Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:26Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-25Bitstream added on 2014-06-13T19:29:26Z : No. of bitstreams: 1 moyses_jb_me_sjrp.pdf: 500902 bytes, checksum: 4113db661a79aec0c0464003ea9482e1 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Os alimentos prontos para o consumo provenientes de escolas, conhecidos como merenda escolar, são amplamente distribuídos aos estudantes e, por este motivo, requerem um controle higiênico-sanitário satisfatório, pois o manuseio e as condições do local de preparo inadequados podem favorecer o desenvolvimento de micro-organismos, como bactérias, bolores e leveduras. Contudo, conferem maior destaque as bactérias, principalmente as patogênicas, representando um risco à saúde pública. Com isso, é imprescindível que sejam adotadas as Boas Práticas de Fabricação (BPF) e uma ferramenta eficaz para avaliação destes aspectos é o checklist. Outro problema em saúde pública se refere ao surgimento de linhagens resistentes a agentes antimicrobianos, principalmente pelo uso indiscriminado na terapia humana. Considerando os fatos mencionados, este trabalho teve como objetivo avaliar os aspectos higiênico-sanitários de alimentos prontos para o consumo produzidos e servidos em cozinhas de diferentes escolas públicas de um município da região Noroeste do Estado de São Paulo. Para tanto 103 amostras, envolvendo trinta de alimentos prontos para o consumo, 32 de água, 21 de swabs de esfregaços de superfícies de utensílios (tábuas de corte, facas e colheres) e vinte das mãos de manipuladores de alimentos foram submetidas a diferentes análises: determinação do Número Mais Provável (NMP) de coliformes totais e termotolerantes, pesquisas de Escherichia coli e Salmonella spp., contagem de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) de Bacillus cereus, Staphylococcus aureus (coagulase positiva), Clostrídios sulfito-redutores, bactérias aeróbias mesófilas, bolores e leveduras. As pesquisas de Salmonella spp., B. cereus, Clostrídios sulfito-redutores, bolores e leveduras foram específicas para... / Ready-to-eat food from schools, known as school meal, are widely distributed to students and, therefore, require a satisfactory hygienic-sanitary control, because the inadequate handling and the conditions of the locations of food preparation may favor the development of microorganisms such as bacteria, yeasts and molds. However, provides further highlight to the bacteria especially pathogenic, featuring as risk to the public health. Thus, it is imperative to adopt the Good Manufacturing Practices (GMP), and an effective tool for assessing these aspects is the checklist. Another important trouble in public health regards to the emergence of resistant strains to antimicrobials, especially by indiscriminate use in human therapy. Considering the mentioned facts, this study aimed to evaluate the hygienic-sanitary aspects of ready-to-eat food produced and served in kitchens from different public schools of a municipality in the northwestern region of São Paulo State. For this purpose 103 samples, involving thirty ready-to-eat food, 32 of water, 21 swabs of surfaces of utensils (cutting boards, knives and spoons) and twenty from the hands of food handlers were subjected to different analysis: determining the Most Probable Number (MPN) of total and thermotolerants coliforms, researches of Escherichia coli and Salmonella spp., count of Colony Forming Units (CFU) of Bacillus cereus, Staphylococcus aureus (positive coagulase), Clostridium sulphite-reducers, mesophilic aerobic bacteria, molds and yeasts. The researches of Salmonella spp., B. cereus, Clostridium sulphite-reducers, yeasts and molds were specific to the ready food and S. aureus (positive coagulase) was not evaluated in water. For the evaluation of GMP from school kitchens was used a checklist developed from current laws and to verify the... (Complete abstract click electronic access below)

O gênero Proteus é caracterizado pela rápida mobilidade, fenômeno denominado swarming . Quanto à homologia de seu DNA, apresenta apenas uma discreta relação com o da Escherichia coli. Freqüentemente relacionado com infecções urinárias, facilitadas pela sua capacidade em degradar uréia, tem sido encontrado colonizando cateteres e sondas vesicais, principalmente a espécie Proteus mirabilis. Devido a sua crescente importância na prática clínica, tanto como agente infeccioso de difícil erradicação, quanto como microrganismo com possibilidade de produzir β-lactamases de espectro expandido, seu controle no ambiente hospitalar tornou-se essencial. A necessidade da correta identificação dessa bactéria estimulou com que métodos de identificação molecular sejam constantemente estudados e aprimorados para essa finalidade. Métodos baseados em PCR têm se mostrado úteis, mas precisam ser