Although bacteria represent the simplest form of life on Earth, they have a great impact on all living beings. For example the degrader bacterium Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707 is used in bioremediation procedures for the recovery of polluted sites. Indeed, KF707 strain is know for its ability to degrade biphenyl and polychlorinated biphenyls - to which is chemotactically attracted - and to tolerate the oxydative stress due to toxic metal oxyanions such as tellurite and selenite. Moreover, in bioremediation processes, target compounds can be easily accessible to KF707 through biofilm formation. All these considerations suggest that KF707 is such a unique microorganism and this Thesis work has been focused on determining the molecular nature of some of the peculiar physiological traits of this strain. The genome project provided a large set of informations: putative genes involved in the degradation of aromatic and toxic compounds and associated to stress response were identified. Notably, multiple chemotactic operons and cheA genes were also found. Deleted mutants in the cheA genes were constructed and their role in motility, chemotaxis and biofilm formation were assessed and compared to those previously attributed to a cheA1 gene in a KF707 mutant constructed by a mini-Tn5 transposon insertion and which was impaired in motility and biofilm development. The results of this present Thesis work, taken together, were interpreted to suggest that in Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707 strain, multiple factors are involved in these networks and they might play different roles depending on the environmental conditions. The ability of KF707 strain to produce signal molecules possibly involved in cell-to-cell communication, was also investigated: lack of a lux-like QS system - which is conversely widely present in Gram negative bacteria – keeps open the question about the actual molecular nature of KF707 quorum sensing mechanism. / Sebbene i batteri rappresentino delle forme di vita semplici, essi hanno un grande impatto sulla vita di tutti gli organismi viventi. Batteri come Pseudomomas pseudoalcaligenes KF707, vengono usati per il biorisanamento di aree inquinate. Infatti KF707 ha la capacità di degradare composti tossici quali i bifenili e i poli-cloro-bifenili (ai quali risulta chemotatticamente attratto) ed è capace di mettere in atto meccanismi di difesa allo stress ossidativo procurato da ioni metallici tossici. Inoltre ha anche la capacità di aderire a superfici solide e di crescere come biofilm. Tutte queste caratteristiche fanno di KF707 un microrganismo singolare e pertanto nel presente lavoro di Tesi, sono mostrati i risultati relativi alla caratterizzarione molecolare di alcuni tratti fisiologici tipici del microrganismo. I dati derivanti dall’analisi del genoma hanno fornito informazioni riguardo la presenza di geni codificanti enzimi coinvolti nella degradazione di composti aromatici, geni coinvoli nella risposta allo stress ossidativo ed in particolare la presenza di cluster chemotattici multipli e di tre geni cheA. Mutanti deleti nei nuovi geni cheA (cheA2 e cheA3) sono stati costruiti, con lo scopo di confrontare il loro ruolo nella risposta chemiotattica e nella formazione di biofilm con quello del gene cheA1 che era stato caratterizzato in un mutante privo di motilità e di capacita di sviluppare un biofilm maturo. I risultati suggeriscono che in KF707 il network potrebbe essere molto complesso in quanto i vari componenti di diverse pathways potrebbero interagire e anche essere espressi in diverse condizioni ambientali. In più è stata valutata anche la capacità, da parte di KF707, di produrre molecole segnale coinvolte nei processi di comunicazione cellulare via quourum sensing e i risultati hanno mostrato che il ceppo non possiede un sistema lux-like tipico dei Gram negativi, aprendo nuove strade da esplorare per la ricerca di un circuito quorum sensing-like in KF707.

