d'inclusió. La solubilització dels agregats in vivo és un procés multifactorial, en el que hi intervenen una gran part de les proteïnes de xoc tèrmic. En un àmbit més aplicat, hem estudiat possibles maneres de recuperar la proteïna acumulada en els cossos d'inclusió. Per una banda, hem desenvolupat un procediment que mimetitza la solubilització dels agregats que es dóna in vivo, basat en la incubació d'aquests amb extractes cel·lulars i per altra l'ús de la pressió hidrostàtica. Els dos casos ofereixen avantatges respecte els utilitzats fins ara, com que són més ecològics perquè s'evita l'ús d'agents químics, són més econòmics i fàcilment escalables i en el primer cas, és més genèric. / Most of the proteins of relevant biomedical value are found at very low concentrations in their natural sources. Nowadays, the production of recombinant proteins in host cells has became a novel technology extensively used because it offers the possibility to obtain any protein at high concentrations. However, the production of recombinant proteins in host cells, especially Escherichia coli, often results in the formation of insoluble aggregates known as inclusion bodies (IBs). Since insoluble polypeptides are not useful for biotechnological purposes, the formation of inclusion bodies is regarded as an obstacle for the use of bacterial cell factories. For this, there is a big effort in improving the solubility of the protein produced and on finding a general strategy to recover purified active proteins from IBs. In this study, we analysed the mechanisms involved in the inclusion body formation in order to overcome the problems they cause and for a better understanding of the molecular basis that leads to protein aggregation. For this, we studied the nature of inclusion bodies from different points of view, such as analysing their growing in the E.coli cytoplasm, studying the cellular factors that participate in this process, the molecular organisation of the aggregated protein and the ways to recover native protein from IBs. Since current days, inclusion bodies were believed to be compact protein aggregates, that being unreachable by proteases and chaperones remain inert once produced in the cell. However, the investigations carried out during this project demonstrate that Ibs are more labile structures, formed during a dynamic process that involves protein precipitation but also solubilisation and proteolytic degradation. IB particles are then formed because of the equilibrium between these antagonic processes, that is displaced towards precipitation when the recombinant protein is produced at high rates. In agreement with this finding, we have detected that polypeptides embedded in Ibs present molecular plasticity.In addition, our observations prove that IB protein is accessible to chaperones and other components of the cell quality control system that control IB formation and solubilisation. This observation suggest that the IB construction and deconstruction is a process included in the stress response, which might be developed to reduce the toxicity produced by the presence of unfolded proteins in the cytoplasm of E. coli. We have seen that chaperones DnaK and GroEL have a relevant function in the IB formation. While DnaK has a preventive role in the protein aggregation, GroEL seems to induce the precipitation of the small preaggregates that interact to form a big inclusion body. On the other hand, we detected that different chaperones participate in the IB solubilisation process, in a co-ordinate way. In a more applicable area, we explored new strategies to recover native protein from IBs. The first method proposed is based on the in vitro mimics of IB protein solubilisation that we observed in vivo, by using crude cell extracts to solubilise purified inclusion bodies. We have also analysed the application of a high hydrostatic pressure to dissociate IBs and refold recombinant protein. Both methods offer advantages from the actual strategies used up to now, such as they are more ecological since they skip the use of chemical agents, they are more economical and easy to adapt to industrial scale and in the first case, it is more generic.

All the processes that take place in a cell require one or more proteins, meaning that they are essential components of life. Proteins are macromolecules consisting of amino acid units, all of them being constructed with combinations of only 20 amino acids. The primary structure of a protein molecule is determined by the sequence of amino acids connected by peptide bonds forming a polypeptide chain. Once the amino acid chain is synthesized, the protein folds by a physical process that might be eventually assisted by other proteins, reaching its characteristic three‐dimensional structure that is the final, functional conformation. However, although it is known that all the proteins must properly fold into their correct native conformation to be functional, their final conformation cannot be predicted from their primary amino acid sequence, being protein folding mechanisms one of the most challenging problems in biology today. Many proteins of relevant industrial or medical value are produced in low amounts in their natural sources. However, at the end of the seventies, the development of recombinant DNA technologies opened a new promising era for protein production in high amounts for both research and industrial applications. This had a tremendous impact, for example, in many areas of medicine as a tool to produce new drugs for the treatment of diseases and genetic disorders. Genetic engineering permits the introduction of the encoding genes of the protein of interest into recipient cells, where these genes are positioned downstream of regulable promoters in movable genetic elements, mainly plasmids. Under suitable conditions, these transgenic cells acting as protein production bio‐factories would be expected to act as unlimited and inexpensive source of rare, highly valuable proteins not only for proteomics and structural functional genomics1 but also for large‐scale preparative purposes. The quality as well as the quantity of the produced recombinant protein is greatly influenced by the chosen biological cell system. Bacteria have been the most commonly used organisms for protein production, specially the enterobacteria Escherichia coli, not only for the low cost of the used processes, but also for its fast growth. Generally, in Escherichia coli, the rather small host cell proteins can fold properly, adopting a native, biological active conformation. However, when producing heterologous proteins, specially those with eukaryotic or viral origin, important obstacles appear during the protein production process: a) in most cases, the protein is produced in a non functional conformation; b) sometimes the formed product is toxic for the cell; c) the protein often results proteolytically degraded2; d) the product is accumulated as an insoluble, non‐functional protein aggregates, known as inclusion bodies3. Therefore, even though the important advantages of the use of bacteria as a expression system, Escherichia coli also presents some drawbacks, such as its inability to carry most of the post‐transcriptional modifications, often required for eukaryotic protein function, the lack of a secretion mechanism to release the protein to the medium, and the inability to create an oxidative environment to facilitate disulfide bond formation required to achieve the final, functional structure of some proteins. Therefore, this leads to the production of proteins which are not always suitable for immediate use. This means that, to date, many proteins have been excluded from the biotechnological and pharmaceutical market because they cannot be produced in high yields as soluble and active products. To avoid protein folding problems encountered in bacteria under overexpression conditions, mainly secretion and post‐transcriptional modifications, alternative host cells, such as yeast, filamentous fungi, mammalian or insect cells, have been explored. Nevertheless, an enormous number of deficiencies in these systems such as difficulty of genetic manipulation, low productivity and high costs, shows that these organisms are not ideal for this aim and that, even when bacteria show some obstacles in the production process and often this system has to be optimized for specific products, it is, in most of the cases, the best choice.