validados para a rotina laboratorial. Diversos fatores de patogenicidade, ou seja, características biológicas de Proteus que favorecem a sua participação em processos infecciosos têm sido identificados, tais como: a capacidade de mobilidade e fixação celular, produção de protease, urease e hemolisina. Diversos autores inferem que a correta co-regulação desses fatores de virulência durante a diferenciação de swarming está relacionada com a capacidade de colonizar e invadir o tecido do hospedeiro. Vários estudos sugerem que extratos vegetais podem ser importantes produtos no controle de P. mirabilis ao interferir em sinais de quorum sensing , e consequentemente, na diferenciação celular e expressão de fatores de virulência. Neste sentido, os terpenos, compostos presentes em óleos essenciais, podem representar uma alternativa viável no controle de infecções por esses microrganismos. As proteases microbianas vêm se destacando como importantes fatores de virulência devido a ação direta sobre proteínas do hospedeiro, particularmente imunoglobulinas. O estudo em P. mirabilis tem sido focalizado na protease ZapA (mirabilisina), enzima capaz de degradar IgA, IgG, entre outras proteínas. Trabalhos relatam que não somente ZapA é regulada durante o swarming , mas também hemolisinas, fatores ligados à diferenciação celular e hiperprodução do flagelo. Assim sendo, na presente tese foram avaliados distintos sistemas via PCR (RAPD, ERIC-PCR, REP-PCR, BOX-PCR e ISSR) para caracterização molecular de isolados clínicos de P. mirabilis, o efeito de monoterpenos sobre a diferenciação celular e a produção de fatores de patogenicidade dessas bactérias, e realizado um estudo bioinformático sobre o complexo de metaloproteases com base no recentemente publicado genoma de P. mirabilis. / Submitted by Marcelo Teixeira (mvteixeira@ucs.br) on 2014-05-22T17:39:53Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Lessandra Michelim.pdf: 1136815 bytes, checksum: 25bc56ba17160011b1aba3b4e7732643 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-22T17:39:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Lessandra Michelim.pdf: 1136815 bytes, checksum: 25bc56ba17160011b1aba3b4e7732643 (MD5) / O gênero Proteus é caracterizado pela rápida mobilidade, fenômeno denominado swarming . Quanto à homologia de seu DNA, apresenta apenas uma discreta relação com o da Escherichia coli. Freqüentemente relacionado com infecções urinárias, facilitadas pela sua capacidade em degradar uréia, tem sido encontrado colonizando cateteres e sondas vesicais, principalmente a espécie Proteus mirabilis. Devido a sua crescente importância na prática clínica, tanto como agente infeccioso de difícil erradicação, quanto como microrganismo com possibilidade de produzir β-lactamases de espectro expandido, seu controle no ambiente hospitalar tornou-se essencial. A necessidade da correta identificação dessa bactéria estimulou com que métodos de identificação molecular sejam constantemente estudados e aprimorados para essa finalidade. Métodos baseados em PCR têm se mostrado úteis, mas precisam ser validados para a rotina laboratorial. Diversos fatores de patogenicidade, ou seja, características biológicas de Proteus que favorecem a sua participação em processos infecciosos têm sido identificados, tais como: a capacidade de mobilidade e fixação celular, produção de protease, urease e hemolisina. Diversos autores inferem que a correta co-regulação desses fatores de virulência durante a diferenciação de swarming está relacionada com a capacidade de colonizar e invadir o tecido do hospedeiro. Vários estudos sugerem que extratos vegetais podem ser importantes produtos no controle de P. mirabilis ao interferir em sinais de quorum sensing , e consequentemente, na diferenciação celular e expressão de fatores de virulência. Neste sentido, os terpenos, compostos presentes em óleos essenciais, podem representar uma alternativa viável no controle de infecções por esses microrganismos. As proteases microbianas vêm se destacando como importantes fatores de virulência devido a ação direta sobre proteínas do hospedeiro, particularmente imunoglobulinas. O estudo em P. mirabilis tem sido focalizado na protease ZapA (mirabilisina), enzima capaz de degradar IgA, IgG, entre outras proteínas. Trabalhos relatam que não somente ZapA é regulada durante o swarming , mas também hemolisinas, fatores ligados à diferenciação celular e hiperprodução do flagelo. Assim sendo, na presente tese foram avaliados distintos sistemas via PCR (RAPD, ERIC-PCR, REP-PCR, BOX-PCR e ISSR) para caracterização molecular de isolados clínicos de P. mirabilis, o efeito de monoterpenos sobre a diferenciação celular e a produção de fatores de patogenicidade dessas bactérias, e realizado um estudo bioinformático sobre o complexo de metaloproteases com base no recentemente publicado genoma de P. mirabilis.