A consecuencia de la elevada versatilidad de sus propiedades, los tensioactivos pueden encontrase en diferentes productos de uso cotidiano, pero su posible toxicidad y falta de degradabilidad hacen que se les considere como agentes contaminantes para el medio ambiente. Por esta razón, en los últimos años, los biotensioactivos (BT) han atraído mucho la atención como una alternativa a los tensioactivos sintetizados químicamente debido principalmente a su alta biode-grabilidad y baja toxicidad. A estas propiedades remarcables se suma su posible producción a partir de materiales de desecho. El objetivo principal de la presente tesis doctoral es la producción de nuevos tensioactivos de origen bacteriano y su caracterización. La cepa 6.2S, aislada de suelos volcánicos e identificada como Sphingobacterium detergens sp. nov., es el primer microorganismo de este género descrito como productor de biotensioactivos. Después de 48 h de cultivo en el medio optimizado MCA se obtienen 466 mg/L de extracto crudo gracias al empleo de diferentes estrategias de cultivo (alimentación y control del pH) junto con la optimización de la extracción, lo que permitió aumentar la producción 7 veces con respecto al medio de crecimiento inicial (S-MSM). S. detergens produce una mezcla de compuestos con actividad superficial, tales como fosfolípidos, lípidos nitrogenados y glicolípidos. La mezcla de biotensioactivos producida por este microorganismo presenta una CAC de 2,05 g/L, una CMC de 4,9 g/L y tiene la capacidad de reducir marcadamente la tensión superficial a valores de 22 mN/m, siendo este valor el más bajo descrito en biotensioactivos. Después de una purificación realizada al extracto orgánico, se obtuvieron las fracciones A y B. La fracción A (40% del extracto orgánico) está formada por una mezcla de fosfolípidos, siendo la fosfatidiletanolamina el más abundante, reduce la tensión superficial a 33 mN/m y presenta una CMC de 0,18 g/L. La fracción B (60% del extracto orgánico) está formada por una mezcla de lípidos nitrogenados, es capaz de reducir la tensión superficial a 23 mN/m, presenta una CAC de 2,7 g/L y una CMC de 6,3 g/L. Además la mezcla de tensioactivos presentó estabilidad térmica, capacidad emulsionante y mayor eficiencia a pH ácido. Un estudio más detallado sobre las propiedades fisicoquímicas de la mezcla de BT, ha indicado que al aumentar la fuerza iónica, la CMC del extracto completo desciende a pH 3, mientras que a pH 7 la CMC no se ve afectada, indicando el carácter aniónico del BT. Además se observó que tanto la fracción completa como la fracción A forman bicapas en solución acuosa, con 5 nm de espesor y con un núcleo hidrofóbico de 1,5 nm, que puede corresponder a cadenas hidrocarbonadas (C14-18) interdigitadas. Por otro lado, el potencial Z es independiente del la concentración del biotensioactivo, obteniéndose un valor promedio de -57±9 mv. A concen-traciones inferiores a 12 g/L, el diámetro de partícula medido del extracto completo y de la fracción B es independiente de la concentración, indicando la presencia de vesículas estables. El pH presenta un efecto sobre el potencial Z y el diámetro de partícula tanto de la fracción completa como de las fracciones A y B. A pHs ácidos (3-1,5) el potencial Z tiende a neutralizarse y el diámetro de partícula a aumentar su tamaño. Finalmente el extracto orgánico producido por S. detergens presentó interesantes propiedades biológicas. La fracción B induce un 83% de hemólisis en hematíes de conejo, mientras que la fracción A un 100% de hemólisis, con una tasa de hemólisis 115 veces superior que la fracción B. La fracción B es mucho menos citotóxica que la fracción A y ambas presentan menor toxicidad que el SDS en fibroblastos y queratinocitos, indicando una baja irritabilidad dérmica. Por último la fracción A (0,2 g/L) y la fracción B (1,5 g/L) inducen la apoptosis en el 44% y en el 75% de las células cancerígenas Caco-2. / As a consequence of their high versatility, surfactants constitute large-scale production chemicals and the demand for them is expected to rise rapidly over the next few years. With the increasing importance of environmental acceptability, biosurfactants (BS) have attracted attention as alternatives to chemically synthesized surfactants, due to their biodegradability, lack of toxicity and availability from waste products. The aim of the present study was the production and characterization of new bacterial biosurfactants. Strain 6.2S, identified as Sphingobacterium detergens, was isolated from soil and was selected on the basis of its capacity to decrease surface tension. After 48 h culture in the optimized medium (MCA-lio) for BS production, 3.8 mg/mL of protein and 400 mg/L crude extract were obtained. With medium MCA, the production was increased six times from initial production. The crude extract obtained strongly reduced surface tension (22mN/m at 10 g/L), producing one of the lowest values recorded for a microorganism-produced surfactant. The BS was thermostable and surface activity improve at low pH. Chromatographic fractioning of the crude BS produced two distinct fractions. Fraction A, a phospholipids mixture, reduce surface tension to 33 mN/m and presented a CMC of 0.18 g/L. Fraction B was a mixture of lipopeptides and at least one glycolipids, reduced surface tension to 23 mN/m. The surface tension-concentration curve showed two plateaux, the first of which can be attributed to a critical aggregation concentration of the biosurfactant with a protein (2.7 g/L) and the second to the true CMC in water (6.3 g/L).

