Se ha estudiado el efecto de la alimentación en las zonas húmedas construidas de flujo sub_superficial horizontal, en la eficacia y eficiencia para eliminación de materia orgánica, nutrientes y microorganismos, de las aguas residuales municipales. El fin perseguido es dar aportes en la gestión de este tipo de tratamientos, comunes en pequeñas comunidades (de menos de 1000 habitantes). Para lograr ese objetivo general, se realizó el estudio en unas zonas húmedas construidas piloto en la EDAR de Montcada i Reixac, así como también se estudiaron los casos de las zonas húmedas localizadas a ambos márgenes del río Besòs, la EDAR de Els Hostalets de Pierola y el sistema de zonas húmedas terciarias del río Ripoll. En la EDAR de Montcada i Reixac, se analizaron los desempeño de 4 de las zonas húmedas piloto, de las cuales, dos operaban con cubierta vegetal de Phragmites australis, mientras las otras dos no la poseían. Además dos de las zonas húmedas operaron con alimentación continua, mientras que las otras dos lo realizaron de manera fraccionada, manteniendo constante la carga hidráulica en cada una de ellas. Asimismo se analizaron cuatro estudios de caso, con diferentes calidades del influente: dos de ellos empleado las zonas húmedas como mejorador paisajístico, en dos parques fluviales. Un tercer estudio de caso se realizó empleando como influente agua residual de una porqueriza (con elevados valores de materia orgánica). El último estudio de caso se realizó en la EDAR de Els Hostalets de Pierola, que permite la operación de su zona húmeda, como un tratamiento secundario o terciario. Se observa que la alimentación fraccionada mejora notablemente la eficiencia en la reducción de materia orgánica, nutrientes y microorganismos: Esto debido a que el humedal construido, logra mejorar sus condiciones aeróbicas, por lo que se facilita la eliminación de materia orgánica mediante mecanismos aeróbicos, así como la oxidación de los compuestos nitrogenados, fomentando la formación de nitratos los cuales posteriormente son eliminados en las zonas anaerobias de la zona húmeda. De los estudios de caso se puede señalar varias conclusiones: La primera de ellas es que las zonas húmedas construidas son sistemas muy nobles que permiten una amplia variación en la carga del influente, tanto de carga hidráulica como de carga contaminante. Sin embargo, se debe asegurar una adecuada composición C/N (expresada como DQO/N-NO3) para que las bacterias logren realizar los procesos de nitrificación/ desnitrificación y asi eliminar el nitrógeno del agua. Otra de las conclusiones obtenidas al realizarse los estudios de caso, es que la alimentación interrumpida (con periodos de llenado y vaciado del mismo), mejora las condiciones de eliminación de materia orgánica, no así de la eliminación de nutrientes. Finalmente se detallan una serie de acciones a realizar por el gestor del humedal artificial, para llegar a mejorar la eficiencia y eficacia de las zonas húmedas construidas de flujo subsuperficial horizontal. / This study is mainly focused in the feeding effect for effectiveness and efficiency at horizontal subsurface flow constructed wetlands, for organic matter, nutrients and microorganism removal, from municipal wastewater. The main objective is to provide guides for the management of this type of wastewater treatment, commonly used at small communities (with less than 1000 inhabitants) To achieve this overall objective, the study was conducted in some pilots wetlands at the Montcada and Reixac´s WWTP (Barcelona, Spain), and also some test were carry on as case studies in other constructed wetlands. Four pilot wetlands were tested at the WWTP of Montcada andi Reixac. Two of these pilots were operating with vegetation cover (Phragmites australis), while the other two had not. Furthermore two pilot wetlands operated with continuous feeding, while the other two it performed fractionally but maintaining constant the hydraulic load in each one. The four case studies where take with different qualities of influent: two of them used the constructed wetland’s effluent, to improve the water quality of two rivers: the Besos´s river and the Ripoll´s river. The third case study was performed by using influent wastewater as a pigsty (with high values of organic matter, and nutrients). And the final case study was conducted in the Els Hostales de Pierola´s WWTP which allows the operation of its constructed wetland as a secondary or tertiary treatment. The study shows that fractional feeding improves the efficiency for organic matter and nutrients removal. Mainly, this is due to the aeration improving by the fractional feeding and by this way, is possible to increase the nitrification rate. So, the constructed wetlands allow the nitrification and the denitrification to take place and by this way nutrients (as nitrogen) can be removed. From the case studies several points can be indicated as main conclusions: The first is that constructed wetlands are very noble treatments systems, because they allow a wide variation in the influent load (by hydraulic and pollutant load). However, an appropriate C/N relation (expressed as COD/NNO3) had to achieve in order to increase bacteria perfom of nitrification/denitrification rates. By frequent interrupting feeding (with periods of filling and emptying of the wastewater), the constructed wetlands increase the organic matter removal, but not the nutrients removal.

