Avaliou-se “in vitro" a capacidade antimicrobiana de substâncias utilizadas como curativo de demora em Endodontia (soluções de hidróxido de cálcio a 10%, paramonoclorofenol canforado, digluconato de clorexidina a 2% e detergente de mamona a 10%) sobre bactérias anaeróbias (Fusobacterium nucleatum ATCC 25586, Prevotella intermedia ATCC 33563 e Clostridium perfringens ATCC 13124). Os microrganismos foram recebidos liofilizados, reconstituídos, cultivados e estocados a -20oC até o momento de sua utilização, quando então foram reativados em caldo Reinforced Clostridial Medium (RCM), em caldo Brucella suplementado com hemina e vitamina k1 e também em placas de ágar dos mesmos meios acrescidos de 5% de sangue de carneiro. As substâncias testadas foram diluídas nos caldos RCM e Brucella suplementados, em microplacas e tubos. O inóculo foi preparado a partir de repiques do crescimento bacteriano nos dois caldos, buscando-se a concentração de 5 x 105 UFC/ml, avaliada através de leitura em espectrofotômetro. Quantidades iguais do inóculo foram acrescentadas às diluições das drogas, seguindo-se a incubação em anaerobiose. Em todos os testes foram utilizados controles positivos e negativos. Não foi possível a análise visual do crescimento no micrométodo, para determinar a concentração inibitória mínima (CIM); por essa razão, foi determinada a concentração bactericida mínima (CBM) em ágar sangue. Após a incubação dos caldos RCM (48 horas) e Brucella (96 horas), avaliou-se visualmente e através de espectrofotômetro a turvação do meio, para estabelecer a CIM, e semearam-se todos os tubos sem crescimento, para determinação da CBM. A microdiluição não se mostrou confiável para todas as drogas, na comparação com a macrodiluição. Observou-se que o caldo RCM apresenta melhor rendimento que o caldo Brucella. A clorexidina foi a droga que demonstrou melhor eficiência, com as menores CIMs, seguida pelo detergente de mamona, paramonoclorofenol canforado e hidróxido de cálcio. Observou-se, também, que a eficiência de cada droga varia para diferentes bactérias. O Clostridium perfringens exibiu maior resistência que o Fusobacterium nucleatum e a Prevotella intermedia, cujas CBMs foram, em geral, semelhantes para as diferentes drogas. / The antimicrobial activity of chemicals used as intracanal dressing in Endodontics (calcium hydroxide 10%, camphorated paramonochlorophenol, chlorhexidine digluconate 2% and mamone detergent 10% solutions) against anaerobic bacteria (Fusobacterium nucleatum ATCC 25586, Prevotella intermedia ATCC 33563 and Clostridium perfringens ATCC 13124) was evaluated, using broth microdilution and macrodilution methods. The microorganisms were reference strains received lyophilized, that were reconstituted, cultivated and maintained at -20o C until use, when they were reactivated using Reinforced Clostridial Medium (RCM) and Brucella broth supplemented with hemin and vitamin k1, and also the same agar media with 5% blood sheep. The chemicals were diluted in both broths in microplates and tubes. The inoculum was prepared in the same broths from subcultures made in each of them, that means a concentration of 5 x 105 bacteria/ml, and equal amounts were added to the drugs dilutions, proceeding after the incubation at 37o C in anaerobic jars. It was not possible the visual analysis of bacterial growth by the micromethod, for the minimal inibition concentration (MIC) determination, thence the determination of minimal bactericidal concentration (MBC) by the subculture on blood agar plates. The media turbidity in macromethod was visually and by spectrophotometer evaluated after 48 hours and 96 hours incubation of RCM and Brucella broths, respectively, to determine the CIM and from that, the CBM, in agar media. The analysis of methods showed that the microdilution method is not trustful for all chemicals in comparing to macrodilution method and also, that the RCM broth works better than Brucella broth. There was more efficient activity of chlorhexidine digluconate, followed by mamone detergent, camphorated paramonochlorophenol and calcium hydroxide. The efficiency of each drug varies for different bacteria. The highest resistance was seen with Clostridium perfringens, with Fusobacterium nucleatum and Prevotella intermedia showing similar CBMs for different drugs.