En los últimos años diversos trabajos ponen de manifiesto la existencia de variaciones intraespecíficas entre aislados de Blastocystis hominis. La descripción de diferentes perfiles proteicos, cariotipos y zimodemas constituyen pruebas de la posible existencia de poblaciones morfológicamente idénticas, que quizás estén dotadas de un potencial patogénico diferente. El objeto de este estudio es el de establecer asociaciones entre variantes genéticas y enzimáticas y distinta significación clínica, para lo cual se realizaron los siguientes procedimientos:(1) Obtener aislados clínicos de pacientes sintomáticos y asintomáticos, cultivarlos y axenizarlos.(2) Comprobar el grado de variación genética críptica en aislados de B. hominis, mediante el análisis de polimorfismo de fragmentos de restricción a partir de dos amplicones diferentes.(3) Evaluar el poder discriminatorio de secuencias repetitivas de ADN como marcadores de diversidad.(4) Demostrar la existencia de poblaciones isoenzimáticas. Se analizaron un total de 260 muestras fecales, de entre las remitidas al Servicio de Microbiología del Hospital Clínico Universitario de Valencia; que fueron sometidas al siguiente protocolo: exámen parasitológico para la identificación de B. hominis y de otros posibles parásitos; y un coprocultivo con el objeto de determinar la existencia de enteropatógenos bacterianos. Se observó B. hominis en 56 de estas muestras, lo que supuso una prevalencia del 21,5%; y se procedió a su cultivo en medio BDM para su posterior axenización, todo ello de acuerdo con el protocolo descrito por Lanuza et al. (1997). Se consiguió la adaptación al cultivo de 38 aislados, de los que se consiguió axenizar 18. Se incluyeron en el estudio 13 cultivos puros procedentes de colección, por lo que finalmente se analizaron un total de 51 aislados: 31 axénicos y 20 monoxénicos. Una vez obtenidos los aislados se llevaron a cabo los ensayos de "riboprinting" (Böhm-Gloning,1997; Clark, 1997), consistentes en amplificar la secuencia que codifica el ARN de la subunidad menor ribosomal y analizar la longitud de los fragmentos obtenidos tras restricción enzimática de dicha región. Extraído el ADN de acuerdo con el procedimiento descrito por Clark (1997) consistente en una extracción fenólica; la amplificación se realizó en dos reacciones distintas: la primera con los cebadores RD3 y RD5 (Clark, 1997) que amplifican la totalidad del gen con lo que se obtiene un amplicón de 2.540 pb; y la segunda con F1 y R1 (Böhm-Gloning et al., 1997) que amplifican sólo una parte del gen, por lo que se obtiene un producto de 1.100 pb. Los productos de amplificación fueron digeridos separadamente con las endonucleasas Rsa I, Hinf I y Alu I. Para el análisis se transformaron las distancias de migración en tamaños relativos al compararlos con marcadores de peso molecular, utilizando el programa informático 1DManager. El criterio establecido para diferenciar entre patrones de RFLP fue considerar que eran distintos los que diferían en uno o en más fragmentos. Analizados los perfiles obtenidos para cada aislado, se obtuvieron los índices de homología entre cepas aplicando el coeficiente de Dice. Los resultados obtenidos tras el análisis conjunto de todos los patrones de bandas fue la obtención de 5 ribodemas (R1 a R5), en los que se valoró si existía relación estadística entre la pertenencia a un ribodema y padecer diarrea aguda o crónica, por lo que se analizaron los datos aplicando el test CHI-CUADRADO y se definieron el riesgo relativo (RR) y el coeficiente de correlación de Pearson (p).Los resultados demostraron una asociación estadísticamente significativa entre diarrea aguda e inclusión en el ribodema R2. Lo cual nos confirmó que la especie B. hominis es genéticamente heterogénea, y que existían diferentes poblaciones con diferencias en la capacidad patogénica. En el estudio también se valoró la eficacia de secuencias repetitivas de ADN como marcadores de diversidad, para lo cual se utilizaron los cebadores TR7 y TR8 (Init et al., 1999), demostrando que se podían establecer diferencias intraespecíficas a partir de un fragmento mayoritario, es decir el que más veces se repetía, considerando que eran cepas pertenecientes al mismo patrón las que coincidían en dicho fragmento. Los resultados demostraron que esta técnica es únicamente válida en la detección de variación intraespecífica en cultivos puros, ya que los cebadores no discriminan suficientemente cuando en la muestra existe ADN bacteriano además del de B. hominis. No se encontraron asociaciones estadísticas entre la pertenencia a alguno de los patrones definidos y la presentación de un proceso diarreico determinado. Finalmente el análisis de las actividades enzimáticas: Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, malato deshidrogenasa, enzima málico, hexoquinasa, fosfoglucomutasa, glucosa fosfato isomerasa, glutámico-oxalacético