El sistema SOS es una respuesta génica global muy extendida dentro del dominio Bacteria que se induce en presencia de lesiones en el DNA y permite la reparación del material genético y la supervivencia celular. La activación del sistema SOS no sólo genera un aumento en la expresión de genes que codifican las proteínas reguladoras del sistema, LexA (represor transcripcional) y RecA (proteína activadora), o de otros genes involucrados en procesos de reparación del DNA, recombinación o inhibición de la división celular. La activación del sistema SOS también está asociada a la expresión de toxinas, la inducción del ciclo lítico de profagos residentes, la expresión y diseminación de resistencias a antibióticos y la transferencia horizontal de islas de patogenicidad y elementos conjugativos. Todo ello sugiere la implicación del sistema SOS en el desarrollo del proceso infectivo. Asimismo, mutantes defectivos en el gen recA de diversos patógenos bacterianos son atenuados, demostrando la importancia de la proteína activadora del sistema en la virulencia. Sin embargo, además de actuar como activadora del sistema SOS, RecA es la principal responsable de los procesos de recombinación homóloga. Esta doble función de la proteína RecA ha impedido establecer si es la incapacidad para inducir la respuesta SOS o la incapacidad para realizar recombinación homóloga la responsable de la atenuación de los mutantes defectivos en recA. Por este motivo, el objetivo principal de este trabajo ha sido determinar el papel del sistema SOS y de la proteína RecA en el proceso infectivo de Salmonella enterica sv. Typhimurium (S. Typhimurium), uno de los principales agentes causales de toxiinfección alimentaria a nivel mundial. Los resultados obtenidos en este estudio demuestran que la sobreexpresión de recA genera un descenso significativo en la capacidad infectiva de este patógeno, lo que indica que durante la infección por S. Typhimurium es necesario el mantenimiento de unos niveles basales de expresión de dicho gen. Asimismo, las pruebas realizadas demuestran que la sobreexpresión de recA genera un descenso en la capacidad para invadir células epiteliales y para traspasar el epitelio intestinal, dos procesos esenciales para que S. Typhimurium pueda establecerse en el intestino y causar infección. De igual modo, este trabajo demuestra que la acumulación de proteína RecA en el interior celular inhibe el movimiento en enjambre (o swarming), un movimiento poblacional sobre superficies semisólidas asociado a la capacidad de numerosos patógenos, entre ellos S. enterica, para invadir tejido epitelial. Esta inhibición tiene lugar a través de la interacción de la proteína RecA con la proteína CheW, implicada en la ruta de señalización de quimiotaxis asociada a este movimiento. Por lo tanto, los resultados de este trabajo añaden el movimiento poblacional a la lista de procesos celulares conocidos que se asocian al sistema SOS y confieren una nueva función a este sistema y a la proteína RecA como reguladores de dicho movimiento en S. Typhimurium. De este modo, la inducción de la respuesta SOS en entornos lesivos para el DNA inhibe el movimiento en enjambre e impide el acercamiento de las células a entornos con concentraciones mayores de compuestos lesivos. / The SOS response is a wide-spread regulatory network in the Bacteria domain. Induction of this response occurs in the presence of DNA lesions and it is targeted to address DNA damage and to allow cell survival. The induction of the SOS response causes an increase in the expression of the genes encoding for the system regulatory proteins, LexA (the transcriptional repressor) and RecA (the activator protein), and an increase in the expression of other genes involved in DNA repair processes, homologous recombination and inhibition of cell division. But the induction of the SOS response is also associated with the expression of toxins, the induction of the lytic cicle of resident prophages, the expression and horizontal dissemination of antibiotic resistances, and the horizontal dissemination of pathogenicity islands and integrating conjugative elements. These data suggest that the SOS system plays a key role during the infection process. Moreover, recA mutants of several pathogenic bacteria are avirulent. This demonstrates that the SOS activator is involved in virulence. However, besides acting as the activator of the SOS system, RecA is primarily responsible for the homologous recombination processes. Due to the dual role of the RecA protein, the decrease in virulence of the recA mutants may be attributed either to the reduction of the recombination frequency, or to the inhibition of the SOS system induction, or to both processes. The aim of this work is to elucidate the role developed by the SOS system and by the RecA protein during the infection process of Salmonella enterica sv. Typhimurium (S. Typhimurium), one of the most important pathogens causing foodborne outbrakes in the world. The results obtained in this work show that the overexpression of the recA gene causes a significant decrease in the fitness of this pathogen. Thus, the expression of this gene must remain at its basal level during the infection process developed by S. Typhimurium. Moreover, the overexpression of the recA gene causes a decrease in the ability of this pathogen to invade epithelial cells and to pass through the intestinal epithelium, two essential processes allowing S. Typhimurium to cause the infection. Furthermore, this work demonstrates that the increase in the intracellular concentration of the RecA protein inhibits swarming motility, a multicellular movement over semisolid surfaces associated with the ability of several pathogens, including S. enterica, to invade epithelial cells. This inhibition is caused by the interaction between the RecA protein and the CheW protein, which is associated to the chemotaxis system. The results exposed in this work increase the number of known cellular processes that are associated to the SOS response, conferring a new role on this system and on the RecA protein as regulators of swarming motility in S. Typhimurium. In this context, the induction of the SOS response in the presence of DNA damaging compounds inhibits this kind of motility, avoiding the exposure of the cells to even higher concentrations of such compounds.

