In the first part of my thesis I studied the mechanism of initiation of the innate response to HSV-1. Innate immune response is the first line of defense set up by the cell to counteract pathogens infection and it is elicited by the activation of a number of membrane or intracellular receptors and sensors, collectively indicated as PRRs, Patter Recognition Receptors. We reported that the HSV pathogen-associated molecular patterns (PAMP) that activate Toll-like receptor 2 (TLR2) and lead to the initiation of innate response are the virion glycoproteins gH/gL and gB, which constitute the conserved fusion core apparatus across the Herpesvirus. Specifically gH/gL is sufficient to initiate a signaling cascade which leads to NF-κB activation. Then, by gain and loss-of-function approaches, we found that αvβ3-integrin is a sensor of and plays a crucial role in the innate defense against HSV-1. We showed that αvβ3-integrin signals through a pathway that concurs with TLR2, affects activation/induction of interferons type 1, NF-κB, and a polarized set of cytokines and receptors. Thus, we demonstrated that gH/gL is sufficient to induce IFN1 and NF-κB via this pathway. From these data, we proposed that αvβ3-integrin is considered a class of non-TLR pattern recognition receptors. In the second part of my thesis I studied the capacity of human mesenchymal stromal cells isolated by fetal membranes (FM-hMSCs) to be used as carrier cells for the delivery of retargeted R-LM249 virus. The use of systemically administrated carrier cells to deliver oncolytic viruses to tumoral targets is a promising strategy in oncolytic virotherapy. We observed that FM-hMSCs can be infected by R-LM249 and we optimized the infection condition; then we demonstrate that stromal cells sustain the replication of retargeted R-LM249 and spread it to target tumoral cells. From these preliminary data FM-hMSCs resulted suitable to be used as carrier cells

Tesi realitzada als Centres Científics i Tecnologògics (CCIT-UB) / La Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) combinada con la Tomografía Electrónica (ET) ha proporcionado una visión más precisa de la complejidad de la estructura de las células procariotas. A su vez, la crioinmovilización de muestras por enfriamiento rápido permite la observación de muestras biológicas en un estado cercano al natural, mejorando la caracterización de estructuras bacterianas conocidas y permitiendo el descubrimiento de nuevas. La crioinmovilización por alta presión (HPF) seguida de criosustitución (FS) e inclusión en resina de la bacteria Antártica Pseudomonas deceptionensis M1T permitió observar una estructura nueva que no se correspondía con ningún tipo de inclusión o estructura descrita previamente como componente del citoplasma bacteriano. Ésta, se observaba frecuentemente al cultivar la bacteria en condiciones de crecimiento lento a bajas temperaturas (medio TSA, 0ºC, 12 días). La aplicación de la ET a temperatura ambiente (RT-ET) demostró que la nueva estructura estaba constituida por un número variable de discos ovalados, planos, apilados, de tamaño variable, grosor constante, rodeados aparentemente por una membrana y próximos a la membrana plasmática (PM) bacteriana. Debido a esta apariencia de discos apilados, esta nueva estructura se denominó “Stack”. Las células que los presentaban, podían contener uno o varios simultáneamente, en cuyo caso se observaban aislados o agrupados en una misma localización, difiriendo en sus orientaciones. La visualización de los “Stacks” mediante diferentes técnicas de (Cryo-)TEM: Tokuyasu, criofractura, secciones vítreas y bacteria entera crioinmovilizada por Plunge freezing (PF), corroboró su existencia y descartó un origen artefactual. La Criotomografía electrónica (CET) de bacterias completas crioinmovilizadas por PF permitió el estudio de la distribución espacial de los “Stacks” en el contexto celular, confirmando su estructura tridimensional formada por discos ovalados planos, su presencia aislada o agrupada, y su ubicación periférica en el citoplasma bacteriano, coincidiendo con los resultados obtenidos por RT-ET. No se observó continuidad entre la membrana que rodeaba las subunidades de los “Stacks” y la PM, por lo que no parecen ser invaginaciones de la misma. Asimismo, la CET de secciones vítreas (CETOVIS) demostró que la membrana que rodeaba los discos del “Stack” presentaba el perfil de bicapa lipídica. El estudio comparativo del grosor de la membrana de estas subunidades y del de la PM, tanto en bacteria completa como en secciones vítreas, mostró diferencias significativas, apuntando a una composición diferente entre ambas. Los “Stacks” se detectaron en otras especies del género Pseudomonas cultivadas en condiciones de crecimiento lento a bajas temperaturas. En todos los casos estudiados, los “Stacks” se encontraron muy próximos a microfibras de DNA, apareciendo parcial o totalmente envueltos por el nucleoide bacteriano. El estudio de la correlación entre el número de “Stacks” y del número de bacterias en fase de septación, cuantificado en secciones de resina de P. deceptionensis M1T cultivadas en TSA a 0ºC a diferentes tiempos, apuntó también a una posible relación entre la presencia de “Stacks” y alguna fase de la dinámica del cromosoma bacteriano. / In recent years, improvements in transmission electron microscopy (TEM) and tomography have provided a more accurate view of the complexity of the structure of prokaryotic cells. This fact has allowed the study of biological samples in a close-to-native state, enabling us to refine our knowledge of already known bacterial structures and to discover new ones. Application of these techniques to the new Antarctic cold-adapted bacterium Pseudomonas deceptionensis M1T has demonstrated the existence of a previously undescribed cytoplasmic structure that does not correspond to known bacterial structures and which we called “Stack”. This structure was mainly visualized in slow growing cultures of P. deceptionensis M1T and can be described as a set of stacked discs surrounded by a membrane-like structure, located close to the cell membrane, but not continuous with it, and found in variable number. Stacks were mostly observed very close to DNA fibers. Stacks are not exclusive to P. deceptionensis M1T and were also visualized in slow-growing cultures of other bacteria. Cryo-electron microscopy (Cryo-EM) and CET of frozen-hydrated P. deceptionensis M1T cells confirmed that stacks were found at different locations within the cell cytoplasm, in variable number, separately or grouped together, very close to the plasma membrane (PM), and thus establishing that they were not artifacts of the previous sample preparation methods. CET of plunge-frozen whole bacteria and vitreous sections verified that each stack consisted of a pile of oval disc-like subunits, each disc being surrounded by a lipid bilayer membrane. Stacks did not appear to be invaginations of the PM because no continuity between both membranes was visible when whole bacteria were analyzed. We are still far from deciphering the function of these new structures, but a first experimental attempt links the stacks with a given phase of the cell replication process.