transaminasa y fosfogluconato deshidrogenasa; consistió en la extracción de las proteínas de los cultivos puros, su separación en geles de poliacrilamida, y el consiguiente revelado utilizando sustancias tamponadas, con los sutratos, cofactores y coenzimas necesarios para cada enzima, de acuerdo con el protocolo de Selander et al. (1985).Todos los aislados presentaron todas las actividades enzimáticas y compartieron idéntico patrón en todos los enzimas a excepción de la malato deshidrogenasa; cuyas diferencias en la movilidad electroforética de una de sus bandas, permitió definir tres poblaciones isoenzimáticas. No se encontraron asociaciones estadísticas entre los zimodemas definidos y la presentación de un determinado proceso diarreico. Los resultados permitieron extraer las siguientes conclusiones:1ª.- Todos los métodos moleculares empleados demostraron, aunque con desigual capacidad de discriminación, que B. hominis es un organismo con marcada heterogeneidad genética.2ª.- El análisis de la secuencia del ARN ribosomal 16S, mediante técnicas de RFLP, ha detectado variantes asociadas a determinados estados mórbidos. El protocolo que utiliza los cebadores RD3 y RD5 es el que ha mostrado un mayor poder de resolución.3ª.- Consideramos que para poder comparar datos de RFLP de forma efectiva es necesaria la utilización de protocolos normalizados, con cepas de referencia, un panel común de enzimas de restricción y una nomenclatura consensuada.4ª.- El estudio de secuencias repetitivas utilizando TR7 y TR8 resulta eficaz en la detección de variación intraespecífica únicamente en aislados axénicos, lo cual limita su utilización como marcador de diversidad.5ª.- Las diferencias encontradas en la movilidad del enzima malato deshidrogenasa demostraron la existencia de tres poblaciones isoenzimáticas, son que ninguna de ellas se asociara con un proceso determinado.6ª.- La homología encontrada entre nuestros aislados y los genotipos de origen humano y animal descritos en otras áreas geográficas sustentan la idea del origen zoonótico de la infección y demuestran la ausencia de variaciones genéticas regionales. Por lo que este trabajo concluye que B. hominis es una especie genéticamente heterogénea, y la asociación estadística observada confirma además la existencia de poblaciones con diferente patogenicidad. / Blastocystis hominis is the most prevalent specie of intestinal protozoa found in men of uncertain role in human disease. This study was undertaken to examine the degree of criptic genetic variation within B. hominis detectable using riboprinting (restriction fragment length polymorphism analysis of polymerase chain reaction amplified small subunit rDNA); the analysis of multiple target sequences by a single set of polymerase chain reaction primers; and the existence of demes with different pathogenic potential after to analyse the enzyme activity. The small subunit ribosomal RNA genes of 51 isolates were amplified using standard polymerase chain reaction conditions and the primers RD5 y RD3 (Clark, CG; 1992). The amplification products were digested with 3 restriction enzymes (Hinf I, Rsa I, Alu I). We used a similar method by the primers F1 y R1 (Böhm-Gloning et al., 1997) and the same restriction endonuclease enzymes. Extensive sequence variation was discovered in B. hominis ribosomal RNA genes and the isolates grouped of at least five differents patterns or ribodemes. The ribodeme R2 was the most frequently isolated variant, is composed of isolates obtained from patients with acute diarrhea. The statistical association found between R2 and acute diarrhea in the absence of other enteropathogens suggest the pathogenic role of this ribodema. The results based on the amplification products obtaines by a single set of polymerase chain reaction primers TR7 y TR8 (Init et al., 1999) showed intrastrain variations among isolates, but this set of PCR primers only can be used in the detection of variable DNA repeat patterns in axenic cultures because the reaction is not selectivity for lower eukayotes, it is present in prokaryotes too . The enzyme polymorphism of this organism has been demostrated by enzyme electrophoresis of 31 axenic B. hominis isolates by electrophoresis on polyacrylamide gel under nondenaturating conditions (PAGE). Eight enzyme systems were studied: GOT (EC 2.6.1.1), GPI (EC 5.3.1.9), EM (EC 1.1.1.40), G6PDH (EC 1.1.1.49), 6PGDH (EC 1.1.1.44), MDH (EC 1.1.1.37), HK (EC 2.7.1.1), PGM (EC 2.7.5.1. ). The isolates showed an identical isoenzyme profile by the seven activities, in the case of MDH the presence of one band with different electrophoretic migrations detected the existence the two zimodemes. The description of different zymodemes confirms the heterogeneity of this organism. This study illustrates the need to reexamine the role of B. hominis in disease taking the genetic diversity of the parasite into account.

