Contexte: KCNQ1: KCNE3 joue un rôle essentiel dans le mécanisme de sécrétion du Cl- dans le côlon distal. Ce canal K+ génère la force électromotrice nécessaire à la sécrétion apicale de Cl- par le recyclage basolatéral de K+. Il a précédemment été démontré que l'hormone stéroïde œstrogène (17β-œstradiol, E2) induit, spécifiquement chez la femelle un effet anti-sécrétoire dans les cryptes de côlon de rat via l'inhibition de KCNQ1:KCNE3. Cette thèse a pour but de déterminer les mécanismes moléculaires mise en jeu dans la régulation des fonctions du canal KCNQ1 par l'œstrogène, en particulier dans la sécrétion de Cl-, la prolifération et la migration des colonocytes. Cette thèse met en évidence la régulation de l'activité de KCNQ1 par l'œstrogène via l'endocytose et la dissociation du canal. Méthodes : Des cryptes isolées de côlon de rats ainsi que la lignée cellulaire HT29cl.19A ont été utilisées pour étudier les effets de l'œstrogène sur la sécrétion de Cl- et les fonctions du canal KCNQ1. Pour cela des techniques d'électrophysiologie, de biologie cellulaire et moléculaire ainsi que d'imagerie ont été utilisées. Résultats: Nous avons montré que l'œstrogène induit une rapide réduction de la sécrétion de Cl- et du courant KCNQ1; cette inhibition est maintenue au moins 2 heures. Nous avons aussi démontré que l'œstrogène induit une rapide internalisation du canal par la voie de signalisation suivante : PKCδ-AMPK-Nedd4.2. L'internalisation du canal est suivie d'un recyclage à la membrane qui présente un mécanisme bi-phasique; une phase rapide impliquant Rab4 et une phase plus lente via Rab11. L'œstrogène induit également une dissociation entre KCNQ1 et KCNE3 conduisant à la diminution de la conductance du canal. La thèse a également démontré le rôle de KCNQ1 dans la modulation de la migration des colonocytes induite par l'œstrogène. Conclusion : L'étude établit le rôle de l'œstrogène dans la régulation de la sécrétion d'électrolytes par la modulation de la densité de KCNQ1 à la membrane plasmique et la stabilité du complexe KCNQ1:KCNE3. Ici, est révélé un nouveau rôle pour KCNQ1 dans la modulation de la migration des colonocytes par l'œstrogène. Ainsi, l'œstrogène joue un rôle important dans l'homéostasie des cryptes de côlon par la régulation du taux de migration et de sécrétion des colonocytes. / Background : The KCNQ1:KCNE3 K+ channel is an essential component of the Cl- secretion machinery in the distal colon. This channel provides the driving force for apical Cl- secretion by basolateral recycling of K+. The steroid hormone estrogen (17β-estradiol, E2) has previously been reported to exert a female specific anti-secretory response in colonic crypts through the inhibition of the KCNQ1: KCNE3 channel. The purpose of this study was to uncover and describe molecular mechanisms of estrogen regulation of KCNQ1 channel function and its consequences for intestinal Cl- secretion, colonocyte proliferation and migration. The thesis reveals a novel estrogen regulation of KCNQ1:KCNE3 activity by channel endocytosis and complex dissociation. Methods : Isolated rat colonic crypts as well as the colonic cell line HT29cl19A (HT29) were used to investigate estrogen effects on Cl- secretion and KCNQ1 channel function using a combination of electrophysiological, cellular and molecular biology and imaging techniques. Results : The forskolin-stimulated Cl- secretion and KCNQ1 current in rat colon and HT29 epithelia were rapidly reduced following estrogen treatment (10nM) and remained inhibited over 2 hours after estrogen exposure. Our findings revealed a rapid estrogen-promoted retrieval of KCNQ1 from the plasma membrane via a PKCδ-AMPK-Nedd4 .2 signaling pathway, followed by the recycling of the channel. The mechanism underlying recycling was biphasic; a rapid recycling phase mediated by Rab4 and a slow recycling phase mediated by Rab11. Estrogen also causes dissociation of the KCNQ1:KCNE3 channel complex resulting in collapse of the K+ channel conductance and Cl- secretion. The thesis also demonstrated that KCNQ1 plays a role in E2-modulated colonocyte migration. Conclusion : This study establishes a role for estrogen in the regulation of colonic electrolyte secretion via modulation of KCNQ1 cell membrane surface abundance and KCNQ1:KCNE3 complex formation. Here, we highlighted a new role of KCNQ1 in colonocyte migration which is also modulated by estrogen through KCNQ1. Thus, estrogen plays an important role in colonic crypt homeostasis by regulating colonocyte secretion and migration rate.