El càncer de bufeta (BC) és un dels càncers més comuns a Europa. Afortunadament, la majoria de pacients es diagnostiquen en els estadis primerencs de la malaltia, quan el tumor es troba a la mucosa. D’aquest estadi en diem càncer de bufeta no invasiu (NMIBC). El tractament consisteix en la resecció del tumor i, posteriorment, a administrar intravesicalment la soca atenuada de Mycobacterium bovis, M. bovis BCG viu. Els beneficis del BCG com a teràpia per a pacients de NMIBC són clars: el BCG evita la recurrència i la progressió del BC, la qual cosa millora la supervivència dels pacients. Tot i així, cal no oblidar els desavantatges. La majoria de pacients pateixen efectes secundaris lleus i, fins i tot, severs i molts pacients han d’abandonar el tractament a causa de la seva toxicitat. Per tant, cal trobar alternatives més segures. Recentment s’ha descrit la capacitat antitumoral del micobacteri ambiental Mycobaterium brumae. M. brumae ha demostrat tenir una activitat antitumoral semblant al BCG sobre diferents línees cel·lulars de BC humanes. A més a més, aquesta espècie és capaç d’activar macròfags de ratolí i, també, d’activar cèl·lules mononuclears de sang perifèrica per a que siguin citotòxiques per a les cèl·lules de BC. Per tant, el següent pas seria estudiar la capacitat antitumoral de M. brumae i la seva capacitat estimuladora del sistema immunitari en el model animal de BC. Però primer, caldria abordar un altre qüestió important. Es coneix que els micobacteris, degut a l’alt contingut lipídic de la seva paret, són molt hidrofòbics i tenen tendència a formar agregats quan es troben en solucions aquoses. Aquests agregats dificultarien la interacció dels micobacteris amb les cèl·lules canceroses. En aquesta investigació, es van estudiar diferents emulsions amb l’objectiu de disminuir la mida d’aquests agregats. A més a més, l’emulsió escollida havia de mantenir la viabilitat d’M. brumae, de mantenir la seva capacitat antitumoral i de induir una resposta immunitària in vitro. Quan finalment es va escollir, es van aplicar diferents tractaments en el model animal. La supervivència dels animals amb tumor va ser registrada i la resposta immunitària generada es va estudiar mitjançant diverses tècniques. M. brumae ha mostrat resultats prometedors en el model animal i, per tant, podria ser considerat una alternativa segura al BCG per al tractament de pacients de NMIBC. / Bladder cancer (BC) is one of the most common cancers in Europe. Fortunately, most of the cases are diagnosed at early stages of the disease, when tumours are still confined to the mucosa. These are called non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). The treatment consists on resecting the tumour and, then, on the intravesical administration of the attenuated stain of Mycobacterium bovis, M. bovis BCG in its live form. The benefits of BCG in NMIBC patients are clear; BCG avoids recurrence and progression of BC which improves the survival rate of the patients. Nevertheless, the drawbacks cannot be forgotten. Most treated patients experience mild to severe side effects and many patients have to abort the BCG treatment due to its toxicity. Thus, safer alternatives are needed. It has been recently described the antitumour capacity of Mycobacterium brumae, an environmental mycobacterium. M. brumae showed in vitro a similar antitumour activity to BCG on different BC cell lines. Moreover, this species showed to be able to activate murine macrophages and to activate peripheral blood mononuclear cells’ cytotoxicity against BC cells. Thus, the next step was to test M. brumae’s antitumour capacity and its ability to activate an immune response in an animal model of BC. Moreover, another important issue was addressed on the way. It is known that mycobacteria, due to the high lipidic content of their cell wall, are very hydrophobic and have the tendency to aggregate in aqueous solutions. These clumps might difficult the interaction between the bacteria and the BC cells. In this thesis, different emulsions were assayed in order to diminish the size of these aggregates. In addition, the chosen emulsion had to maintain M. brumae viability, to maintain its antitumour activity and its capacity to induce an immune response in vitro. Once one emulsion was chosen, different treatments were tested in the animal model. Survival rates of the treated tumour-bearing mice were recorded and the local and systemic immune response was also studied by using different techniques. In conclusion, emulsified M. brumae showed promising results in the BC mouse model which means it could be a safer alternative to BCG for NMIBC patients.