Orientador: Semíramis Guimarães Ferraz Viana / Banca: Ana Julia Urias / Banca: Regina Maura Bueno Franco / Banca: Paulo Câmara Marques Pereira / Banca: Paulo Eduardo Martins Ribolla / Resumo: O presente estudo foi realizado para investigar a epidemiologia de parasitas intestinais em uma população de escolares do município de Pratânia, Estado de São Paulo, e caracterizar geneticamente os isolados de Giardia duodenalis obtidos dos indivíduos desse grupo. Amostras de fezes de 431 escolares da rede municipal com idade de três a 10 anos e formalmente autorizados a participar do estudo foram colhidas e processadas pelo método de centrífugo-flutuação e pelo kit TF-test®. Além do exame coproparasitológico, as crianças foram submetidas a avaliações clínica e antropométrica e aos pais e/ou responsáveis foi aplicado um questionário para a obtenção de dados epidemiológicos. As crianças parasitadas foram encaminhadas para tratamento de acordo com a prescrição médica e, após 15 a 21 dias do tratamento, novas amostras de fezes foram analisadas para o controle de cura. Para a caracterização genotípica, o DNA extraído de 131 (39 extraídas de amostras positivas e 92 de amostras negativas para Giardia) foi amplificado utilizando técnicas baseadas em PCR para a amplificação das seqüências correspondentes aos genes gdh (glutamato desidrogenase) e tpi (triose-fosfato-isomerase) e os fragmentos amplificados foram seqüenciados. Os seguintes enteroparasitas detectados e suas respectivas freqüências foram: Entamoeba coli (14,2%), Cryptosporidium (11,2%), Giardia duodenalis (9,3%), Endolimax nana (3,3%), Blastocystis hominis (1,62%), Enterobius vermicularis (2,3%), Trichuris trichiura (1,62%), Ascaris lumbricoides (0,7%), e Hymenolepis nana (0,2%). Nas crianças com enteroparasitas, crianças portadoras de infecções por Cryptosporidium, por helmintos e por protozoários comensais, as frequências de infecções foram significativamente mais elevadas quando nas famílias os responsáveis não eram alfabetizados ou se o tempo de escolaridade... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: This study was conducted to investigate the epidemiology of intestinal parasites in a population of school children of Pratânia, Estado de Sao Paulo, and genetically characterize isolates of Giardia duodenalis obtained from individuals in this group. Stool samples from 431 schoolchildren aged three to 10 years and formally authorized to participate in the study were collected and processed by means of flotation and the TF-test kit ®. In addition to fecal examination, the children underwent clinical and anthropometric evaluation and parents or guardians received a questionnaire to get additional data. Children positive for intestinal parasites were referred for treatment in accordance with the prescriptions and, after 15 to 21 days of treatment, new samples were analyzed for the control of cure. To genetic characterization, DNA extracted from 131 (39 extracted from positive samples and 92 samples negative for Giardia) was amplified using techniques based on PCR amplification of sequences corresponding to genes gdh (glutamate dehydrogenase) and tpi (triosephosphate isomerase) and amplified fragments were sequenced. The intestinal parasites were detected following frequencies: Entamoeba coli (14.2%), Cryptosporidium (11.2%), Giardia duodenalis (9.3%), Endolimax nana (3.3%), Blastocystis hominis (1, 62%), Enterobius vermicularis (2.3%), Trichuris trichiura (1.62%), Ascaris lumbricoides (0.7%), and Hymenolepis nana (0.2%). In children with intestinal parasites, children with Cryptosporidium infection, helminth and protozoan, the frequencies of infections were significantly higher in families where those responsible were illiterate or if the level of education was no more than five years (P < 0.05). With regard to anthropometric measurements, most children presented to the height / age index, weight / age and weight / height values of z-scores within the normal range... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Sporotrichosis is a cosmopolitan subcutaneous mycosis, found mainly in tropical and subtropical areas of Latin America, caused by species of Sporothrix schenckii complex. The aim of this study was to demonstrate the capacity of Sporothrix schenckii complex to produce in vitro biofilms and to determine the profile of these biofilms against to classical antifungal drugs. Four species from Sporothrix schenckii complex were used: S. brasiliensis (n=10), S. schenckii sensu stricto (n=2), S. globosa (n=2) and S. mexicana (n=4). The formation of biofilms was performed by transferring inoculum of 2 x 105 conidia/mL for microdilution plates, which were incubated at 25 ÂC for 5 days. After each day of incubation, XTT and Crystal Violet assays were made to determine the metabolic activity and biomass of biofilm, respectively. For susceptibility tests, three different concentrations (planktonic MIC, 10 x MIC and 50 x MIC) of antifungals amphotericin B (AMB), caspofungin (CAS), ketoconazole (KTC), voriconazole (VRC) and fluconazole (FLC) were transferred to biofilm wells, which were incubated for 72 hours at 25 ÂC. The biofilms profile then antifungal drugs presence was determined by the XTT and crystal violet assays. Biofilms were produced in Thermanoxâ coverslips for viewing by optical microscopy with congo-red staining, scanning electron microscopy and confocal microscopy. It was found that all species from S. schenckii complex are strong biofilm-forming, with no difference formation between them. Absorbance of biofilm after drug exposure showed that biomass and metabolic activity was significantly reduced (p<0.05), mainly in S. brasiliensis. Antifungal drugs tested showed metabolic activity and biomass reduction, especially at concentrations 50 times higher than the planktonic MICs, demonstrating the protective increase in sessile form when compared for planktonic form. / A esporotricose à uma micose subcutÃnea cosmopolita, encontrada, principalmente, em Ãreas tropicais e subtropicais da AmÃrica Latina, sendo causada por espÃcies do complexo Sporothrix schenckii. O objetivo deste estudo foi demonstrar a capacidade de fungos do complexo S. schenckii de produzir biofilmes in vitro e determinar o perfil desses biofilmes frente Ãs drogas antifÃngicas clÃssicas. Foram utilizadas 4 espÃcies do complexo Sporothrix schenckii: S. brasiliensis (n=10), S. schenckii sensu stricto (n=2), S. globosa (n=2) e S. mexicana (n=4). A formaÃÃo dos biofilmes foi feita atravÃs da transferÃncia de inÃculos de 2 x 105 conÃdios/mL para placas de microdiluiÃÃo, que foram incubadas a 25 ÂC por 5 dias. ApÃs cada dia de incubaÃÃo, realizaram-se ensaios de XTT e Cristal violeta, para se determinar a atividade metabÃlica e biomassa dos biofilmes, respectivamente. Para os ensaios de sensibilidade, trÃs concentraÃÃes diferentes (MIC planctÃnico, 10 x MIC e 50 x MIC) dos antifÃngicos anfotericina B (AMB), caspofungina (CAS), cetoconazol (KTC), voriconazol (VRC) e fluconazol (FLC) foram transferidas para os poÃos com biofilmes, que foram incubados por 72 horas a 25 ÂC. O perfil dos biofilmes frente Ãs drogas antifÃngicas foi determinado atravÃs de ensaios de XTT e cristal violeta. Biofilmes foram produzidos em lamÃnulas de Thermanoxâ para visualizaÃÃo atravÃs de microscopia Ãptica com coloraÃÃo de vermelho-congo, microscopia eletrÃnica de varredura e microscopia confocal. Verificou-se que todas as espÃcies do complexo S. schenkii sÃo fortes formadoras de biofilme, nÃo havendo diferenÃa de formaÃÃo entre as espÃcies. A absorbÃncia dos biofilmes apÃs exposiÃÃo Ãs drogas demonstrou que a biomassa e a atividade metabÃlica foram reduzidas de forma significativa (p<0,05), principalmente, em S. brasiliensis. Os antifÃngicos testados mostraram reduÃÃo na atividade metabÃlica e biomassa, principalmente, em concentraÃÃes 50 vezes maiores que os MICs planctÃnicos, demonstrando o incremento protetivo que a forma sÃssil possui frente à forma planctÃnica.

A atrazina (ATZ) foi utilizada em experimentos de laboratório para estudos de mineralização e dessorção em amostras de Argissolo Vermelho (PV) e Vertissolo Ebânico (VE), sob campo nativo, com o intuito de identificar os atributos do solo que afetam estes processos. A influência da umidade do solo sobre a atividade microbiana foi avaliada variando-se os teores de umidade em 20, 40, 65 e 85% da capacidade de água disponível do solo (CAD) e aplicando-se 1,5 kg de princípio ativo ha-1 (menor dose recomendada (DR)). Para a avaliação do efeito das doses do herbicida ATZ sobre a atividade microbiana e sobre a taxa de degradação do herbicida foram feitas aplicações de 1x, 2x, 4x, 7x e 10x a DR. Na avaliação do efeito da matéria orgânica sobre a atividade microbiana e sobre a taxa de degradação da ATZ foi feita a aplicação de 10x a DR. Num estudo adicional foram testados quatro métodos de desinfestação de solos (fumigação, tindalização, autoclavagem e irradiação em forno de microondas). A determinação da ATZ na solução foi feita por cromatografia gasosa em extratos de metanol. A atividade microbiana foi monitorada pela evolução de CO2 e a microbiota foi avaliada pela contagem de unidades formadoras de colônias Os resultados indicam que a população microbiana apresenta maior atividade entre 65 e 85% de umidade da CAD e que o aumento das doses de aplicação da ATZ não provoca alterações relevantes na atividade microbiana. Aproximadamente 70% do herbicida aplicado fica sorvido ao solo, independentemente de dose de ATZ aplicada e da classe de solo estudada (PV e VE). As taxas de degradação da ATZ lábil foram baixas e dependentes de doses e tipos de solos, sendo maiores em doses mais elevadas e em solos com maior teor de C. Dentre os métodos de desinfestação, a irradiação em forno de microondas foi o mais adequado, uma vez que apresentou um comportamento similar à testemunha quanto à sorção do herbicida e foi eficiente na redução da população microbiana do solo.