Una pila microbiana de combustible es un sistema bioelectroquímico en el cual las bacterias oxidan materia orgánica y transfieren los electrones a un electrodo produciendo electricidad. La eficiencia de este sistema depende de la actividad metabólica de los microorganismos creciendo en el ánodo, pero también de un gran número de factores relacionados con el diseño y la operación del sistema. El objetivo de esta tesis es contribuir al análisis y control de algunos de estos factores, así como ayudar a determinar el papel de los diferentes mecanismos de transferencia de electrones en el funcionamiento de estos dispositivos. En primer lugar, este trabajo analiza factores relacionados con el diseño que afectan al rendimiento de una pila microbiana. Así, se centra en el efecto de diferentes catalizadores abióticos así como en la relación entre las áreas del cátodo y ánodo necesarias para no afectar la potencia obtenida. Los resultados revelan que catalizadores solubles permiten potencias mucho mayores, y por tanto necesitan menor relación entre las áreas de cátodo y ánodo que en el caso de las pilas con cátodos de platino. No obstante, a largo plazo, las pilas con catalizadores solubles de hierro muestran un descenso progresivo del rendimiento de la celda de combustible que las hace poco adecuadas para aplicaciones que requieren operaciones de larga duración. Recientemente, la búsqueda de catalizadores adecuados para el cátodo ha llevado a los investigadores a explorar el posible uso de biocátodos. En esta tesis se demuestra la capacidad de Shewanella oneidensis MR-1 para catalizar la reacción del cátodo tanto en condiciones aeróbicas como anaeróbicas, siendo capaz de aceptar la corriente proporcionada por las bacterias presentes en el ánodo. El potencial de las bacterias que se encuentran en el ánodo para la producción de corriente no sólo depende de los niveles de actividad microbiana y de la supresión de las limitaciones producidas por el cátodo, sino que es afectada también por factores relacionados con el funcionamiento del sistema. Nosotros mostramos la importancia de una operación ininterrumpida como otro factor relevante para determinadas aplicaciones. Periodos de interrupción del circuito producen una alteración en los valores de corriente en forma de picos, que aparecen cuando el circuito es cerrado tras un periodo de interrupción y que caen lentamente hasta alcanzar valores normales de corriente. Mediante análisis más exhaustivos de este fenómeno se demuestra la capacidad de Shewanella oneidensis MR-1 para almacenar carga eléctrica en ausencia de aceptores de electrones. Finalmente, se estudió la contribución en la producción de corriente de los diferentes mecanismos de transferencia de electrones en pilas con comunidades microbianas complejas. La pila con el ánodo descubierto muestra que los mecanismos de transferencia directa son responsables de la mayor parte de la corriente generada. La comunidad microbiana formada se encuentra relacionada con la vía de transferencia de electrones disponible con especies microbianas como Shewanella, Aeromonas, Pseudomonas o Propionibacterium. Los mecanismos de transferencia mediante mediadores le siguen en importancia, siendo los responsables del 40% de la corriente producida. Esta pila cuya corriente depende de la producción de mediadores muestra una gran cantidad de especies redox en el anolito, algunas de ellas no relacionadas con mediadores ya descritos. Por último, en la pila con el electrodo cubierto de nafion, la única especie química capaz de llegar a la superficie del ánodo es el hidrógeno. En este caso, la producción de corriente es sostenida gracias a la relación entre algunos organismos como Comamonas, Alicycliphilus, Diaphorobacter o la archaea Methanosaeta y el ánodo. La oxidación de acetato mediante estos microorganismos resulta en la producción de hidrógeno, el cual es oxidado en la superficie del ánodo tras cruzar el nafion. / A Microbial Fuel Cell (MFC) is a bioelectrochemical system, in which bacteria oxidize organic matter and transfer the electrons through their electron transport chains onto an electrode surface producing electricity. The efficiency of the system depends on the metabolic activity of the microorganisms growing at the anode but also on a large number of factors related to the design and operation of the MFC. The purpose of this work is to contribute to the analysis and control of some of these factors as well as to throw some light on the role of different electron transfer mechanisms in MFC operation. To achieve this goal different experiments using the electrogenic bacterium Shewanella oneidensis MR-1 have been carried out. First of all, this works analyses the role of several design factors in MFC performance. This part of the research focuses on the effect of different abiotic catalysts as well as the cathode to anode ratio required for unhindered power output. The results indicate that soluble catalysts such as ferricyanide allow much higher power values, and therefore need smaller cathode/anode ratios than platinum-based cathodes. In the long term, however, MFCs containing soluble iron catalysts show a progressive degradation of fuel cell performance make them unfit for applications requiring extended operations. In recent years, the search for a suitable catalyst at the cathode has led researchers to explore the possible use of biocathodes. In this work, we demonstrate the capacity of Shewanella oneidensis MR-1 to catalyse the cathode reaction both under aerobic and anaerobic conditions, being able to sustain the current provided by bacteria present in the anode. The potential of anode bacteria for current production does not only depend on the levels of microbial activity and on the removal of cathodic limitations but seems to be also affected by factors related to the operation of the system. We have shown the importance of continuous MFC operation as another important factor to take into account for some applications. Periods of circuit interruption produce an alteration of the normal current output in the form of defined current peaks that appear when closing the circuit after a short period of current interruption and that decay slowly back to the original stable values. In depth analysis of this response demonstrates the capacity of Shewanella oneidensis