La cepa bacteriana AL 1.1 se aisló de una muestra de suelo de la isla Decepción del continente Antártico. Inicialmente se observó que dicha cepa tenía la capacidad de reducir la tensión superficial del medio, por lo que fue seleccionada para realizar la presente tesis doctoral. Después de confirmar la identificación del aislado como un Bacillus licheniformis se caracterizó el biotensioactivo (BT) producido como liquenisina (LchAL1.1). El estudio de las propiedades físico-químicas de la LchAL1.1 mostró que es capaz de reducir la tensión superficial del agua de 72 a 30 mN/m y posee una concentración micelar crítica de 15 mg/L, indicando una elevada eficacia y eficiencia. La LchAL1.1 tiene la capacidad de formar cristales líquidos del tipo de cruces de malta, lo cual sugiere una importante capacidad de agregación y abre un campo importante en la encapsulación de compuestos de interés. La primera parte del trabajo se centró en el estudio de la producción del BT. Al analizarse diversas fuentes de carbono se observó que la cepa AL 1.1 solo producía liquenisina con hidratos de carbono. Dicha información fue de utilidad para la selección de las melazas como fuente de carbono ya que es un sustrato rico en dichos componentes y además es una fuente residual de bajo coste. Utilizando dicho sustrato se diseñó el medio de producción óptimo mediante la aplicación de la metodología de superficie de respuesta (107,82 g/L de melazas, 6,47 g/L de NaNO3 y 9,7 g/L de K2HPO4/KH2PO4), obteniendo rendimientos cercanos a los 3,2 g/L de liquenisina, lo que representa un incremento de 15 veces con respecto al medio inicial. Se han estudiado las propiedades biológicas de la LchAL1.1 para conocer su posible aplicación en diferentes ámbitos. A pesar de su débil acción antimicrobiana, la LchAL1.1 se presenta como una alternativa interesante para evitar la adherencia y eliminación de biofilms microbianos, encontrando una mayor eficacia para evitar la adherencia microbiana y una alta eficiencia para la eliminación del biofilm pre-formado. Adicionalmente se estudió la interacción de la LchAL1.1 con membranas biológicas y vesículas fosfolipídicas con el objetivo de conocer el mecanismo molecular de su acción. La LchAL1.1 produce hemólisis a concentraciones por debajo de su concentración micelar crítica. Las medidas cinéticas muestran que con la adición de la LchAL1.1, la salida de K+ precede a la de la hemoglobina, y que la adición de protectores osmóticos de tamaño apropiado al medio externo hace posible disminuir y hasta evitar la hemólisis. Estos resultados sugieren que la hemólisis de los eritrocitos humanos ocurre por un proceso coloide-osmótico. Por otro lado, la adición de la LchAL1.1 a vesículas unilamelares (LUV) de POPC produce la salida selectiva de solutos atrapados en su interior al medio externo, encontrando que la composición de la membrana modula el proceso de salida en gran medida. Esto nos indica que la incorporación de la LchAL1.1 en membranas tanto experimentales como modelos, provoca la formación de dominios laterales, los cuales forman defectos o “poros” a través de los cuales tiene lugar la salida de solutos con un tamaño determinado. Con respecto a su acción sobre células eucariotas, la liquenisina induce apoptosis en un 96,5% de las células epiteliales de cáncer de colón (Caco-2). Dicho efecto puede estar relacionado con la interacción de las micelas con la bicapa lipídica, ya que el efecto ocurre a concentraciones de la LchAL1.1 que están por encima de su concentración micelar crítica (50 – 100 µg/mL). Un nuevo enfoque para potenciar las propiedades biológicas de los compuestos bioactivos, es la posibilidad de utilizarlos en combinación. En este sentido, se evaluó la interacción de la LchAL1.1 con tensioactivos sintéticos geminales derivados de aminoácidos como el C3(LA)2 y C6(LL)2, encontrando que con el C3(LA)2 se produce una respuesta sinérgica en sus propiedades antimicrobianas, mejorando la acción de ambos compuestos especialmente contra bacterias Gram negativas / Biosurfactants are of great interest due to the demand for natural products with low toxicity. Strain AL 1.1, isolated on Deception Island (Antarctica) and identified as Bacillus licheniformis, produce lipopeptide when grow under a variety of carbohydrates. The lipopeptide was characterised as lichenysin (LchAL1.1). The LchAL1.1 reduced surface tension to 30 mN/m and had a critical micelle concentration of 15 mg/L. This highly effective and efficient characterized the product as a powerful surfactant. Besides, the formation of liquid crystalline by LchAL1.1 in form of Maltese crosses was revealed. This suggested important properties to self-aggregate and opens an important field in the compounds encapsulation. Nevertheless, their production is not competitive when cost is a limiting factor. For this reason, an economical medium, containing molasses, was optimized to enhance lichenysin production by response surface methodology (RSM). A production of 3.2 g l-1 of lichenysin was achieved with an optimum medium containing 107.82 g l-1 of molasses, 6.47 g l-1 of NaNO3 and 9.7 g l-1 of K2HPO4/KH2PO4, in which, molasses and phosphate salts had a significant effect on biosurfactant production. This medium resulted in a fifteen times increase in production compared with the non-optimized medium. The LchAL1.1 showed a weak antimicrobial activity, however, it had notable anti-adhesion activity, and was able to prevent and eliminate the biofilm formation by pathogenic strains associated with foodborne illness. Lychenysin was effectively applied in a surface pre-treatment to avoid microbial biofilm. It was also very efficient in removing biofilms in surface post-treatment. In addition, the molecular mechanism underlying permeabilization of model and biological membranes by the lipopeptide lichenysin was evaluated. The LchAL1.1 caused hemolysis of human erythrocytes, which varied with LchAL1.1 concentration in a sigmoidal manner. The LchAL1.1-induced K+ release from red blood cells preceded the leakage of hemoglobin, and in addition, hemolysis could be impeded by the presence of compounds in the external medium having a size larger than PEG 4000, indicating a colloid-osmotic mechanism for hemolysis. Lichenysin also caused permeabilization of model phospholipid membranes, as monitored by the release of carboxyfluorescein, from large unilamellar vesicles (LUV). Lipid membrane composition plays a role in the target membrane selectivity of lichenysin. The experimental results support a pore-type behaviour that can be explained by the formation of enhanced permeability domains in the erythrocyte membrane, as observed in model membranes. Furthermore, the LchAL1.1 induced apoptosis in non-differentiated intestinal Caco-2 cells (96.5%). The action can be due to the micelles interaction with lipid bilayer, because the effect occurred to LchAL1.1 concentration above critical micelle concentration (50-100 µg ml-1). Finally, the interaction between lichenysin, arginine (C3(LA)2) and lysine (C6(LL)2) surfactants was evaluated. Thus, when the LchAL1.1 act as co-surfactant improved the antimicrobial activity of arginine (C3(LA)2) surfactant, showing a synergistic effect, mainly in front to Gram negatives bacteria.