Les haptènes sont doués de propriétés pro-inflammatoires et antigéniques responsables de l'activation de l'immunité innée et adaptative à l'origine, respectivement, d'eczémas irritant et allergique de contact. Bien qu'il soit établi que la fréquence à laquelle les individus développent un eczéma allergique corrèle avec les propriétés pro-inflammatoires des haptènes, les paramètres moléculaires reliant l'irritation et l'allergie ne sont pas bien connus. <br />Dans une première partie, nous montrons que le développement et la sévérité de l'eczéma allergique dépend : i) de l'intensité de l'eczéma irritant lors de la sensibilisation, ii) du recrutement de précurseurs de cellules dendritiques dans la peau, iii) du taux de migration des cellules dendritiques vers les ganglions, iv) de l'activation des lymphocytes T et, v) de leur recrutement dans la peau pendant l'élicitation. La deuxième partie de ce travail porte sur l'étude du rôle du Toll-like receptor-2 (TLR-2), un récepteur de l'immunité innée, dans le développement de l'eczéma allergique. Nous montrons que l'absence du TLR-2 chez des souris sensibilisées conduit à une exacerbation de l'eczéma allergique, suggérant que le TLR-2 est impliqué dans la régulation de la réponse inflammatoire cutanée. L'ensemble de nos travaux démontre une relation directe entre inflammation cutanée et développement d'un eczéma allergique et permet de proposer de nouvelles pistes préventives et thérapeutiques des eczémas basées sur l'utilisation de molécules anti-inflammatoires à usage topique.

La toxine pertussique (PTX) est une exotoxine produite uniquement par Bordetella pertussis, un pathogène de la coqueluche. Les effets de la toxine au cours d'une infection bactérienne sont bien connus, et sont pour la plupart liés à son activité ADP-ribosyltransférase qui cible les GPCRs. Or, la PTX est un antigène majeur permettant d’établir une réponse immunitaire contre B. pertussis ce qui en fait donc un composant principal de tous les vaccins anti-coqueluche actuels. De nombreux travaux sur la PTX concernent ses mécanismes moléculaires et son rôle durant la phase d'infection. Mais, il y a un manque d'information sur le rôle immunogène de la PTX.En utilisant un modèle d'infection intranasale par B. pertussis, nous avons constaté que la génération de lymphocytes T CD4 mémoires résidant (Trm) dans les poumons dépendait de l'exposition à la PTX. La toxine pertussique est couramment utilisée pour inhiber la réponse aux chimiokines, dans l'étude de la migration des cellules T. Etant donné que la plupart des récepteurs aux chimiokines sont des GPCRs, la mobilité de nombreuses cellules immunitaires, y compris les cellules T, est facilement affectée par la PTX. La migration des cellules T est un phénomène sophistiqué régulé spatio-temporellement. Nos résultats démontrent que la PTX n’affecte pas les étapes de la migration dépendantes des intégrines lorsque les cellules T sont activées.Ce travail s’intéresse à l'impact de la PTX sur la biologie des cellules T en étudiant son rôle dans la réponse immunitaire adaptative in vivo, dans un modèle animal d'infection et son impact sur la migration des lymphocytes T in vitro. / Pertussis toxin (PTX) is