A incidência de infecções microbianas relacionadas ao uso de cateteres vem aumentando. Uma característica importante dos microrganismos envolvidos é a capacidade de aderência à superfícies com conseguinte formação de colônia, produção de substâncias extracelulares, e subsequente formação de uma matriz compacta, amorfa, de múltiplas camadas, o biofilme. A atividade de bacteriocinas produzidas por Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis sobre microrganismos isolados de dispositivos intravasculares foi avaliada. As bacteriocinas Pep5 e Epidermina inibiram um maior número de isolados clínicos quando avaliadas in vitro por antagonismo direto, apresentando halos de inibição de 20 a 36 mm. A adição de Pep5 e Epidermina durante o crescimento de S. epidermidis e Corynebacterium sp resultou na redução do número de células viáveis. O efeito das bacteriocinas sobre a adesão bacteriana à cateteres de silicone foi avaliado através de três protocolos onde variou-se o momento de adição da bacteriocina: (A) simultaneamente, (B) previamente, e (C) posteriormente ao inóculo microbiano. As bacteriocinas Pep5 e Epidermina reduziram significativamente o número de células de S. epidermidis e Corynebacterium sp. aderidas aos cateteres após 6 h e 12 h de incubação. Não foram observadas diferenças importantes entre os três protocolos A, B, ou C. O efeito de Pep5 sobre Corynebacterium sp. foi verificado por microscopia eletrônica de varredura, podendo ser observadas áreas com resíduos celulares na superfície do cateter. / The in cidence of catheter-related microbial infections has been increasing. One important characteristic of related microorganisms is the adhesion to surfaces with colony formation, production of extracellular substances, and subsequent development of a compact, amorphous, multiple layer matrix, the biofilm. The activity of bacteriocins produced by Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis against microorganisms isolated from intravascular catheters was studied. The bacteriocins Pep5 and Epidermin inhibited a higher number of clinical isolates when evaluated by direct antagonism, showing inhibition zones of 20 to 36 mm. The addition of Pep5 and Epidermin during growth of S. epidermidis and Corynebacterium sp. resulted in a decrease of viable cell counts. The effect of bacteriocins on bacterial adhesion to silicon catheter was evaluated through three protocols differing in the time of bacteriocin addition: (A) simultaneously, (B) before, and (C) after the microbial inoculum. The bacteriocins Pep5 and Epidermin caused a significant reduction of the number of adhered cells of S. epidermidis and Corynebacterium sp. after 6 h and 12 h. No important differences among the protocols A, B or C were observed. The effe tions ct of Pep5 on Corynebacterium sp. was studied by scanning electron microscopy. Sec with cellular residues were observed on the catheter surface.