El virus de la gripe porcina (SwIV) es una zoonosis. El hecho de que los cerdos pueden actuar como "cocteleras virales" del virus de la gripe potencialmente infecciosos para el ser humano pone de manifiesto su relevancia y la necesidad de comprender la interacción de los diferentes virus de la gripe y otros patógenos respiratorios con el sistema inmune porcino. Además, el estado clínico de los cerdos infectados con gripe puede agravarse debido a una infección bacteriana secundaria. Algunas de estas bacterias como el Haemophilus parasuis son comensales del tracto respiratorio y producen la enfermedad de Glässer, una enfermedad de las granjas de cerdos con alto impacto económico. Por otro lado, las células dendríticas (DCs) son importantes en la inducción de una respuesta inmune efectiva contra los patógenos. Su localización en las vías respiratorias como células centinelas, les convierte en dianas de los patógenos. Sin embargo, su interacción con los virus de la gripe o su papel en las co-infecciones no ha sido totalmente caracterizado. Con el objetivo de entender al nivel celular la interacción de los virus de la gripe y el H. parasuis como patógenos comunes del trato respiratorio de los cerdos, tres estudios fueron desarrollados y presentados en esta tesis. En el primer estudio, las células dendríticas derivadas de la médula ósea de cerdos (poBMDCs) fueron expuestas a una cepa circulante de la gripe porcina H3N2. En el segundo estudio, las poBMDCs fueron infectados con diferentes virus de la gripe que el sistema inmune porcino puede encontrar en la naturaleza como son: el A/Swine/Spain/SF32071/2007(H3N2), el virus de la gripe pandémica de 2009 A/Catalonia/63/2009(H1N1), el virus de la gripe aviar de baja patogenicidad Anas/plathyrhynchos/Spain/1877/2009(H7N2) y el virus de la gripe aviar de alta patogenicidad A/Chicken/Italy/5093/1999(H7N1); y finalmente en el tercer estudio, las poBMDCs fueron infectadas o co-infectadas con el H3N2-SwIV y H. parasuis no virulenta (SW114) o virulenta (Nagasaki). De estos estudios, tres conclusiones generales se pueden extraer: (i) las poBMDCs se infectan con el virus de la gripe porcina H3N2 y transmiten la infección a las células permisivas sólo cuando se favorece la interacción célula-célula, (ii) el perfil de secreción de citoquinas, la expresión de los mRNA de citoquinas y factores de transcripción después de la infección con los virus H3N2 SwIV, hH1N1 y aH7N2 o aH7N1 pueden indicar una activación de la respuesta inmune específica contra estos virus, (iii) la previa infección de las poBMDCs con el H3N2-SwIV seguida por la infección con H. parasuis resultó en un perfil de citoquinas sesgada mayoritariamente hacia una respuesta inflamatoria. En conjunto, estos datos nos ayudan a comprender la interacción entre los patógenos respiratorios como los virus de la gripe porcina y/o H. paraseis, con las células dendríticas así como conocer posibles mecanismos involucrados en el desarrollo de la respuesta inmune protectora. / Swine influenza virus (SwIV) is considered a zoonosis and the fact that swine may act as “mixing vessels” of influenza viruses potentially infectious for humans illustrates its relevance and the need to understand the interaction of different influenza viruses and other respiratory pathogens with the porcine immune system. Moreover, the clinical status of influenza infected animals may deteriorate due to secondary bacterial infection. Some of these bacteria such as Haemophilus parasuis are commensal of the respiratory tract of pigs and the causal agent of Glässer’s disease, an important disease in swine herds that results in high economical loses. In other hand, dendritic cells (DCs) mediate the induction of immunity against pathogens and the location of DCs beneath the epithelium of respiratory organs makes them suitable targets for pathogens. However, their interaction with different influenza viruses or the role of DCs in co-infections has not been fully characterized. With the aim to understand at cellular level the interaction of influenza virus and H. parasuis as common pathogens of pig’s respiratory tract, three studies were undertaken and are presented in this thesis. In the first study, porcine bone marrow derived DCs (poBMDCs) were exposed to a circulating strain of H3N2-SwIV. In the second study, poBMDCs were infected with different influenza viruses that would enter in contact with the porcine immune system, such as: SwIV A/Swine/Spain/SF32071/2007(H3N2), the 2009 pandemic influenza virus A/Catalonia/63/2009(H1N1), the low pathogenic avian influenza virus A/Anas plathyrhynchos/Spain/1877/2009(H7N2) and the high pathogenic avian influenza virus A/Chicken/Italy/5093/1999(H7N1); and finally in the third study, poBMDCs were infected or co-infected with the H3N2-SwIV and H. parasuis non-virulent (SW114) or virulent (Nagasaki). From these studies, three general conclusions can be drawn: (i) poBMDCs are infected by H3N2-SwIV and they transmit the infection to permissive cells only when cell-to-cell contact was favoured; (ii) the cytokine profile and the mRNA expression of transcription factors after H3N2-SwIV, hH1N1 and aH7N2 or aH7N1 may indicate a specific immune response activation against these viruses; (iii) previous infection of poBMDCs with H3N2-SwIV followed by H. parasuis infection resulted in a profile of cytokines biased mainly towards inflammatory response. Overall, these data pave the way for understanding the relation between respiratory pathogens such as influenza viruses and/or H. parasuis and porcine dendritic cells for triggering possible mechanisms driving to protective immune response.