Les anomalies cromosòmiques numèriques i estructurals, són sovint causa d'infertilitat. Es conegut el fet que els homes portadors de translocacions recíproques equilibrades presenten un increment en la incidència de pèrdues embrionàries i de descendència afectada. La característica principal de l'espermatogènesi d'aquests pacients és la presència d'un tetravalente que permet l'aparellament a paquité dels cromosomes reorganitzats amb els seus homòlegs. La configuració del tetravalent determina el seu comportament i, conseqüentment, la producció de diferents proporcions de gàmetes equilibrades i desequilibrades. La seva estructura està condicionada pels fenòmens de recombinació. Diferents factores poden alterar la freqüència de recombinacions dins el tetravalente, com per exemple la morfologia dels cromosomes implicats i la llargada dels segments intersticials i translocats. Els cromosomes translocats poden segregar seguint quatre patrons diferents: alternant, adjacent I, adjacent II i 3:1. El fenotip alternant és el més freqüent, i també és l'únic que pot donar lloc a descendència normal. Cal remarcar que, en el cas que ocorri una recombinació intersticial, el fenotip alternant també pot produir-se a partir de la segregació adjacent I.En aquest treball, hem analitzat mostres d'esperma i/o biòpsies testiculars en cinc pacients portadors de les següents translocacions: t(4;8)(q28;p23), t(1;13)(q41;q22), t(3;19)(p21;p13.3) t(11;17)(q13.1;p11.2) i t(10;14)(q24;q32). L'ús de tècniques d'hibridació in situ fluorescent (FISH) ha permès establir els percentatges de gàmetes equilibrades i desequilibrades per a cada un dels pacients. Els resultats obtinguts oscil·len entre 30.5% i 44.3% per a les formes equilibrades, i entre 55.7% i 69.5% per a les desequilibrades. La segregació meiòtica del portador de la t(4;8)(q28;p23) es va determinar a partir de dues metodologies diferents, el sistema hàmster-humà i la tècnica de nuclis d'espermatozoide descondensats. La comparació dels resultats obtinguts no mostrà diferències significatives entre el total de gàmetes equilibrades i desequilibrades. No obstant, les freqüències de la segregació 3:1 obtingudes en els dos anàlisis sí foren significativament diferents (p<0.0001). Aquesta diferència es podria explicar per factors limitants de cada una de les tècniques (una mala eficiència d'hibridació o una descondensació excesiva del DNA poden donar lloc a guanys o pèrdues aparents de senyals fluorescents).L'ús de FISH sobre nuclis descondensats també permet la detecció de possibles efectes intercromosòmics (ICE). Els resultats obtinguts en l'anàlisi realitzat en els cinc pacients no evidencia la presència d'ICE, excepte en el portador de la t(4;8).L'aplicació de FISH sobre cromosomes meiòtics dels portadors t(11;17) i t(10;14) ha permès la identificació dels cromosomes translocats en estadi de MI i MII. Així, s'han obtingut dades relatives a la configuració del tetravalent, a la distribució de les recombinacions en el tetravalent i a la segregació dels cromosomes. Els resultats obtinguts mostren una disminució en el nombre de recombinacions per cèl·lula en la t(11;17) (p=0.001). En la t(10;14), la freqüència de recombinació en el segment intersticial és major que l'observada en bivalents controls dels cromosomes 10 i 14. També s'ha analitzat el comportament dels cromosomes sexuals al llarg del procés meiòtic. La incidència de les anomalies sexuals disminueix a mesura que avança l'espermatogènesi. Resumint, els nostres resultats suggereixen que el bloqueig meiòtic estaria més condicionat per la presència d'univalents que per la presència de desequilibris cromosòmics originats durant la segregació del tetravalent. Finalment, hem aplicat la tècnica de cenM-FISH sobre extensions de complexes sinaptonemals, prèviament detectades mitjançant immunocitogenètica, identificant cada un dels bivalents en el 92% de les cèl·lules analitzades (n=60). Posteriorment, els bivalents es poden cariotipar en estadi de paquitè. La tècnica de cenM-FISH pot ser molt útil per a la caracterització simultània de tots els bivalents en paquitè. / As it is well known, chromosome aberrations are a major cause of infertility. Moreover, male heterozygous carriers of reciprocal translocation have an increased risk of pregnancy loss and the birth of handicapped progeny. The main particularity of the spermatogenesis in human male translocation carriers is the way the translocated chromosomes found to associate themselves during the meiosis I. This structure is known as quadrivalent. The configuration of the quadrivalent determines the behaviour of this structure, and consequently the production of different proportions of balanced and unbalanced gametes. The quadrivalent structure's configuration is strongly defined by the formation of crossing-over. Different factors can affect the likelihood of crossing-over within the quadrivalent: the morphology of the chromosomes involved and the length of the interstitial and translocated segments are some of them. Translocated chromosomes segregate following one of the four possible segregation modes: alternate, adjacent I, adjacent II and 3:1. The predominant forms of segregation are alternate and adjacent I. Alternate phenotype is the most common found in many of the translocations studied and it is also the only phenotype that yields normal offspring. It is important to observe that if an interstitial chiasma occurs, alternate phenotypes may also be generated by an adjacent I segregation, and vice versa. In this study, meiotic analysis has been performed by either sperm data (human-hamster system or decondensed sperm nuclei) or testicular biopsy analysis in five different translocation carriers, t(4;8)(q28;p23), t(1;13)(q41;q22), t(3;19)(p21;p13.3) t(11;17)(q13.1;p11.2) and t(10;14)(q24;q32) . Using fluorescence in situ hybridisation techniques (FISH), percentages of balanced and unbalanced spermatozoa have been established for each carrier. The results obtained range between 30.5% and 44.3% for balanced and 55.7% and 69.5% for unbalanced gametes. Part of this work was the determination of meiotic segregation of a t(4;8)(q28;p23) carrier by two different methods, human-hamster system and sperm nuclei. Comparison made between the results obtained in the two analyses showed a lack of statistical differences between the total of balanced versus unbalanced forms. However, a statistically significant difference was found between the frequencies of 3:1 segregants obtained from the two methods (p<0.0001). Technical artefacts could explain this discrepancy (overlapping of signals in the sperm nuclei assay, unequal hybridisation efficiency of the used probes or even an over decondensation of the DNA can lead to apparent gains of fluorescent signals). FISH on decondensed sperm nuclei also allows for the detection of interchromosomal effects. Results obtained in the aneuploidy analysis performed on all five subjects have not shown any evidence for an interchromosomal effect, except for t(4;8) carrier.FISH has also been applied on meiotic chromosome spreads to identify translocated chromosomes in two different translocation carriers, t(11;17) and t(10;14). In doing so, data about pairing of homologous chromosomes, configurations of the quadrivalent, crossing-over distributions within a tetravalent, and segregation pattern frequencies have been obtained. Results obtained have shown a significant decrease in the chiasma frequency per cell in t(11;17) (p=0.001). In t(10;14), the recombination frequency within the interstitial segment of the quadrivalent is higher than the observed in control bivalents of chromosomes 10 and 14. The behaviour of sex chromosomes throughout meiotic process has been analysed. The incidence of sex anomalies decreased progressively in subsequent spermatogenic stages. Our results suggest that meiotic arrest processes would be more conditioned by the presence of univalents rather than by chromosomal unbalances. Finally, cenM-FISH has been applied on synaptonemal complexes spreads previously analysed using immunocytogenetic technique, allowing us to unequivocally identify all chromosomes in 92% of the studied cells (n=60). Then, bivalents can be karyotyped at pachytene stage. CenM-FISH can be a very useful tool for the simultaneous characterization of all pachytene chromosomes.