MR-1 to store charge when no electron acceptors are present. Finally, we intended to determine the contribution of the different electron transfer mechanisms to current production in MFCs harbouring complex microbial communities. The MFC with a naked anode shows that direct electron transfer mechanisms are responsible for most of the current generated. The microbial community formed agrees with the electron transfer pathways available. So, this MFC presents species able of direct and mediated electron transfer as Shewanella, Aeromonas, Pseudomonas or Propionibacterium. The MFC sustained by shuttle-dependent electron transfer follows in importance being responsible for as much as 40% of current output. This reactor shows a great quantity of different redox species in the anolyte bulk, some of them not related to mediators currently described in the literature. Finally, in the MFC with a nafion-coated anode, the only chemical species able to diffuse to the anode surface is hydrogen. In this case, current production is sustained by the interaction between some organisms, such as Comamonas, Alicycliphilus, Diaphorobacter or the archaea Methanosaeta and the anode. Oxidation of acetate by these microorganisms results in hydrogen production that is therefore oxidised at the anode surface after crossing the nafion barrier. Current production by this mechanism would account for not more than 5% of the total current evolved in an unrestricted MFC.

60 strains (belonging to the genera Lactobacillus, Bifidobacterium, Leuconostoc and Enterococcus) were tested for their capacity to inhibit the growth of 3 strains of Campylobacter jejuni: Lactobacilli and bifidobacteria were left to grow in MRS or TPY broth at 37°C overnight in anaerobic conditions; Campylobacter jejuni was inoculated in blood agar plates at 37°C for 24-48 hours in microaerophilic conditions. The inhibition experiments were carried out in vitro using ”Spot agar test” and “Well diffusion assay” techniques testing both cellular activity and that of the surnatant. 11 strains proved to inhibit the growth of Campylobacter jejuni. These strains were subsequently analised analised in order to evaluate the resistance to particular situations of stress which are found in the gastrointestinal tract and during the industrial transformation processes (Starvation stress, osmotic stress, heat stress, resistance to pH and to bile salts). Resistance to starvation stress: all strains seemed to resist the stress (except one strain). Resistance to osmotic stress: all strains were relatively resistant to the concentrations of 6% w/v of NaCl (except one strain). Resistance to heat stress: only one strain showed little resistance to the 55°C temperature. Resistance to pH: In the presence of a low pH (2.5), many strains rapidly lost their viability after approximately 1 hour. Resistance to bile salts: Except for one strain, all strains seemed to be relatively resistant to the 2% w/v concentration of bile salts. Afterward, strains were identified by using phenotipic and molecular techniques. Phenotipic identification was carried out by using API 50 CHL (bioMérieux) and API 20 STREP identification system (bioMérieux); molecular identification with species-specific PCR: the molecular techniques confirmed the results by phenotipic identification. For testing the antibiotic resistance profile, bacterial strains were subcultured in MRS or TPY broth and incubated for 18 h at 37°C under anaerobic conditions. Antibiotics tested (Tetracycline, Trimethoprim, Cefuroxime, Kanamycin, Chloramphenicol, Vancomycin, Ampycillin, Sterptomycin, Erythromycin) were diluted to the final concentrations of: 2,4,8,16,32,64,128,256 mg/ml. Then, 20 μl fresh bacterial culture (final concentration in the plates approximately 106 cfu/ml) were added to 160 μl MRS or TPY broth and 20 μl antibiotic solution. As positive control the bacterial culture (20 ul) was added to broth (160 ul) and water (20 ul). Test was performed on plates P96, that after the inoculum were incubated for 24 h at 37oC, then the antibiotic resistance was determined by measuring the Optical Density (OD) at 620 nm with Multiscan EX. All strains showed a similar behaviour: resistance to all antibiotic tested. Further studies are needed.

The normal gut microbiota has several important functions in host physiology and metabolism, and plays a key role in health and disease. Bifidobacteria, which are indigenous components of gastrointestinal microbiota, may play an important role in maintaining the well-being of the host although its precise function is very difficult to study. Its physiological and biochemical activities are controlled by many factors, particularly diet and environment. Adherence and colonization capacity are considered as contributing factors for immune modulation, pathogen exclusion, and enhanced contact with the mucosa. In this way, bifidobacteria would fortify the microbiota that forms an integral part of the mucosal barrier and colonization resistance against pathogens. Bifidobacteria are not only subjected to stressful conditions in industrial processes, but also in nature, where the ability to respond quickly to stress is essential for survival. Bifidobacteria, like other microorganisms, have evolved sensing systems for/and defences against stress that allow them to withstand harsh conditions and sudden environmental changes. Bacterial stress responses rely on the coordinated expression of genes that alter various cellular processes and structures (e.g. DNA metabolism, housekeeping genes, cell-wall proteins, membrane composition) and act in concert to improve bacterial stress tolerance. The integration of these stress responses is accomplished by regulatory networks that allow the cell to react rapidly to various and sometimes complex environmental changes. This work examined the effect of important stressful conditions, such as changing pH and osmolarity, on the biosynthesis of cell wall proteins in B. pseudolongum subsp. globosum. These environmental factors all influence heavily the expression of BIFOP (BIFidobacterial Outer Proteins) in the cell-wall and can have an impact in the interaction with host. Also evidence has been collected linking the low concentration of sugar in the culture medium with the presence or absence of extracromosomal DNA.