Mycoplamsa genitalium es un patógeno humano causante de uretritis no gonocócica y no causada por clamidias en hombres y de enfermedad pélvica inflamatoria y cervicitis. Los micoplasmas, además de ser muy interesantes para el estudio como células mínimas (dado el pequeño tamaño de su genoma), también presentan características únicas sólo presentes en este género. En particular, se ha detectado la presencia de mecanismos de adhesión y de motilidad, que además de estar implicados en el mecanismo de infección, sólo se encuentran en este género. En especial, el mecanismo de motilidad de M. genitalium consta de una estructura polar que contiene un característico citoesqueleto. Se conoce que este citoesqueleto está formado por varias proteínas implicadas en el proceso de adhesión y motilidad. En los tres primeros capítulos de esta tesis se ha determinado el papel de tres de estas proteínas: MG219, MG318 (también llamada P32) y MG386. El estudio se ha realizado gracias a la obtención de mutantes defectivos de estas proteínas. La proteína MG219 se ha hallado que es necesaria para el correcto funcionamiento de la maquinaria de motilidad de este organismo. Mediante fusión a proteínas fluorescentes se ha determinado la localización subcelular de esta proteína, que resulta localizar en la parte más cercana de la organela terminal respecto al cuerpo celular. Las células en ausencia de MG219 se mueven a una velocidad inferior a la mitad (y la mitad de frecuentemente) que las células de la cepa salvaje. Esta reducción de la velocidad es concomitante con la aparición de un mayor número de células en división y con múltiples organelas terminales. De una manera similar, las células de la cepa que carece la proteína P32 se mueven a velocidades inferiores (y con la mitad de frecuencia) que las células de la cepa salvaje. Además, se ha determinado que el N-terminal de P32 juega un papel importante en la estabilidad de las proteínas P110 y P140, las más importantes adhesinas de M. genitalium. También se ha establecido que la proteína P32 es crítica para la morfología de la parte más distal de la organela terminal. El último mutante generado en este trabajo, el defectivo para la proteína MG386, presenta importantes variaciones tanto a nivel de morfología celular como de motilidad. Las células de esta cepa presentan motilidad la mitad de frecuentemente que la cepa salvaje pero se mueven a una velocidad 1.7 veces superior. Sorprendentemente, esta cepa presenta un gran número de organelas terminales desancladas del cuerpo celular, sugiriendo un importantísimo papel de la proteína MG386 en el anclaje de la organela terminal al cuerpo celular. Se ha observado que la membrana alrededor del citoesqueleto se encuentra completamente recubierta por el complejo de adhesión o ‘nap’. Mediante estudios de microscopia electrónica se ha determinado la estructura a 3.5 nm por ctomografia crioelectrónica y a 1.9 nm por tinción negativa. Además, la tomografía crioelectrónica también ha desvelado la estructura a baja resolución del botón terminal del citoesqueleto, revelando que las placas que forman la mayor parte del citoesquelto son, en realidad, anillos de unos 20 nm de diámetro. Además, se han analizado por tomografía crioelectrónica 14 mutantes que carecen de diferentes proteínas (o dominios de éstas) relacionadas con motilidad y/o adhesión. El conjunto de todos estos datos aporta una visión global al conocimiento previo (y al generado en este trabajo) sobre el papel de las proteínas implicadas motilidad y formación del citoesqueleto de M. geniatlium. / Mycoplamsa genitalium is a human pathogen and the causative agent of non-gonococcal non-chlamydial urethritis in men and pelvic inflammatory disease and cervicitis. Mycoplasmas, besides being interesting as minimal cells (given the small size of its genome), also have unique features only present in its genus. In particular, the presence of mechanisms of adhesion and motility has been detected, and in addition of being involved in addition of being involved in the infection mechanism, are only found in this genus. In particular, the mechanism of motility of M. genitalium involves a polar structure containing characteristic cytoskeleton. It is known that the cytoskeleton is composed of several proteins involved in the adhesion and motility processes. In the first three chapters of this thesis dissertation the role of three of this proteins—MG219, MG318 (also called P32) and MG386—has been stablished. The study was conducted by obtaining null mutants strains of these proteins. The MG219 protein has been found to be necessary for the proper functionality of the motility machinery. By fusion to fluorescent proteins it has been determined the subcellular localization of this MG219, which located at the nearest part of the terminal organelle relative to the cell body. Cells in the absence of MG219 move slower than half speedy (and half frequently) the cells of the wild type strain. This speed reduction is concomitant with the appearance of a greater number of dividing cells and cell with multiple terminal organelles. In a similar manner, cells of the strain lacking P32 move at lower speeds (and with half also half frequently) than cells of the wild type strain. Furthermore, it has been determined that the N-terminal P32 plays an important role in protein stability P110 and P140, the major adhesins of M. genitalium. It has also been established that the P32 protein is critical to the morphology of the most distal part of the terminal organelle relative to the cell body. The last mutant generated in this work, the null mutant for MG386, presents significant alterations in both cell morphology and motility. The cells of this strain show motility half frequently than the wild type strain but move to a velocities as greater as1.7 times than the reference strain. Surprisingly, this strain has a high number of terminal organelles detached from the cell body, suggesting an important role of protein MG386 anchoring the organelle to the cell body. It has been observed that the membrane around the cytoskeleton is completely covered by the adhesion complex or "nap". By electron microscopy studies it has determined the structure by cryo-electron tomography at 3.5 nm and at 1.9 nm single particle by negative staining TEM of the purified P110 and P140 complex. Additionally, cryo-electron tomography also allowed to determine at low resolution the structure of the terminal button of the cytoskeleton, revealing that the plates forming most of the cytoskeleton are actually rings about 20 nm in diameter. In addition, 14 mutants lacking different proteins (or domains thereof) related to motility and / or adhesion have been analysed by cryo-electron tomography. All these data taken together provides an overview of the prior knowledge—in addition to the data generated in this work—of the role of the proteins involved motility and cytoskeleton formation in M. geniatlium.