Los integrantes de la sección Nigri sonunos de los más importantes del género Aspergillus. De distribución ubicua, algunas de sus especies se utilizan ampliamente en la industria alimentaria y poseen la categoria de GRAS("generally regarded as safe") de la FDA. Pese a ello, se ha descrito la capacidad de elaborar ocratoxina A(OA)por parte de los integrantes del agregado A.niger, lo que supone un riesgo inesperado para la salud humana y animal. Por otro lado, la taxonomia de la seccion Nigri es una de las más complejas del genero y esta basada fundamentalmente en criterios morfologicos. En una de las últimas revisiones se creó el agregado A.niger, constituido por dos especies, seis variedades y dos formas. En un intento de clarificar la taxonomía del agregado, se ha propuesto la división del agregado en dos especies, morfológicamente indistinguibles, denominadas A.niger y A.tubingensis atendiendo a patrones de RFLP obtenidos del DNA total. En el presente trabajo se determinó la frecuencia de aparición de las especies del genero Aspergillus y en especial de las especies de la sección Nigri en piensos y materias primas y se estudió la capacidad ocratoxigénica de las cepas de esta sección. Con el fin de estudiar la distribución de las dos especies propuestas en los substratos estudiados describimos una nueva tecnica de RFLP más sencilla y fácil de interpretar y que permite diferenciar de forma más clara estos grupos de cepas. Paralelamente, se realizó un estudio de las características morfológicas macroscopicas y microscópicas de las cepas y su comportamiento a distintas temperaturas y concentraciones de NaC1. De entre los resultados obtenidos, destacamos los siguientes: Las especies del género Aspergillus se aislaron frecuentemente en los substratos estudiados, en especial en piensos. Su recuento parcial en este tipo de muestras representó más del 50% del recuento fungico total. De las especies productoras de OA aisladas en el presente estudio, la frencuencia de aislamiento de A.niger fue superior a la de A.ochraceus. Las cepas tipo de las dos especies propuestas en el agregado A.niger, A.niger CBS 55.65 y A.tubingensis CBS 134.48 resultaron estar muy próximas en terminos filogenéticos, por lo que podría tratarse de una misma especie. La digestión con RsaI del fragmento 5.8S-ITS rDNA amplificado mediante PCR fue un sistema facil, practico y rapido para clasificar cepas del agregado a.niger en dos grupos llamados N y T que se corresponden con las dos especies propuestas. Las cepas de los dos grupos N y T fueron morfológicamente indistinguibles. Las pequeñas diferencias observadas no constituyeron una característica practica para diferenciar ambos grupos. La temperatura optima de crecimiento de las cepas del agregado A.niger fue de 35º C, no desarrollándose por debajo de 10ºC, ni por encima de los 50ºC. Al considerar la división del agregado en los grupos N y T, las cepas tipo T presentaron una temperatura optima de 35ºC y las tipo N de 30-35ºC. Las cepas tipo T se diferenciaron de las tipo N por desarrollase más rapidamente a la temperatura mas baja (10ºC) en la que se obtuvo el desarrollo de las especies del agregado. El crecimiento de las cepas del agregado. A.niger se vio favorecido a concentraciones bajas de cloruro sódico, observándose una mayor tolerancia a 25º C que a 35ºC. Los grupos de cepas N y T presentaron una respuesta similar al NaC1. Todas las cepas ocratoxigenicas del agregado A.niger con patron del RFLP conocido pertenecen al grupo N, por lo que los aislamientos del grupo T parecen no ser capaces de producir OA.

El gen PGA26 del hongo dimórfico Candida albicans, también conocido como orf19.2475, CA2885 e IPF 7204, codifica una proteína GPI de pared celular putativa, cuya función hasta la fecha no ha sido establecida. Estudios previos, realizados por nuestro grupo de investigación, sobre la regeneración de la pared elular por protoplastos de C. albicans pusieron de manifiesto que el gen PGA26 está sobre-expresado a los 60 min de la regeneración de la pared celular en protoplastos. Este hallazgo podría indicar un papel importante de Pga26 en la arquitectura y/o biosíntesis de la pared celular, por ello se realizaron estudios más detallados sobre la posible funcionalidad de esta proteína. El gen PGA26 presenta dos alelos idénticos en el genoma de C. albicans y no es esencial pues la interrupción del mismo no causa letalidad; además su ausencia no afecta de manera significativa a la velocidad de crecimiento. Mediante un análisis in sílico, Pga26 posee todas las características propias de una proteína de pared celular: presencia de péptido señal en la región N-terminal, un sitio teórico de anclaje glicofosfatidilinositol (GPI) en la región C-terminal, un elevado porcentaje de serina y treonina, y presencia sitios teóricos de N-glicosilación (N-X- S/T). La carencia de proteína Pga26 funcional se manifestó en una serie de efectos, tales como una mayor sensibilidad a agentes que interfieren en la biogénesis de la pared celular, como el calcoflúor white, rojo Congo, SDS y también a la digestión con zimoliasa (complejo enzimático con actividad β-1,3-glucanasa). Estos resultados sugieren un papel importante de Pga26 en la arquitectura y/o composición de la pared celular. La respuesta de la célula a la ausencia de Pga26 se manifestó en la presencia de tres veces más de β-1,6-glucano en la pared celular del mutante homocigótico, habiendo por tanto una alteración en la relación entre los distintos polímeros que constituyen la pared celular (glucano, quitina, manoproteínas) y por ende una alteración en la composición de la pared celular. El mutante homocigótico presenta diferencias muy notables en la sensibilidad y resistencia a algunas drogas, siendo más resistente a tunicamicina y caspofungina y más sensible a ketoconazol, anfotericina B, fluconazol y posaconazol que la cepa parental. Tanto el mutante heterocigótico como el homocigótico en el gen PGA26 muestran una mayor resistencia al estrés ambiental (térmico 55 ºC y osmótico al CaCl2), siendo ligeramente más sensibles al estrés oxidativo (H2O2) en comparación con la cepa parental. Llama la atención el hecho de que la ausencia de Pga26 se manifieste, también, en una mayor velocidad en la emisión de tubos germinativos así como su capacidad para emitirlos incluso en condiciones en las que la cepa parental es incapaz de miceliar, por lo que Pga26 podría actuar como represor del proceso. El porcentaje de formación de biopelículas está aumentado en los mutantes heterocigótico (PGA26/pga26) y homocigótico (pga26/pga26), en comparación con la cepa parental. Es