Doutoramento em Ciências Farmacêuticas / PhD in Pharmaceutical Sciences

Doutoramento em Ciências Farmacêuticas / PhD in Pharmaceutical Sciences

L'objectiu principal d'aquest treball experimental ha estat l'estudi dels biofilms fototròfics d'ambients hipogeus, el que ens ha permès d'aprofundir sobre les tècniques d'observació, els organismes i el monitoratge de les comunitats fotosintètiques que s'hi desenvolupen. S'han posat a punt i/o s'han millorat tècniques per examinar l'estructura tridimensional dels biofilms i per identificar els microorganismes i llurs pigments fotosintètics. Amb la informació obtinguda, s'han assajat mètodes per al control i la prevenció del seu desenvolupament.La microscòpia confocal ens ha permès l'observació dels nuclis o nucleoides i els plans de divisió cel·lular en l'espai; la forma, l'organització i el gruix de les beines mucilaginoses que envolten els microorganismes fotosintètics, així com les substàncies polimèriques extracel·lulars presents al biofilm. Gràcies a l'autofluorescència dels pigments fotosintètics s'ha pogut reconèixer diferents caràcters com plans de divisió, distribució dels til·lacoids i/o de cloroplasts, localització de cèl·lules especialitzades o tipus de ramificació, per a la identificació i la caracterització dels cianobacteris i altres microorganismes fotosintètics. El processament de les seccions per obtenir els diferents tipus d'imatges tridimensionals va permetre caracteritzar l'estructura dels biofilms, mostrant la distribució espacial dels microorganismes, els EPS i el substrat, així com la disposició i la morfologia dels microorganismes en profunditat i la porositat d'aquestes comunitats.També es va elaborar un programa informàtic on es van implementar les diferents funcions de quantificació útils per a l'estudi d'aquestes comunitats: biovolum, distribució de biomassa, gruix mitjà, distribució del gruix, rugositat, porositat i distribució de la porositat, i cobertura de la superfície. Pel que fa a l'anàlisi dels pigments fotosintètics presents en cadascun dels microorganismes fototròfics, s'ha posat a punt un mètode per obtenir els espectres de fluorescència d'una àrea seleccionada de la mostra mitjançant el microscopi confocal espectral. Espècies pertanyents a diferents grups filogenètics, com Cyanobacteria, Bacillariophyta o Chlorophyta, van presentar unes característiques i unes propietats de fluorescència dels seus pigments característiques que en permetien la discriminació respecte d'altres grups filogenètics. Així mateix, amb aquesta tècnica es va poder determinar quines eren les espècies de cianobacteris amb ficoeritrina i sense.Posteriorment, s'han determinat els microorganismes fotosintètics més representatius de diferents tipus de cavitats naturals i catacumbes, així com la seva distribució i els factors ambientals a què estan sotmesos, en la natura i en cultiu. En els ambients hipogeus prospectats, la temperatura i la humitat eren relativament elevades i constants, mentre que la llum, tant la solar que entrava en coves i avencs, com l'artificial, per il·luminar coves turístiques o catacumbes, semblava el factor determinant de la presencia i la distribució dels microorganismes i dels biofilms que formaven. En les tres cavitats naturals estudiades al massís càrstic del Garraf (Barcelona, NE Espanya), la temperatura, la humitat relativa i la llum, presentaven clars gradients, des de l'entrada fins a una certa profunditat, on les condicions romanien constants. Els biofilms formats per cianobacteris cocals mucilaginosos i de color fosc es van tornar més prims amb la disminució de la llum i gradualment van ser substituïts per biofilms formats per cianobacteris filamentosos amb beines transparents calcificades, com Geitleria calcarea i Loriella osteophila, que produïen taques blanques a les parets. En general, a l'entrada de les cavitats es va observar la majoria d'espècies trobades pertanyents als grups Chlorophyta i Bacillariophyta. Els líquens crustacis de l'entrada de les cavitats van ser substituïts per altres de tal·lus leprós, com Botryolepraria lesdainii i Macentina stigonemoides. L'autofluorescència i el marcatge selectiu dels EPS han permès seguir la formació de les substàncies mucilaginoses que intervenen en els primers passos dels processos d'adhesió dels hormogonis. En alguns taxons de cianobacteris filamentosos, com Leptolyngbya spp. i Scytonema spp., els extrems polisacarídics dels hormogonis semblen actuar com a mecanismes d'adhesió, com una mena de goma d'enganxar al començament de l'adhesió al substrat. A les Catacumbes Romanes, els principals organismes formadors de biofilms van ser les molses i els cianobacteris filamentosos amb beina. L'estructura dels biofilms era heterogènia, especialment en gruix, densitat i composició d'organismes. De manera semblant al cas de les coves i els avencs, es