Los trabajos presentados en esta tesis doctoral se han basado en el uso, diseño y optimización de herramientas moleculares para facilitar el diagnóstico de las leishmaniosis humanas y de reservorios animales, así como para favorecer el conocimiento del agente causal a nivel interespecífico e intraespecífico. Para el tipado interespecífico de Leishmania spp se ha optimizado un método basado en la lectura del tamaño de fragmentos marcados con fluorescencia, metodología denominada PCR-FFL (PCR-Fluorescent Fragment Length analysis). No sólo se han buscado mejoras en la técnica analítica, sino también en la sensibilidad evaluando la capacidad discriminatoria de la PCR-FFL sobre dos dianas distintas, las secuencias ribosómicas ITS-1 y 7SL, obteniéndose mejores resultados en cuanto a sensibilidad sobre 7SL. La comparación con la metodología clásica de PCR-RFLP nos ha permitido observar que a nivel metodológico la PCR-FFL presenta ventajas importantes, como la simplicidad y exactitud en la lectura de los resultados, gracias a la automatización del análisis. El uso de la PCR-FFL con ambas dianas sobre biopsia de piel o bien utilizando papeles de filtro representa una buena metodología para el diagnóstico y tipado interespecífico por su especificidad, exactitud, objetividad, elevada sensibilidad y rapidez en la obtención de los resultados. La aplicación de metodologías moleculares en estudios epidemiológicos se ha dirigido a la detección de Leishmania en dos especies de erizos presentes en la zona de alta endemia de M’sila (Argelia): Atelerix algirus y Paraechinus aethiopicus, con el objetivo de determinar su papel como posibles nuevos reservorios del parásito. El estudio serológico ha revelado contacto pasado o reciente con el parásito. La posterior detección de ADN de Leishmania en estos animales mediante una qPCR de género de alta sensibilidad nos ha permitido confirmar la infección activa de los erizos en el momento del estudio. El genotipado de Leishmania sobre muestra se ha determinado mediante PCR-FFL, permitiendo identificar la especie L. major en una muestra de piel de los erizos estudiados. Para aumentar la sensibilidad del análisis, se ha realizado una doble amplificación mediante nested-PCR que ha permitido la identificación de L. major en todas las muestras restantes. Estos resultados han señalado por primera vez la existencia de L. major en erizos, y el papel de éstos como posibles reservorios de esta especie en el área estudiada. El tercer objetivo de nuestro estudio ha consistido en analizar la diversidad intraespecífica de Leishmania infantum en sucesivos aislados del parásito obtenidos de pacientes co-infectados con Leishmania/VIH que presentan recaídas clínicas después del tratamiento, mediante el análisis de 20 microsatélites considerados polimorfos para L. infantum. El análisis de 25 aislados ha permitido detectar 18 genotipos distintos, indicando una gran diversidad a pesar de proceder de 8 pacientes co-infectados del área metropolitana de Barcelona. El bajo número de genotipos repetidos detectado ha indicado una baja proporción de recaídas clínicas entre los pacientes, no siendo las reinfecciones la única hipótesis, sino considerando otras posibilidades sobre el comportamiento del parásito en el hombre y la posible selección en los cultivos de laboratorio. En algunos casos, el análisis filogenético ha señalado una distancia genética próxima entre los aislados de un mismo paciente, que puede ser relacionado con mutaciones del parásito. La posibilidad de la infección mediante el uso de jeringas contaminadas ha sido considerada otra posible fuente de transmisión. / The work presented in this thesis is based on the design, use and optimization of molecular tools to improve the diagnosis of human leishmaniasis and the reservoir hosts, as well as to promote knowledge of the causal agent at interspecific and intraspecific levels. The optimization of interspecific typing of Leishmania spp is based on a fluorescent fragment length analysis methodology called PCR-FFL. The sensitivity of the technique was evaluated on two different targets, the ITS-1 and 7SL sequences, with high sensitivity observed in both sequences, particularly 7SL. Compared with PCR-RFLP methodology, the automated PCR-FFL analysis proved simpler and allowed more accurate readings of the results. The use of PCR-FFL with both targets on skin biopsies or filter papers is a good methodology for interspecific typing of Leishmania. Molecular techniques are usually applied for epidemiological purposes to identify new reservoir hosts. Our study is based on the detection of Leishmania in two hedgehog species of the highly endemic area of M'sila (Algeria), in order to determine their role as potential new reservoir hosts of the parasite. A serological study revealed contact with the parasite, and detection of Leishmania DNA by qPCR allowed us to confirm active infection. Genotyping of Leishmania was determined by PCR-FFL, and the species L. major was identified in one skin sample. A nested-PCR allowed the identification of L. major in all remaining samples. These results have revealed, for the first time, the existence of L. major in hedgehogs, and their role as potential reservoirs of this species. Molecular techniques were also used for the intraspecific analysis of Leishmania infantum in 25 successive isolates from 8 co-infected Leishmania/HIV patients with clinical relapses after treatment. The analysis of 20 polymorphic microsatellites for L. infantum indicated high genotype diversity with 18 genotypes, only 3 of which were repeated. Clustering and phylogenetic analysis allowed the evolution of the infection to be studied, revealing cases of confirmed relapse, parasite evolution in the patients, mixed infections followed by differential selection by the parasite culture, and reinfection.