importante señalar la influencia de Pga26 en la virulencia de C. albicans en modelos murinos; el mutante nulo pga26/pga26 presenta una menor virulencia que la cepa parental, quedando el mutante heterocigótico en una situación intermedia, lo que indicaría un efecto dosis dependiente. Según el análisis del perfil transcripcional, la ausencia de Pga26 no altera significativamente la expresión de otros genes, bajo las condiciones estudiadas. / Pga26 is a putative GPI-anchored protein, also known as orf19.2475, CA2885 and IPF 7204, of unknown function. Previous studies performed by our group found that PGA26 is induced in protoplast during cell wall regeneration, for this reason we decided select it for a deeper study. The deduced amino acid sequence showed that Pga26 contains an N-terminal hydrophobic signal; it is rich in serine (10.7%) and threonine (17.6%) amino acids, has a putative N-glycosylation signal and a potential GPI (glycosylphosphatidylinositol) attachment signal. To investigate the possible role of PGA26, construction of null mutant by targeted gene disruption and analysis of the resulting phenotype was carried out. Homozygous mutant pga26/pga26 had an increased sensitivity to calcofluor white, Congo red, SDS and zymolyase, when compared with the parental strain, indicating changes in the cell wall. The analysis of the cell wall polymers composition showed that the null mutant has a bigger amount of β- 1,6 glucan than the parental strain. These results suggest that the lack of PGA26 leads to a defective cell wall. It is interesting to point out that the kinetic of the germ tube formation and the biofilm formation was increased in pga26/pga26 strain. We analyzed the behaviour of the mutants to different stress conditions. The pga26 null mutant strain was more resistant to osmotic stress (CaCl2) and heat shock (55ºC) than the parental one. The effect of different drugs, such as Tunicamycin, Amphotericin B and Ketoconazole, were also analyzed. The homozygous mutant was more resistant to Tunicamycin and Caspofungin but more sensitive to Amphotericin B, Ketoconazole, Fluconazole and Posaconazole than the parental strain. The null mutant showed a reduced virulence, in a murine model than the parental strain, evidencing that the presence of Pga26 is important to the virulence of C. albicans. Transcriptional profiling studies of pga26/pga26 revealed that the absence of Pga26 almost does not alter the expression of other genes, under the studied conditions.

The genus Aeromonas comprises 26 currently recognized species, some of them divided in to several subspecies. They are ubiquitous in fresh water, but found in chlorinated, brackish and marine water. Aeromonas strains are obtained from a wide variety of foods, as well as clinical samples. Aeromonas species are the cause of intestinal and extra-intestinal infections although the mechanisms that cause bacterial diarrhoea are not yet clearly established. The “A. hydrophila complex” (A. hydrophila, A. salmonicida, A. bestiarum, A. piscicola and A. popoffii), includes A. salmonicida, an important pathogen of fish, and A. hydrophila, an opportunistic pathogen in humans. The virulence of these species is multifactorial and involves complex pathogenic mechanisms associated with toxins (cytotoxic and cytotonic), proteases, haemolysins, lipases, adhesins, agglutinins, pili, etc. A phylogenetic study was performed from a collection of 128 strains belonging to the “A. hydrophila complex", determining partial sequences of dnaJ, cpn60, gyrB and rpoD genes, this analysis allowed us to clarify the taxonomy of this group of Aeromonas species, showing a polyphyletic origin that challenges the existence of the group as such. The population analysis of the studied strains revealed as strong linkage disequilibrium, typical of a clonal population, and a high genetic diversity. We also studied the prevalence and distribution of different virulence factors in the population to establish its pathogenic potential. For this purpose, we determined several enzymatic activities and the antibiotic sensitivity profile of these strains. We also detected the presence of act (aerolysin), alt (cytotonic toxin) and ast (cytotonic toxin) genes by PCR as well as the adhesion capacity and cytopathic effect of the strains on the Caco-2 cell line. The results obtained revealed a high pathogenic of potential the studied Aeromonas strains, regardless of their origin. / El género Aeromonas está constituido actualmente por 26 especies reconocidas, algunas de las cuales incluyen varias subespecies. Son habitantes ubicuos del agua dulce, pero también de aguas cloradas, salobres y marinas. Se han obtenido cepas de Aeromonas de una amplia variedad de alimentos, y se han aislado de muestras clínicas. Algunas especies de Aeromonas son causantes de infecciones intestinales y extraintestinales aunque los mecanismos por los que causan diarreas bacterianas no están todavía establecidos de manera clara. Dentro del “complejo A. hydrophila” (A. hydrophila, A. salmonicida, A. bestiarum, A. piscicola y A. popoffii), hay que destacar A. salmonicida como patógeno importante de peces y A. hydrophila como patógeno oportunista de humanos. La virulencia de estas especies es multifactorial e implica mecanismos de patogenicidad complejos asociados a toxinas (citotóxicas y citotónicas), proteasas, hemolisinas, lipasas, adhesinas, aglutininas, pili, etc. A partir de una colección de 128 de cepas del “complejo A. hydrophila”, se ha realizado un estudio filogenético, poblacional y de factores de patogenicidad. El estudio filogenético con las secuencias parciales de los genes cpn60, dnaJ, gyrB, y rpoD, ha permitido clarificar la taxonomía de las especies del “complejo A. hydrophila”, demostrándose que posee un origen polifilético que cuestionaría la posible existencia del grupo como tal. El análisis de la población de las cepas estudiadas revela un fuerte desequilibrio de ligamiento, típico de una población clonal, y una elevada diversidad genética. También se ha estudiado la prevalencia y distribución de diversos factores de virulencia en la población estudiada para poder establecer su potencial patogénico. Para ello se han determinado actividades enzimáticas, el perfil de sensibilidad a antibióticos, la detección por PCR de los genes act (aerolisina/hemolisina), alt (toxina citotónica) y ast (toxina citotónica), y la capacidad de adherencia y efecto citopático de las cepas en la línea celular Caco-2. Los resultados obtenidos revelan un elevado potencial patogénico de las cepas de Aeromonas estudiadas, independientemente de su origen.