Orientador: Pedro de Oliva Neto / Banca: Ary Fernandes Júnior / Banca: Valéria Marta Gomes Lima / Resumo: Devido à necessidade de obtenção de novas moléculas com ação antimicrobiana, o presente trabalho visou investigar a capacidade antagônica do extrato produzido pelo fungo Trichosporon asahii. O extrato foi obtido pela fermentação do fungo em fermentador de bancada 7L, a 28°C por 72 horas. O caldo fermentado foi centrifugado a 2500 rpm por 20 minutos, sendo o sobrenadante a fração denominada extrato bruto, que foi seco em estufa (37°C) e ressuspendido em água destilada, para testes de ação antimicrobiana contra os micro-organismos Candida albicans, Malassezia pachydermatis, Trichophyton mentagrophytes, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 e ATCC 27853, Xanthomonas campestris pv campestris. O teste de sensibilidade foi o de Concentração Bactericida e Fungicida Mínima (CBM e CFM), através da macrodiluição em tubos e plaqueamento. Numa segunda etapa, o extrato bruto foi submetido a uma separação líquido-líquido utilizando os solventes hexano e diclorometano, obtendo-se frações aquosa e orgânica. Numa última etapa de purificação, o extrato diclorometânico passou por uma cromatografia de troca-iônica, cromatografia em sílica gel e precipitação com sulfato de amônio. Foram calculados alguns parâmetros de fermentação do T. asahii, através dos métodos de quantificação de açúcares redutores, pH, viabilidade e brotamento das leveduras e quantidade total de células. O teste de sensibilidade do extrato bruto demonstrou apenas atividade antibacteriana (30000 µg/mL sobre P. aeruginosa ATCC 9027, 33000 µg/mL sobre P. aeruginosa ATCC 27853 e 75000 µg/mL sobre X. campestris). Observou-se uma diminuição da CBM para a fração diclorometânica (17500 µg/mL sobre P. aeruginosa ATCC 9027, 20000 µg/mL sobre P. aeruginosa ATCC 27853 e 60000 µg/mL sobre X. campestris). Na pré-purificação, o método que demonstrou maior eficácia para o propósito... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Nowadays there is a demand for new natural molecules that may contribute to the control of pathogenic microorganisms. In this study it was aimed to investigate the antimicrobial ability of the broth produced by the culture of the fungus Trichosporon asahii. The extract was obtained by fermentation of T. asahii bench 7 L fermenter at 28° C for 72 hours. The fermented broth was centrifuged at 2500 rpm for 20 minutes, and the supernatant fraction termed crude extract, which was dried in oven (37° C) and resuspended in distilled water for testing antimicrobial activity against the microorganisms Candida albicans, Malassezia pachydermatis, Trichophyton mentagrophytes, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 and ATCC 27853 and Xanthomonas campestris pv campestris. The method used for quantification of antibiotic was the Minimum Bactericidal and Fungicidal Concentration (MBC and MFC) by macrodilution tubes and plating. In a second stage, the crude extract was subjected to liquid-liquid separation using dichloromethane and hexane solvents to yield aqueous and organic fractions. A new purification step from the dichloromethanic fraction passed through an ion exchange chromatography, silica gel chromatography and by precipitation with ammonium sulfate. It was also calculated some fermentation parameters of T. asahii by analytical methods for quantifying reducing sugars, pH, cell viability, budding yeasts and total cells. The MBC test showed only antibacterial activity (33,000 µg/mL for P. aeruginosa ATCC 27853, 30,000 µg/mL for P. aeruginosa ATCC 9027 and 75,000 µg/mL for X. campestris). There was a decrease in the MBC for the dichloromethanic fraction (20,000 µg/mL for P. aeruginosa ATCC 27853, 17,500 µg/mL for P. aeruginosa ATCC 9027 and 60,000 µg/mL for X. campestris). In the pre-purification step, the ion exchange chromatography was the more effective method... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A utilização de fungicidas na agricultura para controle de pragas pode causar grandes impactos ambientais e as suas ações podem alterar quantitativa e qualitativamente a microbiota de solos expostos. O tebuconazole é um fungicida sistêmico do grupo dos triazóis que inibe o passo de desmetilação do carbono 14 do 24-metilenodihidrolanosterol, na biossíntese do ergosterol. Atualmente, as lavouras recebem repetidas aplicações deste em uma mesma cultura, propiciando o aparecimento de espécies resistentes à sua ação. Através do isolamento dos microrganismos encontrados em solos contaminados pode-se encontrar espécies resistentes e capazes de degradar este xenobiótico. O objetivo desse trabalho foi isolar, selecionar e avaliar a capacidade de biodegradação de tebuconazole por isolados microbianos de solos contaminados e de ambientes Amazônicos. Os microrganismos foram isolados a partir de técnicas de isolamento utilizando diferentes soluções. As bactérias isoladas foram submetidas a experimentos de seleção e biodegradação realizados em biorreatores e tolerância em agitador horizontal. Os fungos isolados foram submetidos a esta mesma avaliação, porém em cultivos estáticos. Os fungos isolados mostraram ser resistentes a 100 mg.L-¹ de tebuconazole, no entanto não foram capazes de degradá-lo. As bactérias selecionadas que apresentaram capacidade de degradar até 51% deste fungicida e tolerância de até 1 g.L-¹ foram identificadas como Enterobacter sakazakii e Serratia marcescens. Estas cepas apresentaram características interessantes para uma potencial utilização destas em remediação ambiental. Também foram testadas várias cepas de fungos recentemente isoladas dos ambientes Amazônicos, mas os mesmos não demonstraram qualquer tipo de resistência ou capacidade biodegradadora deste fungicida. / The use of fungicides in agriculture for the control of diseases can cause great environmental impacts and their actions can quantitatively and qualitatively modify microbial systems of exposed soils. Tebuconazole is a systemic fungicide of the group of the triazol that inhibits the sterol C-14 α-demethylation of 24-methylenedihydrolanosterol, a precursor of the cell membrane component ergosterol in fungi. Currently, crops receive repeated applications of these chemicals, inducing the appearance of resistant strains of bacteria and fungi. Through the isolation of microrgansims found in these soils, resistant species can be found that could be capable of degrading these xenobiotics. Thus, the objective of this work was to isolate microorganisms from contaminated soil and to evaluate the biodegradation of tebuconazole by them, as well as to test some recently isolated fungi strains from Amazon environment for this same purpose. Microorganisms were isolated by different methods of sampling soil. Screening of bacteria was performed on bioreactors, while tolerance to tebuconazole assays were performed on shaker. Screening of fungi was performed in static cultures. Some fungi were capable of growing in concentrations of 100 mg.L-¹ of tebuconazole, but proved unable to degrade this xenobiotic. Screening of bacteria resulted in some isolated capable of degrading up to 51% of the initial concentration of tebuconazole and were capable to tolerate up to 1 g.L-¹. These strains were identified by biochemical standard procedures as being Enterobacter sakazakii and Serratia marcescens species. These bacteria present some important characteristics for potential use on environmental bioremediation. Microorganisms isolated from Amazon did not show any resistances or biodegradation capabilities towards tebuconazole.