La llet d’euga és un aliment tradicional a l’Àsia central, Mongòlia i l’antiga Unió Soviètica, on ha estat una important font d’alimentació per a les seves poblacions. A Europa el consum de llet d’egua és relativament recent i es troba en expansió. Aquest fet es deu a l’alta qualitat que posseeix. El seu contingut en carbohidrats, proteïnes i sals és més similar al de la llet humana que el de la vaca. El perfil de caseïnes té més semblança a l’humà, fet que la fa més digestible pels infants. Els objectius d’aquesta Tesi doctoral són la caracterització microbiològica i enzimàtica de la llet d’euga, l’avaluació del potencial probiòtic i de la capacitat antimicrobiana dels bacteris àcid làctics aïllats, i l’avaluació d’aquesta llet com a protector per a processos de liofilització i conservació a llarg termini de soques làctiques. Els resultats obtinguts dels recomptes microbians de l’anàlisi de les llets crues procedents de dues eugues mostren que aquesta és, des del punt de vista microbiològic, apta per al consum humà. Es confirma que la llet d’euga posseeix un microbioma ampli que es veu modificat, quantitativament i qualitativa, al llarg de la gestació. També s’ha pogut veure com conté una gran varietat d’enzims constitutius detectables mitjançant kits comercials miniaturitzats. Aquests enzims presenten una variabilitat quantitativa al llarg de la gestació. De les 11 soques de bacteris àcid làctics aïllats de la llet d’euga, les que van presentar un potencial ús com a probiòtics per la seva seguretat i resistència in vitro a condicions gastrointestinals van ser les anomenades com a Lactobacillus plantarum 1, Lactobacillus plantarum 2, Lactobacillus plantarum 3, Lactobacillus plantarum 5 i Lactococcus brevis 2. Els bacteris àcid làctics aïllats a la llet i femtes equines posseeixen una capacitat antimicrobiana enfront una gran diversitat de microorganismes indesitjables com Kocuria rhizophila, Pantoea sp., Klebsiella oxytoca, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Bacillus spp., Listeria monocytogenes, Proteus vulgaris i Enterococcus faecalis. La seva acció antimicrobiana es deu principalment a la formació d’àcids orgànics, però també a la producció de peròxid d’hidrogen i compostos termolàbils. La llet d'euga en pols es presenta com una bona alternativa a l'ús de la llet de vaca per a la liofilització de soques de Lactobacillus spp. i de Lactococcus lactis de procedència equina. A causa de la seva composició, molt similar a la llet materna humana, pot esdevenir un bon excipient per a aliments funcionals o complements alimentaris, especialment aquells destinats a la nutrició infantil i per a persones amb intolerància a la proteïna de la llet de vaca. / Mare's milk is a traditional food in Central Asia, Mongolia and the older Soviet Union, where it has been an important source of food for their populations. In Europe mare milk consumption is relatively recent and in expansion, due to the high quality it has. Its content in carbohydrates, proteins and salts is more similar to human milk than cow. The casein’s profile is more similar to human, which makes it more digestible for children. The objectives of this Thesis are the mare's milk microbiological and enzymatic characterization, the evaluation of potential probiotic and antimicrobial capacity of lactic acid bacteria isolated, and the assessment of this milk as a protector for freeze drying processes and long-term preservation of lactic strains. The results of the microbial count analysis of raw milk from two mares show that this is, from the microbiological perspective, suitable for human consumption. It is confirmed that the mare's milk has a broad microbiome that is modified, quantitatively and qualitatively, throughout pregnancy. It has also been seen as containing a variety of constitutive enzymes detectable by commercial kits miniaturized. These enzymes have a quantitative variability during pregnancy. Of the 11 strains of lactic acid bacteria isolated from mare's milk, six showed a potential use as probiotics because of their safety and in vitro gastrointestinal conditions resistance. The strains were known as Lactobacillus plantarum 1, Lactobacillus plantarum 2, Lactobacillus plantarum 3, Lactobacillus plantarum 5 and Lactococcus brevis 2. The lactic acid bacteria isolated from equine milk and feces have an antimicrobial ability against a variety of undesirable microorganisms as Kocuria rhizophila, Pantoea sp., Klebsiella oxytoca, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Bacillus spp., Listeria monocytogenes, Enterococcus faecalis and Proteus vulgaris. Its antimicrobial action is mainly due to the formation of organic acids, but also the production of hydrogen peroxide and thermolabile compounds. The mare's milk powder is presented as a good alternative to the use of cow's milk for the freeze drying of Lactobacillus spp. and Lactococcus lactis equine strains. Due to its composition, very similar to human milk, it can be a good excipient for dietary supplements and functional foods, especially those intended for children nutrition and for people with cow's milk protein intolerance.