Vegeu resum1de2.pdf i resum2de2.pdf

Les lipoxigenases són conegudes com les responsables de la catàlisi d'oxigenació molecular d’àcids grassos poli-insaturats que forma un producte hydroperoxid (tòxic) que es pot convertir en una gran varietat de metabòlits secundaris. Durant anys, la presència de lipoxgenases ha estat descrita únicament en organismes eucariotes, mamífers, plantes, petits invertebrats marins i fongs. La funció biològica de les lipoxigenases eucariotes ha estat àmpliament estudiada. Estan involucrades en la síntesi de molècules de senyalització com els leucotriens, en mamífers, o en la de l’àcid jasmònic, en plantes. L’any 1964, Shimahara, publicava la presència d’una lipoxigenasa en un bacteri gram-negatiu aïllat de les escombraries. Encara avui són poques les informacions referents a lipoxigenases bacterianes que s'han publicat, alguns exemples són les de Thermoactinomyces vulgaris, Pseudomonas i Nostoc punctiforme. Els anàlisis que s’han realitzat utilitzant el programa BLAST, indiquen que hi ha gens “LOX-like” en Shewanella, Burkolderia, Nitrosomonas i Myxococcus, però la funció biològica de lipoxigenases procariotes encara no s'ha aclarit. No obstant, les lipoxigenases publicades en la base de dades “gene data-bank” són d’organismes ambientals de medi marí i de sòls, això suggereix que les lipoxigenases poden tenir un paper important en la biodegradació. En aquest estudi es reporta la primera estructura molecular d'una lipoxigenasa procariota i un estudi preliminar de la filogènia d’aquest grup de proteïnes. / The lipoxygenases are known as responsible for the reaction of oxygenation of poly-unsaturated fatty acid producing hydroperoxid acids (toxic) that can be converted into a different secondary metabolites. For years, the presence of lipoxygenases has been described only in eukaryotes, mammals, plants, fungi and small invertebrates. The biological function of eukaryotic lipoxygenases has been widely studied. They are involved in the synthesis of leukotrienes as signaling molecules in mammals, or in the jasmonic acid in plants. In 1964, Shimahara, published the existence of lipoxygenases of gram-negative bacteria isolated from the trash. Even today there are few data concerning bacterial lipoxygenases published. Some examples are those of Thermoactinomyces vulgaris, Pseudomonas and Nostoc punctiforme. The analysis were performed using the BLAST program and the results indicate that there are "LOX-like" genes in Shewanella, Burkolderia, Nitrosomonas and Myxococcus, but the biological function of prokaryotic lipoxygenases is not yet clear. However, lipoxygenases published in the database "gene data-bank" are marine organisms and environmental grounds, suggesting that the lipoxygenases can play an important role in biodegradation. This study reports the first molecular structure of a prokaryotic lipoxygenasa and a preliminary study of the phylogeny of this group of proteins.