O gênero Proteus é caracterizado pela rápida mobilidade, fenômeno denominado swarming . Quanto à homologia de seu DNA, apresenta apenas uma discreta relação com o da Escherichia coli. Freqüentemente relacionado com infecções urinárias, facilitadas pela sua capacidade em degradar uréia, tem sido encontrado colonizando cateteres e sondas vesicais, principalmente a espécie Proteus mirabilis. Devido a sua crescente importância na prática clínica, tanto como agente infeccioso de difícil erradicação, quanto como microrganismo com possibilidade de produzir β-lactamases de espectro expandido, seu controle no ambiente hospitalar tornou-se essencial. A necessidade da correta identificação dessa bactéria estimulou com que métodos de identificação molecular sejam constantemente estudados e aprimorados para essa finalidade. Métodos baseados em PCR têm se mostrado úteis, mas precisam ser validados para a rotina laboratorial. Diversos fatores de patogenicidade, ou seja, características biológicas de Proteus que favorecem a sua participação em processos infecciosos têm sido identificados, tais como: a capacidade de mobilidade e fixação celular, produção de protease, urease e hemolisina. Diversos autores inferem que a correta co-regulação desses fatores de virulência durante a diferenciação de swarming está relacionada com a capacidade de colonizar e invadir o tecido do hospedeiro. Vários estudos sugerem que extratos vegetais podem ser importantes produtos no controle de P. mirabilis ao interferir em sinais de quorum sensing , e consequentemente, na diferenciação celular e expressão de fatores de virulência. Neste sentido, os terpenos, compostos presentes em óleos essenciais, podem representar uma alternativa viável no controle de infecções por esses microrganismos. As proteases microbianas vêm se destacando como importantes fatores de virulência devido a ação direta sobre proteínas do hospedeiro, particularmente imunoglobulinas. O estudo em P. mirabilis tem sido focalizado na protease ZapA (mirabilisina), enzima capaz de degradar IgA, IgG, entre outras proteínas. Trabalhos relatam que não somente ZapA é regulada durante o swarming , mas também hemolisinas, fatores ligados à diferenciação celular e hiperprodução do flagelo. Assim sendo, na presente tese foram avaliados distintos sistemas via PCR (RAPD, ERIC-PCR, REP-PCR, BOX-PCR e ISSR) para caracterização molecular de isolados clínicos de P. mirabilis, o efeito de monoterpenos sobre a diferenciação celular e a produção de fatores de patogenicidade dessas bactérias, e realizado um estudo bioinformático sobre o complexo de metaloproteases com base no recentemente publicado genoma de P. mirabilis. / O gênero Proteus é caracterizado pela rápida mobilidade, fenômeno denominado swarming . Quanto à homologia de seu DNA, apresenta apenas uma discreta relação com o da Escherichia coli. Freqüentemente relacionado com infecções urinárias, facilitadas pela sua capacidade em degradar uréia, tem sido encontrado colonizando cateteres e sondas vesicais, principalmente a espécie Proteus mirabilis. Devido a sua crescente importância na prática clínica, tanto como agente infeccioso de difícil erradicação, quanto como microrganismo com possibilidade de produzir β-lactamases de espectro expandido, seu controle no ambiente hospitalar tornou-se essencial. A necessidade da correta identificação dessa bactéria estimulou com que métodos de identificação molecular sejam constantemente estudados e aprimorados para essa finalidade. Métodos baseados em PCR têm se mostrado úteis, mas precisam ser validados para a rotina laboratorial. Diversos fatores de patogenicidade, ou seja, características biológicas de Proteus que favorecem a sua participação em processos infecciosos têm sido identificados, tais como: a capacidade de mobilidade e fixação celular, produção de protease, urease e hemolisina. Diversos autores inferem que a correta co-regulação desses fatores de virulência durante a diferenciação de swarming está relacionada com a capacidade de colonizar e invadir o tecido do hospedeiro. Vários estudos sugerem que extratos vegetais podem ser importantes produtos no controle de P. mirabilis ao interferir em sinais de quorum sensing , e consequentemente, na diferenciação celular e expressão de fatores de virulência. Neste sentido, os terpenos, compostos presentes em óleos essenciais, podem representar uma alternativa viável no controle de infecções por esses microrganismos. As proteases microbianas vêm se destacando como importantes fatores de virulência devido a ação direta sobre proteínas do hospedeiro, particularmente imunoglobulinas. O estudo em P. mirabilis tem sido focalizado na protease ZapA (mirabilisina), enzima capaz de degradar IgA, IgG, entre outras proteínas. Trabalhos relatam que não somente ZapA é regulada durante o swarming , mas também hemolisinas, fatores ligados à diferenciação celular e hiperprodução do flagelo. Assim sendo, na presente tese foram avaliados distintos sistemas via PCR (RAPD, ERIC-PCR, REP-PCR, BOX-PCR e ISSR) para caracterização molecular de isolados clínicos de P. mirabilis, o efeito de monoterpenos sobre a diferenciação celular e a produção de fatores de patogenicidade dessas bactérias, e realizado um estudo bioinformático sobre o complexo de metaloproteases com base no recentemente publicado genoma de P. mirabilis.