INTRODUCCIÓN: Los aminoglucósidos han ido perdiendo su lugar en el arsenal terapéutico para combatir las infecciones por enterobacterias, en parte debido al surgimiento de otros antibióticos de mayor espectro y menor toxicidad, como las cefalosporinas de 3a y 4a generación o las fluoroquinolonas, y en parte al incremento de resistencias, debidas fundamentalmente a la presencia de enzimas modificadoras de aminoglucósidos (EMAG). Sin embargo, tras la aparición de cepas multiresistentes para las que las alternativas terapéuticas son muy limitadas, los aminoglucósidos recuperaron importancia en el tratamiento de infecciones, especialmente en el medio hospitalario. En el laboratorio de Microbiología Clínica los aminoglucósidos representan un grupo de antimicrobianos para los que es difícil la interpretación del antibiograma de disco difusión. OBJETIVOS: Conocer la prevalencia de resistencia a aminoglucósidos en Enterobacteriaceae en nuestro medio y la prevalencia de genes de EMAG, así como las características fenotípicas de los halos de inhibición. Determinar la asociación entre la resistencia por técnica de disco difusión, la presencia de genes de EMAG y las características fenotípicas del borde del halo de inhibición, creando reglas que ayuden a la interpretación del antibiograma de disco difusión de aminoglucósidos en Enterobacteriaceae. METODOLOGÍA: Se ha realizado un estudio transversal descriptivo y observacional en el que se han analizado 788 aislados de enterobacterias aisladas entre el 1 de Enero de 2006 y el 31 de Marzo de 2006 en el Hospital de la Santa Creu i Sant Pau de Barcelona, España. Estudio de la sensibilidad a kanamicina, gentamicina, tobramicina, amikacina, netilmicina, neomicina, estreptomicina y espectinomicina por técnica de disco difusión, detección de los genes aph(3")-Ia, aph(3")-Ib, ant(3")-Ia, aph(3')-Ia, ant(2")-Ia, aac(3)-IIa, aac(6')-Ia, aac(6')-Ib, aac(6')-Ic, aac(3)-Ia, aac(3)-Ib, aac(2')-Ia mediante la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Estudio de relación clonal de los aislados mediante ERIC-PCR y PFGE. RESULTADOS y CONCLUSIONES: La sensibilidad a los antimicrobianos en Enterobacteriaceae entre 2004 y 2006 en el Hospital de la Santa Creu i Sant Pau se ha mantenido estable en el grupo de los betalactámicos, mientras que ha aumentado un 30% la resistencia a las quinolonas y ha aparecido resistencia a amikacina, manteniéndose la resistencia a gentamicina y tobramicina menor al 10%. El patrón de resistencia a aminoglucósidos más prevalente fue el provocado por aph(3’’)-Ib que confiere resistencia a estreptomicina, presente en un tercio de los aislados resistentes a alguno de los aminoglucósidos estudiados. De los patrones que afectan aminoglucósidos de uso clínico, el más prevalente fue el provocado por aac(3)-IIa: resistencia a gentamicina y tobramicina, presente en el 60% de los aislados con resistencias a aminoglucósidos de uso clínico. La presencia de características fenotípicas en los halos de inhibición (halo cortante y salto de colonias) se asoció de manera significativa con la presencia de genes de EMAG en los 8 aminoglucósidos evaluados. / INTRODUCTION: Aminoglycosides have been losing their place in the therapeutic arsenal for combating enterobacterial infections, partly due to the emergence of other antibiotics greater spectrum and lower toxicity, such as cephalosporins or 3rd and 4th generation fluoroquinolones, and partly the increase of resistance, mainly due to the presence of aminoglycoside modifying enzymes (AME). However, after the emergence of multi-resistant strains for which therapeutic options are very limited, aminoglycosides regained importance in the treatment of infections, especially in hospitals. In the Clinical Microbiology Laboratory aminoglycoside antibiotics represent a group that is difficult for the interpretative reading of disk diffusion antibiogram. OBJECTIVES: To determine the prevalence of aminoglycoside resistance in Enterobacteriaceae in our area, the prevalence of AME genes and phenotypic characteristics of the inhibition zone edge. To determine the association between resistance by disk diffusion technique, the presence of AME genes and phenotypic features of the inhibition zone edge, creating rules to assist the interpretative reading of disk diffusion antibiogram of aminoglycosides in Enterobacteriaceae METHODS: We performed an observational descriptive study which analyzed 788 isolates of Enterobacteriaceae isolated between January 1, 2006 and March 31, 2006 at the Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, Barcelona, Spain. Study of sensitivity to kanamycin, gentamicin, tobramycin, amikacin, netilmicin, neomycin, streptomycin and spectinomycin by disk diffusion technique, detection of genes aph (3")-Ia, aph (3")-Ib, ant (3")-Ia, aph (3')-Ia, ant (2")-Ia, aac (3)-IIa, aac (6')-Ia, aac (6')-Ib, aac (6')-Ic , aac (3)-Ia, aac (3)-Ib, aac (2')-Ia by the technique of polymerase chain reaction (PCR). Study of clonal relationships of isolates by ERIC-PCR and PFGE. RESULTS AND CONCLUSIONS: The antimicrobial susceptibility in Enterobacteriaceae between 2004 and 2006 in the Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, Barcelona, Spain has remained stable in the beta-lactam group, while resistance to fluoroquinolones increased up to 30%, and has appeared amikacin resistance, while resistance to gentamicin and tobramycin continued below 10%. The most prevalent aminoglycoside resistance pattern was caused by aph (3'')-Ib conferring resistance to streptomycin, present in one third of the isolates resistant to one of the aminoglycosides studied. Of patterns affecting aminoglycosides in clinical use, the most prevalent was caused by aac (3)-IIa: resistance to gentamicin and tobramycin, present in 60% of isolates with resistance to aminoglycosides in clinical use. The presence of phenotypic features in the inhibition zone edge (sharper zone and colonies inside inhibition zone) was significantly associated with the presence of AME genes in the 8 aminoglycosides tested.