va observar una diversitat decreixent en els biofilms fototròfics en disminuir la irradiància. Atès que la llum fou el factor més important que influïa en aquests biofilms i que el rang de longituds d'ona menys absorbit corresponia a la zona del verd (500-560 nm), es va avaluar el potencial de la llum verda per prevenir el creixement del biofilms fototròfics. Es va examinar el seu efecte en biofilms formats pel cianobacteri Gloeothece membranacea (Cyanobacteria) i l'alga verda Chlorella sorokiniana (Chlorophyta). La resposta dels biofilms a la llum verda va comprendre diferències en la fluorescència dels pigments, el gruix dels biofilms, així com la simplificació de la seva estructura tridimensional, si es compara amb els biofilms sota llum blanca. També es va estudiar l'efecte que produeix la llum verda en la morfologia i la ultraestructura de l'espècie aerofítica Gloeocapsopsis magma, aïllada de la cova turística de Collbató (Barcelona, NE Espanya). Les beines de les cèl·lules sota llum verda no eren estratificades i les cèl·lules van ser significativament més llargues que les cèl·lules sota llum blanca de la mateixa edat. Respecte de la ultraestructura, les cèl·lules en llum verda contenien només alguns tilacoides distribuïts a l'atzar, grànuls de cianoficina i polifosfats dispersos en el citoplasma. Per altra banda, es va estudiar in situ l'efecte que produïa la suma de factors: la presència de llum verda i l'aplicació dels biocides convencionals - dues formulacions de clorur de benzoalconi - utilitzats en les neteges de les obres d'art. Es va seleccionar com a zona d'estudi model la cova de Collbató (Barcelona, NE Espanya). Els resultats d'aquest estudi van demostrar que els biocides redueixen la biomasa, registrada d'acord amb els nivells de fluorescència comparats amb els dels controls. A més, sota llum verda i biocides, l'abundància de Scytonema julianum i altres espècies predominants va disminuir, excepte en els casos de Nostoc punctiforme i Gloeocapsopsis magma, ambdues cobertes amb beines de polisacaràrids molt gruixudes i amb un ampli ventall de pigments accessoris. Atès que la llum verda contribueix a alentir el creixement dels microorganismes fotosintètics i fa que penetrin menys a l'interior dels substrats; pot esdevenir una estratègia eficient per evitar el biodeteriorament de monuments hipogeus il·luminats artificialment, fins i tot en els dominats per cianobacteris rics en pigments accessoris, com la ficoeritrina. / Caves with dim natural light, and lighted hypogean environments, have been found to host phototrophic microorganisms from various taxonomic groups. These microorganisms group themselves into assemblies known as communities or biofilms, which are associated with rock surfaces. In this work, the phototrophic biofilms that colonise speleothems, walls and floors in three tourist caves (Spain) and Roman hypogean monuments (the St. Callistus and St. Domitilla catacombs, Rome, Italy) were studied. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) and scanning (SEM) and transmission electron microscopy (TEM) were used to study these organisms and acquire three-dimensional data on their biofilm structure. CLSM was used in a multi-channel mode whereby the different channels map individual biofilm components. Photosynthetic organisms were visualized by their in vivo pigment fluorescence, whereas extracellular polymeric substances (EPS) and the DNA structures of photo- and heterotrophic microorganisms were determined by staining with Concanavalin-A (Con-A) conjugated to the fluorophore label Alexa Fluor 488 and with the fluorophore label Hoechst 33258, respectively. The reflection mode revealed calcified sheaths and inorganic substrata. The distribution of microorganisms and EPS in the biofilms, and the relationship between the biofilms and their substrata, were studied by image analysis. Cyanobacteria, green microalgae, diatoms, mosses and lichens were found to be grouped as biofilms that differed according to the sampling sites. A confocal technique for the analysis of fluorescent pigments from a single cell, based on spectrofluorometric methods is also reported. Analysis of fluorescent pigments allows the establishment of a simultaneous relationship among in vivo pigment identification, organism morphology and 3D localization of cells that have particular fluorescence signatures within the biofilms. Finally, an evaluation of the use of monochromatic green light (GL) illumination as a method for preventing biofilm growth was performed. The CSLM permitted a comparison of the effects of illuminating photosynthetic biofilms with GL and with white light (WL). The results show retarded biofilm growth in the case of the former, suggesting the utility of GL for the illumination of cultural patrimony sites that are threatened by photosynthetic biofilms.