Haemophilus parasuis es una bacteria Gram negativa común en el tracto respiratorio superior de cerdos sanos y es el agente etiológico de la enfermedad de Glässer, que se caracteriza por poliserositis fibrinosa y poliartritis. En los últimos años, la prevalencia de las infecciones respiratorias, incluyendo la producida por H. parasuis, ha aumentado debido a prácticas de manejo de los animales, como el destete precoz, y a la aparición de virus inmunosupresores. Poco se sabe acerca de la patogénesis y los factores de virulencia de H. parasuis y esto complica el control de la enfermedad. Las fosfatasas ácidas son ubicuas en organismos eucariotas y procariotas y han recibido mucha atención con la finalidad de entender sus estructuras, funciones y mecanismos catalíticos. En bacterias Gram negativas estos enzimas tienen un papel esencial en numerosos procesos, incluyendo la patogénesis bacteriana. Resultados previos de nuestro grupo demostraron la presencia de fosfatasa ácida secretada en sobrenadantes de ciertas cepas de H. parasuis. De especial interés fue la observación de que la secreción de la fosfatasa se perdía tras pases de la bacteria en el laboratorio, indicando un papel de este enzima en la infección. Por lo tanto el objetivo principal de esta tesis fue identificar y caracterizar los genes responsables de esta actividad fosfatasa. El análisis de una genoteca de la cepa virulenta H. parasuis ER-6P permitió la identificación de 2 clones con actividad fosfatasa. Estos clones contenían los genes aphA y pgpB, respectivamente. El clonaje y análisis posterior de estos genes confirmó que codificaban dos fosfatasas. Específicamente, AphA muestra características típicas de fosfatasas ácidas bacterianas de clase B, incluyendo el dominio catalítico típico (motivo F-D-I-D-D-TV-L-F-S-S-P, localizado en el N-terminal y el motivo Y-G-D-[AS]-D-X-D-[IV] localizado cerca del C-terminal), un peso molecular teo rico de 24,33 KDa e inhibicio n por EDTA. Las fosfatasas ácidas bacterianas de clase B son un grupo de enzimas que forman homotetra meros y esta n presentes en una minorí a de bacterias, que incluye pato genos importantes. Por otro lado, PgpB es una fosfatasa de fosfatidilglicerofosfato, con seis dominios transmembrana, que pueden explicar su localización celular en la bacteria. Ambas proteínas, AphA y PgpB, mostraron un pH óptimo distinto que la actividad fosfatasa secretada por H. parasuis al sobrenadante. En un intento de purificar la fosfatasa secretada, sobrenadantes de H. parasuis fueron fraccionado por cromatografía de flujo por tamaño y las fracciones con actividad fosfatasa fueron analizadas por SDS-PAGE y MALDI-TOF-TOF. La proteína hipotética HPS_05483 se identificó en las fracciones con actividad fosfatasa, pero su expresión nativa recombinante no fue posible. Sin embargo, sí pudo ser purificada con una cola de His y se detectaron anticuerpos frente a ella en cerdos infectados, indicando que ésta proteína se expresa durante la infección. Se produjeron anticuerpos monoclonales (Acm) frente a un sobrenadante de H. parasuis con actividad fosfatasa y una selección inicial detectó Acm frente a Apha. Sin embargo, se debe realizar una selección más exhaustiva de los hibridomas para identificar Acm específicos frente a la fosfatasa del sobrenadante de H. parasuis. Finalmente, se estudió el efecto de sobrenadantes con actividad fosfatasa sobre los macrófagos. La expresión de marcadores de superficie de macrófagos alveolares CD163, SLAI, SLAII, sialoadhesina y SWC3 no se vio afectada por incubación con sobrenadantes de H. parasuis o sobrenadante de un clon que secretaba AphA. En conclusión, hemos identificado y caracterizado parcialmente dos fosfatasas de H. parasuis, AphA y PgpB. Sin embargo, más estudios son necesarios para determinar si la proteína hipotética HPS_05483 es realmente una fosfatasa. El papel de estos enzimas en la biología de H. parasuis debería ser estudiado en más profundidad. / The Gram-negative bacterium Haemophilus parasuis is common in the upper respiratory tract of healthy swine and is the etiological agent of Glässer´s disease, which is characterized by fibrinous polyserositis and polyarthritis. In the last few years the prevalence of respiratory infections, including those by H. parasuis, has increased due to management practices, as early weaning, and the emergence of immunosuppressive viruses. Little is known about the pathogenesis and virulence factors of H. parasuis and this complicates the control of the disease. Acid phosphatases are ubiquitous in eukaryotic and prokaryotic organisms and much attention has been given to these enzymes in order to understand their structures, functions, and catalytic mechanisms. In many Gram-negative bacteria these enzymes have been determined to play a critical role in numerous processes, including pathogenesis. Previous results by our group showed the presence of a secreted acid phosphatase in the culture supernatant of some strains of H. parasuis. Interestingly, the secretion of the phosphatase activity was lost after passages of the bacteria in the laboratory, indicating a role of this enzyme in the infection. Therefore the main objective of this thesis was to identify and characterize the genes responsible for this secreted phosphatase activity. Screening of a genomic library from the virulent strain ER-6P of H. parasuis identified 2 clones with phosphatase activity. These clones contained genes aphA and pgpB, respectively. The subsequent cloning and analysis of the genes demonstrated that their products were in fact phosphatases. Specifically, AphA presented characteristics of bacterial class B acid phosphatases, including the typical catalytic domain (motif F-D-I-D-D-TV-L-F-S-S-P, located in the N-terminal moiety, and Y-G-D-[AS]-D-X-D-[IV] located near the C-terminus), a predicted molecular weight of 24.33 KDa and inhibition by EDTA. Bacterial class B acid phosphatases are a group of homotetrameric enzymes, which are present in a minority of bacteria, most of which are important pathogens. PgpB is a phosphatidylglycerophosphate phosphatase, with six transmembrane domains in the predicted protein, which would explain its location in the bacterial cell. Both proteins, AphA and PgpB, showed a different optimal pH than the activity