La utilización de antimicrobianos, de forma metafiláxica, para mantener la salud de los animales en las granjas de producción, puede ser problemático en un futuro próximo, debido a las altas tasas de resistencias que se están observando. Esta situación obliga a replantearse medidas alternativas, las más habituales basadas en el uso de prebióticos, probióticos o la combinación de ambos (simbióticos). El objetivo principal de este trabajo ha sido el de seleccionar cepas de diferentes especies del género Bacteroides para ser utilizadas en conejos como probiótico. El género Bacteroides constituye uno de los principales componentes de la microbiota intestinal de los mamíferos (hasta 1011 UFC/g heces, en humanos). Degradan moléculas complejas, especialmente carbohidratos, y juegan un papel importante en el control de la colonización del tracto digestivo por parte de patógenos; también, en algún caso, pueden actuar como patógenos oportunistas. Están implicados además en la maduración del sistema inmunitario asociado a la mucosa intestinal. Los Bacteroides spp. podrían tener actividad probiótica por dos mecanismos diferentes: bien produciendo sustancias inhibidoras del crecimiento de otros componentes de la microbiota intestinal (bacteriocinas, metabolitos secundarios…), bien estimulando al sistema inmune, incrementando las defensas de forma inespecífica (inmuno-moduladores). Basándonos en la colección de Bacteroides spp. del CReSA, en este trabajo se han realizado estudios in vitro para seleccionar cepas, con ausencia de características negativas y presencia de características positivas, que pudieran utilizarse en estudios in vivo, en gazapos durante la fase de lactación, y poder analizar su rol como posible probiótico. La presencia de resistencias a determinados antibióticos, especialmente de marcadores transferibles, ha sido la característica más restrictiva a la hora de seleccionar las cepas a analizar in vivo. Después de seleccionar cuatro cepas, se procedió al estudio in vivo, en una granja comercial, examinando el efecto sobre la microbiota intestinal y diferentes parámetros inmunitarios. De los resultados obtenidos podemos inferir que algunas de las cepas probadas pueden ser candidatos para el desarrollo de un probiótico para conejo. / The metaphylactic use of antimicrobials to maintain the health of animals in food production farms can be problematic in the near future, due to the high rate of resistances observed. This situation forces to looking for alternative measures, the most common based on the use of prebiotics, probiotics or a combination of both (symbiotic). The main objective of this work was to select strains of different species of the Bacteroides genus that could be used as probiotic in rabbits. Bacteroides genus is one of the main components of the mammalian intestinal microbiota (1011 CFU/g feces, in humans). These bacteria degrade complex molecules, especially carbohydrates, and play an important role in the control of the colonization of the digestive tract by pathogens; but, in some cases, they can act as opportunistic pathogens. Furthermore, they are involved in the maturation of the immune system associated with intestinal mucosa. The Bacteroides spp. could have probiotic activity in two different ways: producing inhibitory substances against other components of intestinal microbiota (bacteriocins, secondary metabolites…) or stimulating the immune system, increasing the nonspecific defenses of host (immune-modulators). Using the collection of Bacteroides spp. of CReSA, in this work different in vitro studies were conducted to select strains, looking for the absence of negative characteristics and the presence of positive characteristics, to be used for the in vivo studies on rabbits during the lactation period and to analyze their role as probiotic. The presence of resistances against antimicrobials, especially when transferable markers were present, was the most restrictive characteristic for the selection of the strains that were analyzed in vivo. After the selection of four strains, the in vivo study on a commercial farm was conducted, examining the effect on the intestinal microbiota and on different immune parameters. By the analysis of the obtained results can be inferred that some of the tested strains may be candidates for the development of probiotics for rabbit.