En el present treball s'han desenvolupat i caracteritzat biofilms per a la detoxificació d'efluents contaminats amb compostos reduïts de sofre. En primer lloc es va dissenyar un bioreactor basat en una columna il·luminada que aporta una gran i heterogènia superfície d'adhesió per als microorganismes, i en el qual no hi ha aportació externa d'oxigen. El sistema de control, basat en el potencial redox, permet mantenir constant la concentració residual de sulfur d'hidrogen en el rang micromolar, evitant la inhibició dels microorganismes i mantenint al mateix temps la qualitat de l'efluent generat.S'han realitzat tres experiments per tal de provar el sistema, el primer amb un cultiu pur de Chlorobium limicola, i després amb mostres naturals (sediment lacustre i tapet microbià) per tal d'aconseguir biofilms complexos. Els biofilms es desenvolupen ràpidament assolint-se una elevada biomassa en tots els casos. El comportament dinàmic del sistema és més lent que el dels sistemes de biomassa en suspensió, però alhora més estable a les pertorbacions. De fet, el sistema és capaç de mantenir l'oxidació de sulfurs i la qualitat de l'efluent generat fins i tot quan les condicions de llum incident o de concentració de sulfur d'hidrogen a l'entrada del sistema canvien. S'han caracteritzat els biofilms complexos amb eines clàssiques (microscopi i anàlisi de pigments) i també amb eines moleculars (biblioteques genètiques). En primer lloc, s'han avaluat diferents mètodes d'extracció d'ADN per tal de trobar el millor per a les nostres mostres. S'ha comparat l'eficiència d'extracció quantificant l'ADN obtingut, i la diversitat recuperada en cada mètode amb electroforesi en gels de gradient desnaturalitzant (DGGE). El mètode basat en un trencament mecànic amb microesferes de vidre seguit d'una lisi enzimàtica i una extracció amb fenol és el més apropiat per a l'extracció d'aquests biofilms.La caracterització del biofilms ha revelat una elevada diversitat microbiana tant a nivell filogenètic com fisiològic. Ambdós biofilms presenten una gran riquesa d'espècies així com un elevat grau de microdiversitat entre alguns grups. S'observen algunes diferències en els grups filogenètics predominants entre els dos biofilms. S'han recuperat membres relacionats amb les subclasses Alpha i Gamma del grup Proteobacteria, amb el grup Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides així com amb cloroplasts d'algues en ambdós biblioteques genètiques. A més, en el biofilm desenvolupat a partir del sediment lacustre, també s'han trobat membres de les subclasses Beta i Delta-Proteobacteria, del grup Cianobacteria i dels bacteris Gram-positius de baix contingut en G+C (Firmicutes). Per contra, la biblioteca realitzada amb el biofilm desenvolupat a partir del tapet microbià conté una elevada proporció de clons relacionats amb les Epsilon-Proteobacteria i amb els Chlorobi. Tot i que els membres trobats pertanyent a tots aquests grups filogenètics són diferents, representen els mateixos grups funcionals. El sulfhídric era oxidat anaeròbicament pels bacteris fototròfics del sofre i els bacteris vermells no del sofre, i aeròbicament pels bacteris quimiolititròfics del sofre utilitzant l'oxigen produït pels organismes fototròfics oxigènics. Altres microorganismes com els bacteris heterotròfics podrien contribuir al funcionament del sistema a través del reciclatge de la matèria orgànica.En conclusió, trobem una elevada diversitat tant a nivell funcional com taxonòmic en els biofilms desenvolupats. Diferents grups funcionals representats per diferent espècies (heterotròfiques, fotoautotròfiques i quimioautotròfiques) coexisteixen al sistema. A més, també trobem microdiversitat (similitud per sobre del nivell d'espècie en la seqüència del gen 16S ADNr). Aquesta elevada diversitat podria ser molt important per al funcionament a llarg termini del reactor. / This works deals with the development and characterization of complex sulfide-oxidizing biofilms. A bioreactor for biofilm development has been designed. The system is based on a non-aerated illuminated packed-column, which provides a large surface for microbial attachment. The reactor operates as a sulfidostat and the control system allows to maintain a constant concentration of residual sulfide in the micromolar range thus avoiding inhibition of sulfide oxidizers due to excessive sulfide load and ensuring a constant quality in the effluent.The system was first tested with a pure culture of Chlorobium limicola and, later on, with natural samples (freshwater lake sediment and a microbial mat) in order to develop complex biofilms. Biofilms developed vigorously on the column surface and high biomass was achieved in all the experiments. The dynamic behavior of the system was slower than in stirred reactors but more stable in front of sudden environmental changes. The system was able to process highly polluted effluents and to maintain the quality of the output generated even when conditions of light irradiance and sulfide income were suddenly changed. The biofilms developed were characterized using both, traditional techniques (i.e. microscopy and pigment analysis) and a molecular approach, in particular cloning and sequencing. First, of all, several DNA extraction procedures were evaluated in order to select the most suitable method for performing the diversity analysis of our biofilms. We compared the extraction efficiency (i.e. amount of DNA recovered), as well as the genetic diversity recovered by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). A DNA extraction based on a mechanical step of bead-beating followed by enzymatic lysis and by phenol-chloroform extraction, was the most appropriate protocol for these biofilms.Microbial characterization revealed that, in both cases, highly diverse biofilms covering a wide range of phylogenetic and physiologic groups had developed. Both biofilms presented high species richness and a high degree of microdiversity within some species. Some differences were observed in the predominant phylogenetic groups present in each biofilm. We recovered members affiliated to the Alpha and Gamma subclass of the Proteobacteria, the Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides group as well as plastids signatures from green algae in both biofilm libraries. Moreover, in the biofilm developed from the freshwater sample, other clones belonged to the Beta- and Delta-Proteobacteria, the Cyanobacteria and the low G+C Gram-positive whereas we recovered clones belonging to the Epsilon-Proteobacteria and to the Chlorobi only from the marine biofilm. Although members belonging to these phylogenetic groups were different in each case, they represented the same functional groups. Sulfide was oxidized both anaerobically by phototrophic sulfur bacteria and by purple nonsulfur bacteria, and aerobically by colorless sulfur bacteria using the oxygen produced by oxygenic phototrophs, as the system was non-aerated. Other groups, such heterotrophic bacteria, can also contribute to the functioning of the system by recycling organic matter. In conclusion, we found high diversity at both functional and taxonomic level. Different functional groups represented by different species (heterotrophic, photoautotrophic and chemoautotrophic microorganisms) coexisted in the bioreactor. Moreover, some of the species also showed microdiversity (similarity in 16S rDNA sequences below the species level). Such attributes could be very important for the long-term functioning and versatility of the reactor.