Aquest apartat és un resum general del seguit de capítols que estructuren aquesta tesi doctoral. En aquest sentit es presenta una revisió bibliogràfica al voltant dels sistemes de tractament de gasos contaminants, centrant la introducció en el contaminant d’estudi, l’H2S, i els sistemes de tractament biològic. De manera similar, es presenta un apartat introductori al voltant dels bacteris sulfur‐oxidants. Complementant aquesta part, es fa un recull descriptiu de diferents tècniques de biologia molecular, basades en marcadors filogenètics moleculars, per a l’estudi de comunitats microbianes. Per últim, es presenta una revisió de les diferents tecnologies de seqüenciació de DNA de nova generació amb la intenció d’introduir i fonamentar l’aproximació bio‐òmica per a l’estudi de comunitats microbianes complexes. Seguidament en el segon capítol d’aquesta tesi, es desenvolupa un primer estudi al voltant de la posada en marxa i operació del biofiltre percolador de dessulfuració d’alta càrrega d’H2S, mitjançant la configuració d’un nou material de rebliment inorgànic desordenat. En base al monitoratge de diferents paràmetres, s’aconsegueix optimitzar el règim d’operació establint unes noves condicions d’operació que minimitzen la generació de sofre inorgànic en el bioreactor. En el tercer capítol, i com a aproximació inicial en l’estudi de les comunitats microbianes del bioreactor, es construeixen per a dos moments operacionals separats en el temps, dues llibreries gèniques de 16S rRNA. En base a la identificació d’espècies realitzada per seqüenciació dels fragments clonats, es seleccionen diverses espècies microbianes sulfur‐oxidants amb intenció d’estudiar la seva adaptació i dinàmica al llarg de l’operació. Mitjançant la tècnica FISH es visualitzen i quantifiquen aquestes espècies sulfur‐oxidants, realitzant un seguiment a diferents altures del cos del bioreactor permetent analitzar la dinàmica poblacional dels microorganismes hibridats.  Complementant l’estudi realitzat per a la caracterització i el seguiment de poblacions microbianes, en el capítol quatre d’aquesta tesi es descriu el procés d’optimització de la metodologia necessària per a la realització de l’estudi metatranscriptòmic de les comunitats microbianes del biofitre. En aquest capítol es descriuen, per als diferents processos experimentals implementats, els resultats obtinguts amb l’objectiu d’optimitzar els rendiments d’extracció i purificació de mRNA. Finalment, assolits els rendiments necessaris tant en termes de quantitat com de qualitat, es presenta el protocol optimitzat per a la preparació de les mostres seqüenciades en la plataforma GS FLX de Roche&454. Finalment en l’estudi metatranscriptòmic presentat en el capítol cinc, es processen tres mostres corresponents a diferents zones del biofiltre. Inicialment s’apliquen diferents estratègies d’assemblatge de les lectures amb intenció d’optimitzar el càlcul d’assemblatge. Mitjançant l’anàlisi bioinformàtica es realitza la interpretació del metatranscriptoma referit a cada una de les zones de mostreig. Es quantifiquen els nivells d’expressió per a cada un dels contigs generats permetent l’anàlisi comparativa del grau d’expressió dels gens del biofiltre a diferents altures. / This section is an overview of the different chapters that outline this thesis. In this sense it is presented a bibliographical review about the polluting gas treatment systems, focusing on the introduction of the contaminant study, H2S, and biological treatment systems. Similarly, there is an introductory section about sulfur‐oxidizing bacteria. Complementing this part includes a summary description of various molecular biology techniques based on molecular phylogenetic markers for the study of microbial communities. Finally, it is presented a review of new generation DNA sequencing technologies with the intention of introducing and establishing the bio‐omic approach for studying complex microbial communities. Then in the second chapter of this thesis, is developed a first study about biotrickling filter operation for desulfurization of high H2S loads by setting a new disordered inorganic packing material. Based on the monitoring of various parameters the system operation is optimized and established in new operating conditions that minimize the generation of inorganic sulfur in the bioreactor. In the third chapter, as initial approach to the study the microbial diversity in the bioreactor, two libraries of 16S rRNA genes are generated for two separate operational periods. Based on species identification performed by sequencing of cloned fragments, it has been selected several sulfur‐oxidizing species with the intention to study the community dynamics during the start up and bioreactor operation. Using the FISH technique, these sulfur‐oxidizing species have been identified and quantified, withdrawing biomass at different heights of the bioreactor to analyze the population dynamics of microorganisms hybridized. Complementing the study for the characterization and monitoring of microbial populations, the chapter four of this thesis describes the experimentation and optimization of the procedure to develop a metatranscriptomic work of microbial communities of the biofilter.  This chapter describes the results obtained for different experimental procedures, with the aim of optimizing the yields of extraction and purification of mRNA. Finally achieved the required yields in terms of both quantity and quality, it is presented the optimized protocol for samples preparation to be sequenced in the GS FLX platform Roche & 454. In chapter five, are processed three metatranscriptomic samples from different areas of the biofilter. As initial procedure, different assembly strategies are experimented with the intention to optimize the assembly calculation of sequencing lectures. By bioinformatic analysis are performed the expression levels quantification for each contig generated, allowing comparative analysis of degree expression at different biofilter heights. In parallel, is performed a similarity search in different databases in search of specific functional annotation. With intention to extend the functional annotation of the resulting metatranscriptomes it is presented the characterization of contigs obtained by the analysis of gene ontology for each sequence. The enormous volume of sequence information generated is presented as a description of the global gene expression referring to different parts of the bioreactor desulfurization of high H2S load.  Finally, the last chapter of the thesis presents a summary of the conclusions reached in this work, as well as a description of the possible continuation of this thesis study.

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