Cerca del 80% de los aceites y las grasas producidas mundialmente son aceites vegetales y el resto de origen animal. Dicha cantidad de ácidos grasos sirve como fuente para la producción de una serie de compuestos nuevos: diácidos o epóxidos de cadena larga o ácidos grasos omega-hidroxilados. Pseudomonas aeruginosa 42A2 es un bacilo gramnegativo que produce ácidos grasos trans-hidroxilados (HFA) a partir del ácido oleico cuando es cultivado en un medio mineral. Dichos HFA, los ácidos 10(S)-hidroxi-8(E)-octadecenoico ((10S)-HOME) y 7,10(S,S)-dihidroxi-8(E)-octadecenoico ((7S,10S)-DiHOME), son producidos a través de un sistema de aireación no dispersivo que permite una mayor oxigenación y homogeneidad del medio de cultivo en los que son producidos. Tanto es así que se han conseguido unos valores de productividad para estos HFA de 0.29 y 0.31 g•L-1•h-1, respectivamente. Éstos han sido purificados a unos niveles superiores del 91% para poder ser polimerizados y obtener estólidos, poliésteres de trans-HFA. Por medio de una búsqueda exhaustiva, se decidió que Novozym 435, lipasa B de Candida antarctica, era la lipasa ideal para realizar dicha polimerización in-vitro. En una primera aproximación, se sintetizaron estólidos a partir de (10S)-HOME en medio orgánico, n-hexano. Se optimizó las condiciones de reacción y el mayor rendimiento obtenido fue del 30%. Esta nueva generación de estólidos trans ha requerido unas nuevas técnicas analíticas. Estos poliésteres han sido analizados a través de MALDI-TOF-MS utilizando una matriz de DHB neutralizada con LiOH, ya que, el ion 7Li+ ayuda a estabilizar dichos compuestos y por ende obtener espectros de masas menos fragmentados. Dicha técnica estructural ha resultado ser más rápida y barata que una LC-MS convencional. Dímeros del derivado monohidroxilado fueron sintetizados. En una segunda aproximación, se sintetizaron estólidos a partir de (10S)-HOME y (7S,10S)-DiHOME en medio libres de disolventes orgánicos usando Novozym 435. Rendimientos del 71 y del 94% de conversión, respectivamente, fueron obtenidos después de optimizar los medios de reacción. Estos estólidos fueron analizados por MALDI-TOF-MS con una matriz de DHB saturada en acetonitrilo para incrementar la sensibilidad de los oligómeros de mayor peso molecular. Mediante esta técnica se llevaron a detectar oligómeros de hasta 6 y 7 unidades monoméricas, respectivamente. Así mismo se usó la RMN para determinar la estructura de los compuestos analizados con gran éxito. Finalmente, se decidió sintetizar etil ésteres de los ácidos (10S)-HOME y (7S,10S)-DiHOME debido a las propiedades aromáticas. Estos ésteres se sintetizaron en medio orgánico, cloroformo, y en un medio libre de disolventes con unos rendimientos totales, en ambos casos. Dichos etil ésteres fueron analizados por MALDI-TOF-MS y RMN para determinar su masa molecular y estructura, respectivamente. Finalmente, se realizó un estudio de diversas propiedades físico-químicas de estos compuestos obtenidos. La viscosidad y diversos parámetros calorimétricos obtenidos a partir de curvas DSC y TGA fueron determinados para saber de la naturaleza de esta nueva generación de ésteres. / About 80% of the oil and fats produced worldwide are vegetable oils and the rest are from animal origin. This amount of fatty acids is used as a source for producing new compounds: long chain diacids or epoxides or omega-hydroxylated fatty acids. Pseudomonas aeruginosa 42A2 is a gramnegative bacillus which produces hydroxy-fatty acids (HFA) when is cultivated in a mineral médium using oleic acid as carbon source. These HFA, 10(S)-hydroxy-8(E)-octadecenoic acid ((10S)-HOME) and 7,10(S,S)-dihidroxi-8(E)-octadecenoic acid ((7S,10S)-DiHOME), are produced with a non-dispersive aeration system that enhanced oxygenation and homogeneity of the culture media. The following volumetric productivity for these HFA were achieved: 0.29 y 0.31 g•l(-1)•h(-1), respectively. These HFA were purified with levels higher than 91% of purity for being later polymerizated and obtaining estolides, polyesters of HFA. For that purpose Novozym 435, lipase B from Candida antarctica, was chosen among other lipases to performance this enzymatic reaction. First of all, (10S)-HOME estolides were synthesized in organic media, n-hexane. Reaction conditions were optimized, reaching a 30% reaction yield. This new family of trans-estolides required adapted analytical techniques. These polyesters were analyzed with MALDI-TOF-MS using a DHB matrix neutralized with LiOH. 7Li+ ion stabilizes such compounds and less fragmented mass spectra were observed. This technique was less time-consuming than LC-MS. Dimers of the monohydroxylated compound were produced. Secondly, estolides from (10S)-HOME y (7S,10S)-DiHOME were synthesized in a solvent-free media using Novozym 435. Reaction yields of 71 and 94% were reached, respectively, after optimizing reaction media. These compounds were analyzed by MALDI-TOF-MS using a DHB matrix saturated in acetonitrile for detecting higher mass oligomers. This technique could detect oligomers composed of 6 and 7 monomeric units, respectively. Moreover, NMR were also used to determine the structure of these polyesters. Thirdly, trans-HFA ethyl esters were synthesized due to their aromatic properties. Such esters were produced in organic media, chloroform, and in a solvent-free media, in both cases with a total conversion. trans-HFA ethyl esters were analyzed by MALDI-TOF-MS and NMR for determing their molecular mass and structure, respectively. Finally, a physicochemical study of these compounds, estolides and ethyl ester, was carried out. Viscosity and some calorimetric parameters from DSC and TGA curves were determined.