secreted by H. parasuis into the supernatant. In an attempt to purify the phosphatase from the H. parasuis supernatant, a size exclusion chromatography was performed and fractions with phosphatase activity were analyzed by SDS-PAGE and MALDI-TOF-TOF. A hypothetical protein HPS_05483 was identified in the fractions with phosphatase activity, but cloning and native expression of the gene was not achieved. However, the protein HPS_05483 was purified as a His-tagged protein and antibodies in infected pigs were detected against it, indicating that this protein is expressed during infection. Monoclonal antibodies (mAb) were produced against a phosphatase-positive supernatant from H. parasuis and an initial screening of the mAb identified several hybridomas with reaction against AphA. Further screenings are needed to identify mAb against the secreted phosphatase found in the supernatant of H. parasuis. Finally, the effect of the phosphatase-positive supernatant on porcine alveolar macrophages was studied. The level of macrophage surface markers CD163, SLAI, SLAII, sialoadhesin and SWC3 was not affected by incubation with supernatants from H. parasuis or supernatant from a clone secreting AphA. In conclusion, we have identified and partially characterize 2 phosphatases of H. parasuis, AphA and PgpB. More studies are needed to determine if the hypothetical protein HPS_05483 is in fact a phosphatase. The role of these enzymatic activities in the biology of H. parasuis needs to be further studied.

La prevención de la contaminación bacteriana desde las superficies en los ambientes de elaboración de alimentos, industrias de este sector y ambientes domésticos, requiere de productos desinfectantes que sean efectivos frente a distintas especies microbianas, que sean seguros durante su empleo y que tengan acción bactericida residual para proteger a las superficies de la adhesión bacteriana. Asimismo, el empleo de superficies con propiedades antibacterianas que inhiban la formación de biofilms es una medida para evitar la propagación de bacterias patógenas o alterantes de la calidad de los alimentos. Los objetivos del presente trabajo fueron: evaluar la eficacia y el efecto residual de productos desinfectantes, evaluar superficies con propiedades bacteriostáticas y estudiar la formación de biofilms de Flavobacterium psychrophilum en el sector de la acuicultura. De los resultados obtenidos, la acción bactericida del peróxido de hidrógeno frente a Staphylococcus aureus y Enterococcus hirae sobre superficies de acero inoxidable se incrementó al emplearlo conjuntamente con cloruro de benzalconio y polímeros catiónicos. Pseudomonas aeruginosa es más sensible en comparación de Staphylococcus aureus a la actividad bactericida de productos basados en peróxido de hidrógeno. Los productos basados en el cloruro de benzalconio presentaron efecto residual bactericida transcurridas 24 horas en las superficies tratadas. El hipoclorito de sodio presenta efecto residual al combinarse con otros compuestos como el hidróxido de sodio y el alcohol graso etoxilado. Escherichia coli es más sensible que Staphylococcus aureus y Klebsiella pneumoniae a la acción antibacteriana del triclosán en superficies de plástico. Las superficies con propiedades bacteriostáticas presentaron mayor grado de actividad en condiciones secas de ensayo en comparación de las condiciones húmedas, encontrándose una relación entre la concentración del compuesto bacteriostático y la inhibición bacteriana. En condiciones de acuicultura, se observó una mayor actividad bactericida de los desinfectantes sobre las superficies para el peroximonosulfato de sodio al 1,0%, hipoclorito de sodio al 5,25%, y la combinación de compuestos formados por tensoactivos y ácido láctico. Flavobacterium psychrophilum tiene la capacidad para formar biofilms en superficies de acero inoxidable, superficies plásticas, vidrio y madera. En estas condiciones, la adhesión bacteriana puede inhibirse empleando superficies plásticas con propiedades antibacterianas. / In prevention of the bacterial contamination from surfaces in the food processing environments, industries in this sector and domestic environments requires disinfectant products that have to be effective against different bacterial species, safe during their use and have bacterial residual action to protect surfaces of the bacterial adhesion. In the same way, the use of surfaces with antibacterial properties which inhibit the biofilm formation is a measure to prevent the spread of pathogenic bacteria and the spoilage of the food quality. The objectives of this study were to evaluate the efficacy and the residual effect of disinfectants products, evaluate the bacteriostatic properties of surfaces and study the biofilm formation produced by Flavobacterium psychrophilum in the aquaculture sector. From the results, the bactericidal action of hydrogen peroxide in Staphylococcus aureus and Enterococcus hirae on stainless steel surfaces is increased when it is used together with benzalkonium chloride and cationic polymers. Pseudomonas aeruginosa is more sensitive than Staphylococcus aureus to the bactericidal activity of products based on hydrogen peroxide. Benzalkonium chloride products showed bactericidal residual effect after 24 hours on the treated surfaces. Sodium hypochlorite has residual effect when it is combined with other compounds such as sodium hydroxide and ethoxylated fatty alcohol. Escherichia coli is more sensitive than Staphylococcus aureus and Klebsiella pneumoniae to the antibacterial action of triclosan on plastic surfaces. Surfaces with bacteriostatic properties showed greater activity in dry conditions compared to wet conditions, which demonstrated a relationship between the bacteriostatic compound concentration on the surfaces employed and the bacterial inhibition. In the aquaculture conditions, the bactericidal activity on surfaces was higher for potassium peroxymonosulfate 1,0%, sodium hypochlorite 5,25%, and the combination of compounds of surfactants and lactic acid. The biofilm formation of Flavobacterium psychrophilum appeared on stainless steel surfaces, plastic surfaces, glass and wood. Under these conditions, the bacterial adhesion can be inhibited using plastic surfaces with antibacterial properties.