Submitted by Franciele Moreira (francielemoreyra@gmail.com) on 2017-09-29T19:49:45Z No. of bitstreams: 2 Tese- Laurine Lacerda Pigosso - 2016.pdf: 7314504 bytes, checksum: fad2e169b6b855dccd4a9cad2626868d (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-10-02T13:01:59Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese- Laurine Lacerda Pigosso - 2016.pdf: 7314504 bytes, checksum: fad2e169b6b855dccd4a9cad2626868d (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-02T13:01:59Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese- Laurine Lacerda Pigosso - 2016.pdf: 7314504 bytes, checksum: fad2e169b6b855dccd4a9cad2626868d (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-05-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Paracoccidoides brasiliensis and Paracoccidioides lutzii, the etiologic agents of paracoccidioidomycosis, cause disease in healthy and immunocompromised persons in Latin America. We developed a method for harvesting P. brasiliensis yeast cells from infected murine lung to facilitate in vivo transcriptional and proteomic profiling. P. brasiliensis harvested at 6 h post-infection were analyzed using RNAseq and LC-MSE. In vivo yeast cells had 594 differentially expressed transcripts and 350 differentially expressed proteins. Integration of transcriptional and proteomic data indicated that early in infection (6 h), P. brasiliensis yeast cells underwent a shift in metabolism from glycolysis to β-oxidation, upregulated detoxifying enzymes to defend against oxidative stress, and repressed cell wall biosynthesis. Bioinformatics and functional analyses also demonstrated that a serine proteinase was upregulated and secreted in vivo. To our knowledge this is the first study depicting transcriptional and proteomic data of P. brasiliensis yeast cells upon 6 h post-infection of mouse lung. / Paracoccidoides brasiliensis e Paracoccidioides lutzii, os agentes etiológicos da paracoccidioidomicose, causam doenças em pessoas saudáveis e imunocomprometidas na América Latina. Desenvolvemos um método para coletar células de levedura de P. brasiliensis de pulmão murino infectado para facilitar o estudo do perfil transcricional e proteômico in vivo. P. brasiliensis recuperados após 6 horas de infecção foram analisados usando RNAseq e LC-MSE. As células de levedura após passagem in vivo apresentaram 594 transcritos expressos diferencialmente e 350 proteínas diferencialmente expressas. A integração dos dados transcricionais e proteômicos indicou que ainda no início da infecção (6 h), as células de levedura de P. brasiliensis sofreram uma mudança no metabolismo da glicólise para β-oxidação, enzimas desintoxicantes reguladas para se defender contra o estresse oxidativo e repressão da biossíntese de parede. Análises de bioinformática e funcionais também demonstraram que uma serino proteinase foi regulada e secretado in vivo. Pelo o nosso conhecimento, este é o primeiro estudo que descreve a transcrição e dados proteômicos de células de levedura de P. brasiliensis após 6 h de infecção no pulmão de camundongo.

Conjuntament amb Dept. Microbiologia (Fac. Biologia) / The discovery of new biotechnological applications of hydroxy fatty acids such as the oxylipins, has provided the basisto explore new mechanisms of oxylipin biosynthesis in prokaryotes, as no evidence on the occurrence of oxylipin production in bacteria existed for a long time. In 2010, a diol synthase activity was biochemically characterized in Pseudomonas aeruginosa 42A2, an environmental strain isolated from oily-waste water, which enables accumulation oxylipins in the extracellular medium. This rare diol synthase activity has been described for the first time in bacteria, generating oxylipins with interesting properties by oxygenation of monounsaturated fatty acids, preferentially oleic acid. The catalytic mechanism proceeds through the dioxygenation of oleic acid to release (10S)-hydroperoxy-(8E)- octadecenoic acid (10S-HPOME), which is reduced to (10S)-hydroxy-(8E)- octadecenoic acid (10S-HOME) through a secondary non-enzymatic reaction, followed by conversion of the hydroperoxide intermediate into (75,10S)-dihydroxy¬(8E)-octadecenoic acid (7,10-DiHOME).However, the genes involved in oxylipin biosynthesis and transport to the extracellular medium, and the biological relevance of these metabolites in this bacterium remained unknown. The current work reports the first outer membrane transporter of