La producció de proteïnes homòlogues i heteròlogues a escala industrial requereix sistemes d’expressió variats i eficients. Els bacteris grampositius, com Streptomyces, poden ser una alternativa per a la producció de proteïnes recombinants ja que aquestes són produïdes i secretades al medi. La seqüenciació del genoma d’algunes espècies de Streptomyces i el seu anàlisi post-genòmic ha permès determinar i caracteritzar la seva maquinària de secreció. Així, se sap que els precursors de les proteïnes que s’han de secretar són exportats majoritàriament per una via principal de secreció (via Sec) o bé per una via secundària (via Tat). Aquests precursors contenen un pèptid senyal de tipus I que permet la seva correcta translocació a través de la membrana plasmàtica, la seqüència del qual determina per quina de les dues vies es dirigeix. Un cop translocades, les peptidases senyal de tipus I (SPases) processen la majoria d’aquestes proteïnes secretades i les alliberen al medi extracel·lular en la seva forma madura. Estudis previs en la maquinària de secreció han determinat que Streptomyces lividans té quatre peptidases senyal Sip (SipW, SipX, SipY i SipZ) de les quals, SipY és la que desenvolupa el paper majoritari. La soca deficient en aquesta proteïna SipY té la capacitat de secreció notablement afectada però, paradoxalment, és un bon hoste per a la sobreproducció de proteïnes secretades, ja que presenta una activitat proteàsica considerablement disminuïda. En aquest treball s’ha estudiat la producció d’agarasa i de lacasa en la soca SipY- (S. lividans ΔsipY) a escala de bioreactor per avaluar si aquesta soca pot ser considerada com a possible hoste per a la producció de proteïnes recombinants per la indústria. Aquestes dues proteïnes se secreten majoritàriament per la via Tat. En el cas de l’enzim agarasa, el gen expressat prové de S. coelicolor A3(2) i s’ha produït l’enzim en discontinu amb la soca salvatge (S. lividans TK21pAGAs5) i la soca mutada (S. lividans ΔsipYpAGAs5). La soca S. lividans ΔsipYpAGAs5 ha presentat una millor producció i s’ha seleccionat el medi més adequat per tal de produir aquesta proteïna estudiant el seu comportament operant en continu. També s’han estudiat diferents estratègies en discontinu alimentat, entre les quals la major producció s’ha obtingut amb una addició de mannitol i evitant que aquesta font de carboni s’esgoti en el medi. En el cas de la lacasa, s’han construït tres soques en les quals el gen de la pròpia lacasa de S. lividans és regulat per tres promotors diferents: el promotor propi de la lacasa, el promotor del gen de resistència a eritromicina i el promotor del gen agarasa de S. coelicolor. La soca en el qual el gen és regulat pel promotor del gen agarasa (S. lividans ΔsipYpFD-DagA-laccase) ha estat seleccionada i s’ha estudiat la producció de l’enzim utilitzant mannitol o glucosa com a font de carboni en discontinu i discontinu alimentat. En l’operació en discontinu alimentat van ser necessàries dues addicions de glucosa per assolir els mateixos nivells de producció que amb una addició de mannitol. / Recombinant protein production on industrial scale requires varied and efficient expression systems. Gram-positive bacteria such as Streptomyces, may be an alternative since proteins are secreted through the medium. The sequence of the genome of several Streptomyces species and their post-genomic analysis has allowed to determine and characterize the secretion machinery. Two secretion pathways are mainly use in Streptomyces: Sec pathway and Tat pathway. Protein precursors contain type I signal peptide that allows a proper translocation though membrane and whose sequence determines which pathway must be used in order to export each protein. During its translocation, type I signal peptidases (SPases) cleave the signal peptide leading the secretion of the mature protein through the medium. Previous studies on the secretory machinery have described four signal peptidases in Streptomyces lividans (SipW, SipX, SipY and Sip Z) and they have postulate SipY as the one which develops the main role in protein secretion. SipY deficient strain has a secretion ability significantly affected but, paradoxically, it is a good host for the protein overproduction since it has a considerably reduced protease activity. In this work, we have studied the production of agarase and laccase in SipY- strain (S. lividans ΔsipY) in a bioreactor scale to assess whether this strain can be considered as a host for the production of recombinant proteins in the industry. These two proteins are mainly secreted by Tat pathway. Firstly, agarase from S. coelicolor A3(2) was cloned in a multicopy plasmid in S. lividans wild type strain and SipY- mutant strain (S. lividans TK21pAGAs5 and S. lividans ΔsipYpAGAs5). Batch cultures have been carried out and S. lividans ΔsipYpAGAs5 of which has presented better agarase production and it has been selected. Appropriated medium has been also selected operating in continuous. Secondly, focusing on laccase production, three strains have been constructed in which the homologous gene of S. lividans is regulated by three different promoters: its own promoter, the promoter of erythromycin resistance gene and the S. coelicolor agarase promoter. The strain in which the laccase gene is regulated by agarase promoter (S. lividans ΔsipYpFD-DagAplaccase) has been selected and studied in batch and fed-batch mode using mannitol or glucoses as carbon source. In fed-batch cultures, two glucose addition have been necessary to achieve the same production as unic mannitol addition.