Los datos acerca de las leishmaniosis y sus vectores, los flebotomos, en las Islas Baleares son escasos y focalizados. La tasa global de casos humanos (LH) se sitúa entre los 0,7-3,5 casos anuales/100.000 habitantes y la prevalencia de la leishmaniosis canina (LCan) varía entre el 0 y el 45%, dependiendo de la isla y de la población analizada. Se han identificado cinco especies de flebotomos en las islas, pero no se dispone de un estudio extensivo de su distribución y densidad. El objetivo general de esta tesis es profundizar en el conocimiento de la epidemiología de la leishmaniosis en Mallorca y Menorca, que presentan un grado de endemicidad diferente, ausente de Menorca y con una prevalencia elevada en Mallorca. La metodología ha variado en función de los objetivos específicos planteados. Para el estudio de la infección natural por leishmania de los vectores se ha aplicado una PCR-anidada y para analizar la utilidad de dicha técnica en estudios epidemiológicos se ha observado, además, el estado de digestión sanguínea de las hembras de flebotomos. La identificación de la especie de Leishmania se llevó a cabo mediante RFLP. Para obtener datos de la LCan se ha realizado una encuesta a los veterinarios de las Islas Baleares y un estudio serológico prospectivo a perros de la isla de Menorca. El estudio de los vectores, Phlebotomus perniciosus, se ha llevado a cabo mediante capturas con trampas adhesivas durante el periodo estival. Resultados:. El 38,7% de las hembras analizadas presentaron una PCR-anidada positiva para leishmania, variando entre el 0% y el 78% de acuerdo al grado de LH y y LCan en el área. Se observó un incremento significativo del riesgo de positividad en la PCR-anidada al incrementar el grado de digestión sanguínea (OR = 1,3; p = 0,025). El genotipado permitió identificar a L. infantum en todos los casos. El análisis retrospectivo de la LCan en las Islas Baleares permitió observar que el 50% de los veterinarios opinaba que la incidencia de la LCan no había sufrido cambios. Sin embargo, el 50% de los veterinarios de Menorca consideraban que la LCan había incrementado y el 100% consideraba que los nuevos casos diagnosticados eran autóctonos. El estudio serológico transversal, mostró una tasa de seroprevalencia del 24% en la isla, siendo del 31% en los perros locales sin antecedentes de desplazamientos a zonas endémicas. El estudio entomológico permitió detectar la presencia de Phlebotomus perniciosus, uno de los vectores de L. infantum en la región mediterránea. En Menorca se capturó entre 31–161 m, con una frecuencia del 56,8%, y en Mallorca entre 6-772 m, con una frecuencia de 69,4%. La densidad en Menorca disminuyó significativamente con respecto a un estudio anterior. El análisis estadístico en ambas islas permitió observar que P. perniciosus se localiza preferentemente alejada de los núcleos urbanos y que su presencia está además influenciada por la flora adyacente y el tipo de muro donde se colocan las trampas. Conclusiones: La PCR-anidada, en combinación con el análisis de la digestión sanguínea, se muestra útil para estudios epidemiológicos de las leishmaniosis. En Menorca se ha detectado un foco autóctono de LCan, cuya emergencia no parece estar relacionada con un aumento en la densidad de P. perniciosus, sino con la introducción continua de perros infectados con leishmaniosis. En ambas islas el vector se encuentra ampliamente distribuido, con el consecuente riesgo de transmisión de la leishmaniosis. En Mallorca hay una mayor probabilidad de encontrarlo a altitudes entre 51-150 m, en presencia de garriga, en los límites de poblaciones y entre éstas y en la proximidad de granjas de ovejas. / Data on leishmaniosis and its vectors (sandflies) in the Balearic Islands are scarce and focused. The overall rate of human leishmaniosis (HL) is 0.7-3.5 cases per year/100,000 inhabitants, and the prevalence of canine leishmaniosis (CanL) varies between 0 and 45%, depending on the island and the population tested. Five species of sandflies have been identified in the islands, but their distribution and density have not been extensively studied to date. Objective: To obtain a greater understanding of the epidemiology of leishmaniosis in Majorca and Minorca, which show different degrees of endemicity. Results: In the application of a nested-PCR (n-PCR) to determine leishmania parasitism, 38.7% of analysed female sandflies tested positive, ranging from 0% to 78% according to the presence of CanL and HL. The probability of a positive n-PCR increased significantly with the degree of blood digestion (P=0.025 OR=1.3). Genotyping (RFLP) allowed Leishmania infantum identification in all cases. In response to a questionnaire on CanL trends, 50% of participating Balearic Island veterinarians thought its incidence had not changed overtime. However, in Minorca 50% of veterinarians considered CanL to be increasing, while 100% thought that the newly diagnosed cases were autochthonous. A cross-sectional serological study in Minorca showed an overall seroprevalence rate of 24%, or 31% in local dogs with no history of having travelled to endemic areas. The entomological study employing sticky traps in Minorca and Mallorca confirmed the presence of Phlebotomus perniciosus, vector of L. infantum. In Minorca, it was captured with a frequency of 56.8% at 31-161 m.a.s.l. and in Majorca of 69.4% at 6-772 m.a.s.l. The density in Minorca was significantly lower compared to a previous study. The statistical analysis of both islands showed that P. perniciosus is mainly located far from urban settlements, and its presence is also influenced by the type of adjacent flora and wall construction. Conclusions: n-PCR coupled with blood digestion analysis is a useful technique for epidemiological studies of leishmaniosis. The emergence and establishment of an autochthonous focus of CanL in Minorca is apparently related with the continuous introduction of leishmaniosis-infected dogs rather than an increase in P. perniciosus density. The vector was found throughout both islands, with the consequent risk of leishmaniosis transmission. In Majorca, P. perniciosus is most likely found at altitudes of 51-150 m.s.a.l., in garrigue vegetation, between and at the edge of settlements, and in the proximity of sheep farms.

The demand of minimally processed fruits and vegetables has increased in the last years. However, their intrinsic characteristics may favor the growth of pathogens and spoilage microbiota. The negative effects on human health reported for some traditional chemical sanitizers have justified the search for substitutes to guarantee food safety and quality. In this work we have evaluate the potential of some essential oils and their components to improve the safety and the shelf life of Lamb’s lettuce (Valerianella locusta) and apples (Golden delicious). Moreover, the effects of selected lactic acid bacteria alone or in combination with essential oils or their components, on the shelf-life and safety as well as organoleptic properties of minimally processed products, were evaluated. Since the lack of knowledge of microbial cell targets of essential oils represent one of the most important limit to the use of these molecules at industrial level, another aim of this thesis was the study of the action mechanisms of essential oils and their components. The results obtained showed the beneficial effects of the natural antimicrobials as well as the selected lactic acid bacteria on minimally processed fruit and vegetable safety and shelf-life, without detrimental effects on the quality parameters. The beneficial effects obtained by the use of the selected biocontrol agents were further increased combining them with selected natural antimicrobials. The natural antimicrobial employed induced noticeable modifications of membrane fatty acid profiles and volatile compounds produced by microbial cells during the growth. The modification of the expression in genes involved in fatty acid biosynthesis suggesting that the cytoplasmic membrane of microbial cells is one of the major cellular target of essential oils and their components. The comprehension of microbial stress response mechanisms can contribute to the scaling up of natural antimicrobials and bio-control agents at industrial level.