L’objectiu inicial de la present tesi és la miniaturització d’un sistema per a la mesura ràpida de la DBO en mostres d’aigua. Per això, s’incorporaran cultius microbians a dispositius microfluídics que permeten la realització de mesures electroquímiques. Aquest camp, que ha experimentat un ràpid creixement en els darrers anys, es basa la utilització d’elements biològics —com són espècies o comunitats microbiològiques, proteïnes o enzims— com a element sensor o com a reactor de mesures electroquímiques. Aquestes aproximacions haurien de ser vàlides i suficientment ràpides per ser utilitzades com a element de control en àmbits com el seguiment ambiental o processats industrials diversos. Això és rellevant, ja que els mètodes analítics emprats més habitualment requereixen de diversos dies per obtenir els resultats, fet que els fa inadequats per fer el seguiment de processos. A més a més, es planteja enfocar aquests desenvolupaments donant un paper clau a les eines de simulació i modelització matemàtica, de tal forma que es pugui validar el dispositiu dissenyat, en el major grau possible, abans d’entrar en les fases de fabricació i test experimental. Si bé les eines de simulació matemàtica ja són àmpliament utilitzades, en la major part dels casos s’utilitzen com a validació de dispositius que ja han estat fabricats i testats. Plantejar les simulacions matemàtiques com una eina combinada en la fase del disseny, implica que aquestes simulacions hauran d’abastar el conjunt d’elements rellevants per al problema o dispositiu, però a la vegada hauran de permetre contrastar els resultats i adaptar el disseny abans de les fases de més requeriments en recursos i temps, que són la fabricació de prototips i la seva validació experimental. Pel que fa a la fabricació del dispositiu, es maximitzarà l’ús de tecnologies ràpides i de baix cost, tant per al desenvolupament dels diferents prototips, com per ser una constricció remarcable de cara a la seva fabricació i introducció a gran escala. Finalment, també es tindrà l’objectiu que els dispositius construïts siguin el més versàtils possible, tant de cara a adaptar-los a altres usos i processos analítics com en termes de facilitar-ne la integració en altres dispositius, en la línia del que es coneix com a sistemes de lab-on-a-chip. / El objetivo inicial de esta tesis es la miniaturización de un sistema de medida rápida de la DBO en muestras de agua. Para eso, se incorporan cultivos microbianos a dispositivos microfluídicos que permitan la realización de medidas electroquímicas. Este campo, que ha experimentado un rápido crecimiento en los últimos años, se basa en la utilización de elementos biológicos –como son especies o comunidades microbiológicas, proteínas o enzimas– como elemento sensor o como reactor de medidas electroquímicas. Estas medidas deben ser válidas y suficientemente rápidas para ser utilizadas como elemento de control en ámbitos como el seguimiento ambiental o procesados industriales diversos. Esto es relevante, ya que los métodos analíticos utilizados más habitualmente requieren de varios días para obtener resultados, lo que los hace inadecuados para realizar el seguimiento de procesos. Además, se plantea enfocar estos desarrollos dando un papel clave a las herramientas de simulación y modelización matemática, de tal forma que se pueda validar el dispositivo diseñado, en el mayor grado posible, antes de entrar en la fase de fabricación y test experimental. Si bien las herramientas de simulación matemática ya son ampliamente utilizadas, en la mayor parte de los casos se utilizan como una validación de dispositivos que ya han sido fabricados y testados. Plantear las simulaciones matemáticas cómo una herramienta combinada en la fase de diseño, implica que estas simulaciones deben abarcar el conjunto de elementos relevantes para el problema o dispositivo, pero a su vez deberán permitir contrastar los resultados y adaptar el diseño antes de las fases de más requerimiento de recursos, que son la fabricación de prototipos y su validación experimental. En lo referente a la fabricación del dispositivo, se maximizará el uso de tecnologías rápidas y de bajo coste, tanto para el desarrollo de los diferentes prototipos, como por ser una constricción remarcables de cara a su fabricación e introducción a gran escala. Finalmente, también se ha tenido el objetivo que los dispositivos construidos sean lo más versátiles posible, tanto en el sentido de adaptarlos a otros usos y procesos analíticos como en términos de facilitar su integración en otros dispositivos, en la línea de lo que se conoce como sistemas de lab-on-a-chip. / The initial objective of this thesis is the miniaturization of a system for rapid measurement of the BOD (Biological Oxygen Demand) in water samples. So, microbial cultures are incorporated into microfluidic devices that enable electrochemical measurements. This field, which experienced a fast growth in recent years, is based on the use of biological elements –such as microbial species or communities, proteins or enzymes– as sensor element or reactor for electrochemical measures. These measures should be valid and fast enough to be used as a control parameter in areas such as environmental monitoring and various industrial processing. This is relevant because the analytical methods used most commonly require several days to get results, which makes them unsuitable for process monitoring. In addition, we propose to approach these developments giving a key role to simulation tools and mathematical modelling, so you can validate the device designed, to the greatest possible extent before entering the production and experimental test phases. While mathematical simulation tools are already widely used, in most cases they are used as a validation tool for devices that have already been manufactured and tested. Raise mathematical simulations how a combination tool in the design phase, implies that these simulations should cover all relevant elements for the problem or device, but in turn should allow contrast results to adapt the design before the more resource requiring phases, which are prototyping and experimental validation. With regard to device fabrication, the use of fast and low cost technology, for the development of the various prototypes, and as being a remarkable constriction towards their manufacture and large-scale introduction, will be maximized. Finally, it has also been a target for constructed devices to be as versatile as possible, both in the sense of adapting to other uses and analytical processes, and in terms of having an easy integration into other devices, in line with what is known as lab-on-a-chip systems.