La utilización de bacterias iniciadoras de fermentación maloláctica es de fundamental importancia para los elaboradores de vino comprometidos con la producción de vinos de alta calidad y sin riesgos para la salud, ya que estas bacterias han sido seleccionadas como poco productoras de aminas biógenas. Sin embargo, en ciertas condiciones se obtienen vinos con altos niveles de aminas biógenas, aun cuando estos vinos han sido inoculados con bacterias seleccionadas. En el presente trabajo, con la tipificación de bacterias aisladas de la fermentación maloláctica usando un método basado en RAPD-PCR, se demostró que el estárter maloláctico puede tener diferentes niveles de implantación y que a su vez, esto se correlaciona con la producción de aminas biógenas durante la fermentación maloláctica, lo cual explicaría los altos niveles de aminas obtenidos en vinos inoculados con estárteres malolácticos. Para entender como las diferentes prácticas enológicas afectan la implantación del estárter maloláctico, lisozima, nutrientes, co-inoculación con levaduras, o siembra del estárter por diferentes métodos (inoculación directa o pie de cuba) fueron estudiados respecto al nivel de implantación y producción de aminas biógenas. Luego de la fermentación maloláctica, las aminas biógenas pueden aumentar, degradarse o estar constantes durante el almacenamiento del vino una vez que este ha sido embotellado. Esto puede crear incertidumbre respecto al nivel que las aminas biógenas tendrán en el momento de su comercialización. En la segunda parte de esta tesis, se puso en evidencia la presencia de microorganismos y enzimas libres en el vino embotellado capaces de producir histamina durante su almacenamiento; también se sospecha la presencia de enzimas capaces de degradar histamina. Se estudió la relación entre esto, y el contenido de aminas al final de un año de almacenamiento; diferentes perfiles de vinos se identificaron: histaminogénicos, histaminoliticos e histamin-estables. Indicadores para estimar el riesgo de producción de histamina fueron propuestos. Siguiendo con el interés de investigar tecnologías que ayuden a producir vinos sin peligro para la salud del consumidor, el uso de técnicas biológicas para reducir los niveles de ocratoxina A (OTA) en vinos fue investigado. En la tercera parte de esta tesis, estárteres malolácticos fueron evaluados respecto a su capacidad para reducir OTA durante la fermentación maloláctica. Algunos estárteres, fueron capaces de reducir OTA en vinos conteniendo 13% de etanol. La reducción de OTA parece relacionarse con el pH del vino. La interacción entre la formación de aglomerados de protein-polifenoles en función del etanol y pH, y la interacción que esto podría tener en la capacidad de adopción fue discutido. La modificación de la pared celular debido al proceso de liofilización de los estárteres como causa posible de la capacidad reductora de los estárteres fue también abordado. Los resultados son prometedores, sin embargo, sería necesario profundizar en la investigación para entender los mecanismos ligados a la reducción de OTA producido por los estárteres malolácticos en vinos. / Malolactic bacterial starters are used in the production of high quality and safe wines because of their capabilities to produce low levels of biogenic amines and perform the malolactic fermentation under controlled conditions. However, in certain conditions, inoculated wines can have high biogenic amines content which is in contradiction with the expected performance of the bacterial starter. In the present work, it was demonstrated, by typification of bacterial strains using RAPD-PCR, that malolactic starters can present different levels of implantations and this is correlated with the biogenic amines produced during the malolactic fermentation, which can explain the unexpected results when malolactic starters are used. In order to understand how the implantation is affected by oenological practices, lysozyme, nutrients, co-inoculation with yeast, or application of different seeding methods (direct inoculation or pied de cuve) were studied regarding their impact on the level of implantation and biogenic amines production. On the other hand, biogenic amines in bottled wine evolve all along the storage period. Their content increase, decrease or stay constant, which creates incertitude regarding the levels of biogenic amines that the wine will have in the moment of its commercialization. In the second part of this thesis, we demonstrated the presence of microorganisms with decarboxylase capabilities and exocellular amine-decarboxylase enzymes in the bottled wine. The presence of amine-degrading enzymes is also suspected. The link between the latter and the biogenic amines found at the end of a year of storage were related and different histamine profiles were determined for the wines: histaminolitic, histaminogenic and histamine-stable. Some indicators to measure the risk of histamine development are proposed. In the search for technological means to help wine-makers to elaborate safe wines, the use of biological tools to reduce the levels of ochratoxin A (OTA) in wines was investigated. In the third part of this thesis, malolactic starters were screened by their property to reduce OTA during the malolactic fermentation. Some malolactic starters were able to obtain high OTA reductions in wines containing 13% ethanol. OTA reduction by starters seems to be related to the pH. The interaction between protein-polyphenols haze formation as function of ethanol and pH and the interaction that this might have on absorption phenomenon is discussed. Modification of cell wall by lyophylization process and its consequences on adsorption properties are also analyzed. The results are encouraging but more investigation is needed to understand OTA reduction mechanism carried-out by malolactic bacterial strains in wines.