Oncolytic virotherapy exploits the ability of viruses to infect and kill cells. It is suitable as treatment for tumors that are not accessible by surgery and/or respond poorly to the current therapeutic approach. HSV is a promising oncolytic agent. It has a large genome size able to accommodate large transgenes and some attenuated oncolytic HSVs (oHSV) are already in clinical trials phase I and II. The aim of this thesis was the generation of HSV-1 retargeted to tumor-specific receptors and detargeted from HSV natural receptors, HVEM and Nectin-1. The retargeting was achieved by inserting a specific single chain antibody (scFv) for the tumor receptor selected inside the HSV glycoprotein gD. In this research three tumor receptors were considered: epidermal growth factor receptor 2 (HER2) overexpressed in 25-30% of breast and ovarian cancers and gliomas, prostate specific membrane antigen (PSMA) expressed in prostate carcinomas and in neovascolature of solid tumors; and epidermal growth factor receptor variant III (EGFRvIII). In vivo studies on HER2 retargeted viruses R-LM113 and R-LM249 have demonstrated their high safety profile. For R-LM249 the antitumor efficacy has been highlighted by target-specific inhibition of the growth of human tumors in models of HER2-positive breast and ovarian cancer in nude mice. In a murine model of HER2-positive glioma in nude mice, R-LM113 was able to significantly increase the survival time of treated mice compared to control. Up to now, PSMA and EGFRvIII viruses (R-LM593 and R-LM613) are only characterized in vitro, confirming the specific retargeting to selected targets. This strategy has proved to be generally applicable to a broad spectrum of receptors for which a single chain antibody is available. / La terapia virale oncolitica sfrutta l’abilità dei virus di infettare e uccidere le cellule e si propone come cura per i tumori che non sono accessibili chirurgicamente e/o non rispondono agli attuali protocolli terapeutici. HSV è un promettente agente oncolitico. Il suo ampio genoma è infatti in grado di alloggiare transgeni di grandi dimensioni e alcuni HSV oncolitici (oHSV) attenuati sono già in fase clinica I e II. Obiettivo di questa tesi è stato la generazione di o-HSV-1 reindirizzati verso specifici recettori tumorali (retargeting) e resi incapaci di legarsi ai recettori naturali di HSV, Nectin-1 e HVEM (detargeting). Il reindirizzamento è stato ottenuto tramite l’inserimento all’interno della glicoproteina di HSV gD di un anticorpo a singola catena (scFv) specifico per i recettori tumorali selezionati. I recettori tumorali considerati sono stati: epidermal growth factor receptor 2 (HER2) sovraespresso nel 25-30% dei tumori al seno, all’ovaio e nei gliomi; prostate specific membrane antigen (PSMA) espresso nei carcinomi prostatici e nelle neovascolature dei tumori solidi e la variante III dell’epidemal growth factor receptor (EGFRvIII). Gli studi in vivo sui virus reindirizzati al recettore HER2, R-LM249 e R-LM113, hanno dimostrato il loro alto profilo di sicurezza. Per R-LM249 l’efficacia antitumorale è stata evidenziata dalla inibizione bersaglio-specifica della crescita di tumori umani HER2 positivi in modelli di tumore ovarico e mammario in topi nudi. In un modello di glioma murino HER2 positivo in topi nudi, R-LM113 è stato in grado di aumentare significativamente il tempo di sopravvivenza dei topi trattati rispetto ai controlli. Per ora, gli ultimi virus, generati verso il PSMA e EGFRvIII, sono sati caratterizzati in vitro confermando il reindirizzamento specifico ai bersagli selezionati. Questa strategia si è dimostrata generalmente applicabile ad un ampio spettro di recettori per i quali un anticorpo a singola catena sia disponibile.

The objectives of this PhD research were: i) to evaluate the use of bread making process to increase the content of β-glucans, resistant starch, fructans, dietary fibers and phenolic compounds of kamut khorasan and wheat breads made with flours obtained from kernels at different maturation stage (at milky stage and fully ripe) and ii) to study the impact of whole grains consumption in the human gut. The fermentation and the stages of kernel development or maturation had a great impact on the amount of resistant starch, fructans and β-glucans as well as their interactions resulted highly statistically significant. The amount of fructans was high in kamut bread (2.1g/100g) at the fully ripe stage compared to wheat during industrial fermentation (baker’s yeast). The sourdough increases the content of polyphenols more than industrial fermentation especially in bread made by flour at milky stage. From the analysis of volatile compounds it resulted that the sensors of electronic nose perceived more aromatic compound in kamut products, as well as the SPME-GC-MS, thus we can assume that kamut is more aromatic than wheat, so using it in sourdough process can be a successful approach to improve the bread taste and flavor. The determination of whole grain biormakers such as alkylresorcinols and others using FIE-MS AND GC-tof-MS is a valuable alternative for further metabolic investigations. The decrease of N-acetyl-glucosamine and 3-methyl-hexanedioic acid in kamut faecal samples suggests that kamut can have a role in modulating mucus production/degradation or even gut inflammation. This work gives a new approach to the innovation strategies in bakery functional foods, that can help to choose the right or best combination between stages of kernel maturation-fermentation process and baking temperature.