oxylipins in P. aeruginosa, the ExFadLO, and identifies the operon structure of the genes coding for two previously uncharacterized enzymes involved in oleate-diol synthase activity, acting sequentially as oleic acid dioxygenase (10S-DOX) and hydroperoxide isomerase or diol synthase (7,10-DS) activities. These proteins belong to a new subfamily of bacterial enzymes, designated as FadCCPs, only found among P. aeruginosa species. Insights into this unique oleate-diol synthase metabolic route evolutionary pathway, and the possible biological relevance of oxylipin biosynthesis and metabolism in P. aeruginosa are discussed. Moreover, a biotechnological approach to P. aeruginosa oleate-diol synthase activity for oxylipin production is proposed. / Estudio global de la actividad oleato diol sintasa en Pseudomonas aeruginosa El descubrimiento de nuevas aplicaciones biotecnológicas de ácidos grasos hidroxilados tales como las oxilipinas, ha proporcionado las bases para explorar nuevos mecanismos de biosíntesis de oxilipinas en procariotas, ya que durante mucho tiempo no hubo evidencias sobre la producción de oxilipinas en bacterias. En 2010, se caracterizó bioquímicamente la actividad diolsintasa en Pseudomonas aeruginosa 42A2, una cepa del medio ambiente aisladaen aguas contaminadas con residuos oleaginosos, capaz de acumular oxilipinas en el medio extracelular. Esta actividad diol sintasa ha sido descrita por primera vez en bacterias, posibilitando la obtención de oxilipinas con propiedades interesantes mediante la oxigenación de ácidos grasos monoinsaturados, preferentemente el ácido oleico. El mecanismo catalítico descrito tiene lugar a través de la dioxigenación de ácido oleico para liberar ácido (105)-hidroperoxi-(8E)-octadecenoico (105-HPOME), que se reduce al ácido (105)-hidroxi-(8E)-octadecenoico (105-HOME) a través de una reacción secundaria no enzimática, seguido por la conversión del intermediario hidroperóxido a ácido (75,105)-dihidroxi-(8E)-octadecenoico (7,10-DiHOME). Sin embargo, los genes implicados en la biosíntesis de oxilipinas y su transporte al medio extracelular, así como la relevancia biológica de estos metabolitos en esta bacteria eran desconocidos. El presente trabajo describe el primer transportador de membrana externa de oxilipinas en P. aeruginosa, la proteína ExFadLO, e identifica el operón cuyos genes codifican dos enzimas no caracterizadas hasta el momento, que participan en la actividad oleato diol sintasa actuando de forma secuencial mediante las actividades dioxigenasa del ácido oleico (105-DOX) e hidroperóxido isomerasa o diol sintasa (7,10-DS). Estas proteínas pertenecen a una nueva subfamilia de enzimas bacterianas, designadas como FadCCPs, distribuidas únicamente entre las especies de P. aeruginosa. Además, se discuten nuevos aspectos en torno a la vía evolutiva de la ruta metabólica oleato diol sintasa,y la posible relevancia biológica de la biosíntesis de oxilipinas y su metabolismo en P. aeruginosa. Por último, se propone una aproximación biotecnológica de la actividad oleato diol sintasa de P. aeruginosa para la producción de oxilipinas. / L'activitat oleat diol sintasa va ser caracteritzada bioquímicament en Pseudomonas aeruginosa 42A2, una soque del medi ambient aïllat en aigües contaminades amb residus oleaginosos, capaç d'acumular oxilipines derivades de l'àcid oleic com els àcids (10S)-hidroperoxi-(8E)-octadecenoic (10S-HPOME), (10S)-hidroxi-(8E)- octadecenoic (10S-HOME) i (7S,10S)-dihidroxi-(8E)-octadecenoic (7,10-DiHOME) en el mediextracel·lular. Aquest treball descriu el primer transportador de membrana externa de oxilipines en P. aeruginosa, la proteïna ExFadLO, i identifica l'operó del qual gens codifiquen dos enzims no caracteritzades fins al moment, que participen en l'activitat oleat diol sintasa, actuant de forma seqüencial mitjançant les activitats dioxigenasa de l'àcid oleic (10S-DOX) i hidroperòxid isomerasa o diol sintasa (7,10-DS). Aquestes proteïnes pertanyen a una nova subfamília d'enzims bacterians, designades com FadCCPs, distribuïdes únicament entre les espècies de P. aeruginosa. A més, es discuteixen nous aspectes al voltant de la via evolutiva de la ruta metabòlica oleat diol sintasa i la possible rellevància biològica de la biosíntesi de oxilipinas i el seu metabolisme en P. aeruginosa. Finalment, es proposa una aproximació biotecnològica de l'activitat oleat diol sintasa de P. aeruginosa per a la producció de oxilipines.