El agua de consumo subministrada a través de las redes de distribución deviene alterada durante su circulación en el mismo debido a la actividad microbiana. Estos cambios en la calidad a menudo afectan al sabor, color y al olor. En otros casos, la calidad sanitaria de agua es alterada debido al recrecimiento bacteriano. La masa del agua, es el mayor hábitat de un sistema de aguas potables, aunque la mayoría de cambios significativos en sus propiedades tienen lugar en las superficies de contacto las cuales están colonizadas por microorganismos creciendo en diferentes comunidades microbianas adaptadas a los bajos niveles de nutrientes, altos niveles de cloro, formando biopelículas. Este trabajo demuestra que el agotamiento de cloro en el suministro de agua es clave para la proliferación microbiana en todo el sistema. Un nivel adecuado de cloro (~ 0,5 mg / l) es suficiente para garantizar la ausencia de biopelículas incluso después de eventos de contaminación microbiana o la entrada de carbono orgánico en el sistema. Sin embargo, la reducción de los niveles de cloro, incluso sin la adición de carbono o el aumento de la carga microbiana suspendida, permite el desarrollo de una comunidad unida en aproximadamente 2 semanas. En este escenario, la liberación de células microbianas en la fase acuosa se incrementó 10 veces en la ausencia de cloro. Episodios posteriores de agotamiento del cloro pueden acelerar el desarrollo de las comunidades microbianas con susceptibilidad reducida a la desinfección en los sistemas de agua potable real. Se necesitan enfoques alternativos de desinfección, no sólo para la distribución de agua potable, sino también para el control del crecimiento de biopelículas En este trabajo se ha evaluado la aplicabilidad de una nueva familia de desinfectantes llamados tiol bismuto (BT), que representan una nueva generación de agentes antibacterianos. Estos agentes están basados en el Bismuto, pero su actividad antibacteriana se ha mejorado notablemente en combinación con ciertos compuestos de tiol lipófilos. BTs exhiben efectos residuales más persistentes que el cloro a pesar de su acción relativamente lenta. BTs podrían ser especialmente útiles para los ecosistemas de agua artificiales en las que es muy difícil mantener un nivel constante de cloro libre, tales como sistemas de agua caliente o torres de refrigeración. Los BT tienen efectos residuales más persistentes que el cloro y la hiper-calefacción en los sistemas de agua. Eficiencia del BT aumentó con la temperatura, pero, al igual que los iones de cobre y plata, su acción es relativamente lenta. La combinación de efectos bactericidas y residuales puede prevenir la acumulación de limo en sistemas de agua caliente. / The water supply released into the distribution system is altered during its passage through the system due to a large extent to microbial activity. These quality changes most often result in complaints about taste, odour, and colour. In other cases, the sanitary quality of water is altered due to bacterial regrowth. The water body is the major habitat of drinking water systems, though the most significant changes in drinking water properties are at contact surfaces, which are colonized by microorganisms growing in diverse microbial communities adapted to low nutrient and high chlorine levels, forming biofilms. This work demonstrates that chorine depletion in the water supply is key to microbial proliferation throughout the system. An adequate level of chlorine (~0.5 mg/l) is enough to ensure the absence of biofilms, even after microbial contamination events or the input of organic carbon into the system. However, reducing chlorine levels, even without adding carbon or increasing the suspended microbial load, allows the development of an attached community in approximately 2 weeks. In this scenario, the release of microbial cells into the water phase increased 10-fold in the absence of chlorine. Subsequent episodes of chlorine depletion may accelerate the development of microbial communities with reduced susceptibility to disinfection in real drinking water systems. Alternative disinfection approaches are needed, not only for the distribution of safe water, but also for the control of biofilm growth. In this job has been evaluated the applicability of a new family of disinfectant called bismuth thiol (BT), which represents a new generation of antibacterial agents. These agents are bismuth based, but their antibacterial activity has been enhanced markedly in combination with certain lipophilic thiol compounds. BTs exhibit more persistent residual effects than chlorine despite their relatively slow action. BTs could be especially useful for artificial water ecosystems in which it is very difficult to maintain a constant level of free chlorine, such as hot water systems or cooling towers. BTs have more persistent residual effects than chlorine and hyper-heating in water systems. BT efficiency increased with temperature but, like copper–silver ions, its action is relatively slow. The combination of bactericidal and residual effects may prevent slime build-up in hot water systems.