an exotoxin uniquely produced from Bordetella pertussis, a human respiratory tract pathogen causing pertussis disease, also known as whooping cough. The toxin is well described its virulence effects during bacterial infection. Most of these effects are due to ADP-ribosyltransferase activity of the molecule that targets G-protein coupled receptors (GPCR). On the other hand, PTX is an important antigen that provides protection against pertussis disease and a major component of all current pertussis vaccines. There are numerous literatures on PTX about its molecular mechanisms and its role during infection phase. Instead, lack of information on how PTX contributes host’s adaptive immunity has incurred confusion in understanding the immunogenic role of PTX. With intranasal infection model of B. pertussis, we detected the generation of CD4 lung-resident memory T cells (Trm) were depending on PTX exposure. For T cell migration study, PTX is being used to inhibit chemokine response. Because most of chemokine receptors are GPCR, the motility of many immune cells including T cells is easily affected by PTX. T cell migration is a sophisticate phenomenon regulated space-temporally. The results demonstrated, once T cells become activated and effector, are less influenced than inactivated T cells.This thesis reports the impact of PTX on T cells in two parts; 1) Role of PTX in adaptive immune response by in vivo infection system and 2) Influence of PTX on T cell motility by in vitro assays.

Le glioblastome est une tumeur cérébrale maligne particulièrement agressive et le pronostic vital des patients atteints par cette tumeur est très mauvais. La médiane de survie est de l'ordre de 12 mois même lorsqu'une stratégie thérapeutique a pu être mise en place. Un des facteurs qui pourrait expliquer la dificulté à traiter ces tumeurs par voie chirurgicale est l'invasion des cellules tumorales dans le tissu sain environnant. De plus, les mécanismes à l'origine de ce phénomène sont, en partie, méconnus. L'objectif que nous nous étions fixé pour mon travail de thèse était de s'intéresser à ces mécanismes d'invasion en étudiant la migration in vitro de cellules tumorales issues de glioblastomes. Pour cela, nous avons créé un modèle de migration microscopique, basé sur un automate cellulaire, reproduisant la migration de cellules tumorales sur deux substrats différents : substrat de collagène et monocouche d'astrocytes. Les cellules migrent selon des règles prédéfinies et dépendant des interactions (de contact ou à plus longue portée) introduites. La confrontation des simulations avec les expériences a permis de valider le modèle et de mettre en évidence deux phénomènes : une communication par contact entre cellules tumorales et entre cellules tumorales et astrocytes (cette dernière favoriserait l'invasion des cellules tumorales) et la sécrétion à partir de la masse tumorale d'une substance chimio-répulsive favorisant sur la migration des cellules. Afin de décrire l'évolution d'une masse tumorale plus réaliste, nous avons construit et validé un modèle macroscopique (équation de diffusion non linéaire) à partir de l'automate, en tenant compte des interactions entre cellules tumorales.