Naphthenic acids (NAs) are an important group of organic pollutants mainly found in hydrocarbon deposits. Although these compounds are toxic, recalcitrant, and persistent in the environment, we are just learning the diversity of microbial communities involved in NAs- degradation and the mechanisms by which NAs are biodegraded. Studies have shown that naphthenic acids are susceptible to biodegradation, which decreases their concentration and reduces toxicity. Nevertheless, little is still known about their biodegradability. The present PhD Thesis’s work is aimed to study the biodegradation of simple model NAs using bacteria strains belonging to the Rhodococcus genus. In particular, Rh. sp. BCP1 and Rh. opacus R7 were able to utilize NAs such as cyclohexane carboxylic acid and cyclopentane carboxylic acid as the sole carbon and energy sources, even at concentrations up to 1000 mg/L. The presence of either substituents or longer carboxylic acid chains attached to the cyclohexane ring negatively affected the growth by pure bacterial cultures. Moreover, BCP1 and R7 cells incubated in the presence of CHCA or CPCA show a general increase of saturated and methyl-substituted fatty acids in their membrane, while the cis-mono-unsaturated ones decrease, as compared to glucose-grown cells. The observed lipid molecules modification during the growth in the presence of NAs is suggested as a possible mechanism to decrease the fluidity of the cell membrane to counteract NAs toxicity. In order to further evaluate this toxic effect on cell features, the morphological changes of BCP1 and R7 cells were also assessed through Transmission Electron Microscopy (TEM), revealing interesting ultrastructural changes. The induction of putative genes, and the construction of a random transposon mutagenesis library were also carried out to reveal the mechanisms by which these Rhodococcus strains can degrade toxic compounds such as NAs.

Folates (vitamin B9) are essential water soluble vitamins, whose deficiency in humans may contribute to the onset of several diseases, such as anaemia, cancer, cardiovascular diseases, neurological problems as well as defects in embryonic development. Human and other mammals are unable to synthesize ex novo folate obtaining it from exogenous sources, via intestinal absorption. Recently the gut microbiota has been identified as an important source of folates and the selection and use of folate producing microorganisms represents an innovative strategy to increase human folate levels. The aim of this thesis was to gain a fundamental understanding of folate metabolism in Bifidobacterium adolescentis. The work was subdivided in three main phases, also aimed to solve different problems encountered working with Bifidobacterium strains. First, a new identification method (based on PCR-RFLP of hsp60 gene) was specifically developed to identify Bifidobacterium strains. Secondly, Bifidobacterium adolescentis biodiversity was explored in order to recognize representing strains of this species to be screened for their folate production ability. Results showed that this species is characterized by a wide variability and support the idea that a possible new taxonomic re-organization would be required. Finally B. adolescentis folate metabolism was studied using a double approach. A quantitative analysis of folate content was complemented by the examination of expression levels of genes involved in folate related pathways. For the normalization process, required to increase the robustness of the qRT-PCR analysis, an appropriate set of reference genes was tested using two different algorithms. Results demonstrate that B.adolescentis strains may represent an endogenous source of natural folate and they could be used to fortify fermented dairy products. This bio-fortification strategy presents many advantages for the consumer, providing native folate forms more bio-available, and not implicated in the discussed controversy concerning the safety of high intake of synthetic folic acid.

Gut microbial acquisition during the early stage of life is an extremely important event since it affects the health status of the host. In this contest the healthy properties of the genus Bifidobacterium have a central function in newborns. The aim of this thesis was to explore the dynamics of the gut microbial colonization in newborns and to suggest possible strategies to maintain or restore a correct balance of gut bacterial population in infants. The first step of this work was to review the most recent studies on the use of probiotics and prebiotics in infants. Secondly, in order to prevent or treat intestinal disorders that may affect newborns, the capability of selected Bifidobacterium strains to reduce the amount of Enterobacteriaceae and against the infant pathogen Streptococcus agalactiae was evaluated in vitro. Furthermore, the ability of several commercial fibers to stimulate selectively the growth of bifidobacterial strains was checked. Finally, the gut microbial composition in the early stage of life in response to the intrapartum antibiotic prophylaxis (IAP) against group B Streptococcus was studied using q-PCR, DGGE and next generation sequencing. The results globally showed that Bifidobacterium breve B632 strain is the best candidate for the use in a synbiotic product coupled to a mixture of two selected prebiotic fibers (galactooligosaccharides and fructooligosaccharides) for gastrointestinal disorders in infants. Moreover, the early gut microbial composition was affected by IAP treatment with infants showing lower counts of Bifidobacterium spp. and Bacteroides spp. coupled to a decrement of biodiversity of bacteria, compared to control infants. These studies have shown that IAP could affect the early intestinal balance in infants and they have paved the way to the definition of new strategies alternative to antibiotic treatment to control GBS infection in pregnant women.