Tesi realitzada a l'Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL) / INTRODUCTION. Tumor cells undergo a complete metabolic reprogramming which allows them to grow and proliferate fast. The metabolic changes are driven by oncogenes and tumor suppressors and are aimed to increase glycolysis and biosynthetic pathways and to reduce oxidative phosphorylation. Cancer cells rely on glucose not only to produce energy but also to synthesize all the biomolecules necessary for their proliferation. They prefer to use glycolysis rather than oxidative phosphorylation, even in presence of oxygen. This metabolic reprogramming can be a disadvantage for tumors when nutrients are limiting. Treatment with anti-glycolytic drugs, such as 2-deoxyglucose, or glucose withdrawal have been shown to sensitize to radiotherapy or chemotherapy or to TRAIL stimulation, making these treatments good candidates for cancer therapy. Glucose deprivation can induce different types of cell death, such as apoptosis, usually through the mitochondrial pathway, or necrosis. OBJECTIVE. This thesis focuses on understanding the molecular mechanisms of apoptosis induced by glucose deprivation in different cell lines. The objective was to determine which platform is activating caspase-8 under glucose deprivation, which seems to be different from the canonical DISC (death-inducing signaling complex). RESULTS. We have described that HeLa cells die in a caspase-dependent manner when subjected to glucose deprivation, as the co-treatment with the caspase inhibitor Q-VD protects from cell death. We also show that Q-VD co-treatment and the silencing of caspase-8 protects HCT116 deficient for Bax and Bak from cell death due to glucose deprivation. Then, we studied the role of the Ripoptosome in caspase-8 activation in HeLa cells subjected to glucose removal. As we already described in Bax/Bak deficient MEFs, in HeLa the knockdown of RIPK1 did not prevent cell death. However, we have demonstrated that FADD is essential for the execution of cell death under glucose deprivation. Recently, it has been shown that an intracellular DISC (iDISC) can be formed upon proteasome inhibition or endoplasmic reticulum stress on autophagosomal membranes, independently of death ligands. We demonstrated by immunoprecipitation and immunofluorescence that caspase-8 interacts with p62, LC3-II and ATG5, proteins that associate with autophagosome, under glucose deprivation. However, we were unable to show significant translocation of caspase-8 to these organelles, or an essential role of p62 to activate caspase-8 and induce apoptosis under glucose deprivation. Furthermore, we observed that glucose deprivation induces the endoplasmic reticulum stress in different cell lines, as demonstrated by the induction of ATF4 and CHOP. Moreover, glucose withdrawal results in the induction of death receptors of TRAIL. We have shown that ATF4, but not CHOP, is responsible for the induction of TRAIL-R2 (DR5) after glucose removal. We show by immunoprecipitation that DR5 interacts with caspase-8 and localizes mostly at Golgi apparatus before and after the treatment, where maybe it could be accumulating and recruiting caspase-8. Moreover, the knockdown of DR5 in HeLa cells protects from apoptosis due to glucose deprivation, an effect that is more significant when Bcl-xL is stably expressed in these cells, suggesting that a component of death upon glucose deprivation is dependent on the mitochondrial pathway. Finally, we describe that caspase-8 is located to filament-like structures in Bax/Bak deficient MEFs subjected to glucose deprivation. We show that those filaments co-localize with β-tubulin, suggesting that a cytoskeleton scaffold could be involved in caspase-8 aggregation and activation under glucose deprivation. CONCLUSIONS. These data suggest that glucose deprivation could be used as potential therapeutic strategy against tumors with impaired mitochondrial pathway of apoptosis. / INTRODUCCIÓN. Las células cancerosas dependen de la glucosa, no sólo para producir energía, sino también para sintetizar bio-moléculas necesarias para su proliferación, lo que las hace más sensibles a la escasez de glucosa. La privación de glucosa puede inducir diferentes tipos de muerte celular, tales como la apoptosis, generalmente a través de la ruta mitocondrial, o la necrosis. OBJETIVO. Esta tesis se centra en la comprensión de los mecanismos moleculares de la apoptosis inducida por la privación de glucosa en diferentes líneas celulares. El objetivo fue definir qué plataforma está activando la caspasa-8 bajo privación de glucosa. RESULTADOS. En primer lugar, hemos descrito que las células HeLa sometidas a la privación de glucosa mueren por apoptosis dependiente de caspasas ya que el co-tratamiento con el inhibidor de caspasas Q-VD protege de esta muerte. También mostramos que el Q-VD y el silenciamiento de la caspasa-8 protegen a las células HCT116 deficientes en Bax y Bak de la muerte causada por la retirada de glucosa. Entonces, se estudió el papel del Ripoptosoma en la activación de la caspasa-8. El silenciamiento de RIPK1 no impidió la muerte celular. Sin embargo, hemos demostrado que FADD es esencial para la ejecución de la muerte celular bajo la privación de glucosa. Demostramos por inmunoprecipitación e inmunofluorescencia que bajo privación de glucosa la caspasa-8 interactúa con p62, LC3-II y ATG5, proteínas que se asocian con el autofagosoma. Sin embargo, no hemos podido demostrar translocación significativa de la caspasa-8 a estos orgánulos, o un papel esencial de p62 en activar la caspasa-8 e inducir la apoptosis bajo privación de glucosa. Además, se observó que la privación de glucosa induce por un lado, estrés del retículo endoplásmico en diferentes líneas celulares, como demuestra la inducción de ATF4 y CHOP, y por otro lado la inducción de los receptores de muerte de TRAIL. Hemos demostrado que ATF4, pero no CHOP, es responsable de la inducción de TRAIL-R2 (DR5) después de la retirada de glucosa. CONCLUSIONES. Estos datos sugieren que la privación de glucosa podría ser utilizada como posible estrategia terapéutica contra tumores resistentes a la ruta mitocondrial de apoptosis.