HARP (Heparin Affin regulatory peptide) est un facteur de croissance qui constitue avec la midkine une sous-famille des Heparin Binding Growth Factors (HBGFs). HARP est impliqué dans de nombreux processus physiologiques comme la neurogenèse et la vasculogenèse mais aussi dans des processus physiopathologiques comme l’angiogenèse et la progression tumorale. HARP interagit avec différents récepteurs (N-syndécan, RPTPβ/ζ, et ALK). Plus récemment, il a été montré au laboratoire que la nucléoline, protéine navette entre le noyau, le cytoplasme, et la surface cellulaire est un nouveau récepteur à HARP. Malgré les avancées dans ce domaine, l’interaction de HARP avec ses récepteurs n’est pas totalement élucidée. L'objectif de ce projet de thèse était la recherche de nouveaux partenaires moléculaires qui interagissent avec HARP, de comprendre le mécanisme de leurs interaction et d’analyser les effets biologiques. A ce titre, j’ai participé à l’étude de l’interaction de HARP avec le facteur de croissance des fibroblastes, le FGF-2. Ce facteur liant l’héparine est également mitogène et angiogène. En utilisant des techniques de biocapteurs optiques et d’interaction protéine-protéine, nous avons montré une interaction directe entre HARP et le FGF-2 et qui implique les domaines C-TSR-I et C-terminale de HARP. De plus, cette interaction inhibe la migration et la prolifération des cellules endothéliales, induites par le FGF-2 ou par HARP seuls. En parallèle, j’ai mis en évidence l’interaction entre HARP et la NRP-1. NRP-1 est une protéine transmembranaire, ayant comme ligands principaux, les sémaphorines de classe 3 (SEMA 3A), le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) et le FGF-2. En plus de son rôle crucial dans le développement des systèmes nerveux et cardiovasculaires, la NRP-1 est impliquée dans les processus physiopathologiques tels que l’angiogenèse et l’invasion tumorale. Ainsi, la NRP-1 présente un profil biologique similaire à HARP. En utilisant des tests d’ELISA, d’immunoprécipitation et de « pull-down », nous avons montré que HARP interagit avec la NRP-1. Cette interaction semble être directe et s’effectue via les domaines de liaison à l’héparine TSR-I. HARP induit l’internalisation de la NRP-1 au bout de 15 minutes et son recyclage partiel à la surface cellulaire au bout d’une heure. L’internalisation de la NRP-1 s’accompagne par la phosphorylation des voies MAPK (ERK1/2), Akt et FAK. L’interaction HARP/NRP-1 est cruciale pour la migration des cellules endothéliales et l’invasion des cellules tumorales. En conclusion, ces résultats apportent de nouvelles avancées concernant les partenaires moléculaires de HARP en particulier et montrent également la complexité des interactions des facteurs de croissance entre eux et avec leurs récepteurs. Plus généralement, cette étude permet d'envisager des stratégies thérapeutiques ciblant l’interaction de la NRP-1 avec HARP et aussi les autres facteurs de croissance. / HARP (Heparin Affin regulatory peptide) is a growth factor that constitutes with midkine a subfamily of Heparin Binding Growth Factors (HBGFs). HARP is involved in many physiological processes such as neurogenesis and vasculogenesis but also in pathophysiological processes such as angiogenesis and tumor progression. HARP interacts with different receptors (N-syndecan, RPTPβ / ζ and ALK). More recently, it has been shown in the laboratory that nucleolin, a protein shuttle between the nucleus, cytoplasm, and cell surface, is a new HARP receptor. Despite the advances in this field, the interaction of HARP with its receptors is not fully understood. The aim of this thesis was the search for new molecular partners that interact with HARP, to understand the mechanism of their interaction and analyze the biological effects. My work was firstly to participate to the study of the interaction of HARP with the fibroblast growth factor-2, FGF-2. This factor is also an heparin-binding factor, with mitogenic and angiogenic activities. Using techniques of optical biosensors and protein-protein interaction, we have shown a direct interaction between HARP and FGF-2 that involves C-TSR-I and C-terminus domains of HARP. In addition, HARP inhibits the migration and proliferation of endothelial cells induced by FGF-2. In parallel, I highlighted the interaction between HARP and NRP-1. NRP-1 is a transmembrane protein having as main ligands, semaphorins class 3 (SEMA 3A), the vascular endothelial growth factor (VEGF) and FGF-2. In addition to its crucial role in the development of the nervous and cardiovascular systems, the NRP-1 is involved in physiopathological processes such as angiogenesis and tumor invasion. Thus, NRP-1 has a biological profile similar to HARP. Using ELISA, immunoprecipitation and "pull-down" tests, we have shown that HARP interacts with NRP-1. This interaction appears to be direct and occurs via heparin binding domains of HARP: TSR-I. HARP induces internalization of NRP-1 after 15 minutes and partial recycling to the cell surface after one hour. The internalization of the NRP-1 is accompanied by the phosphorylation of MAPK pathways (ERK1 / 2), Akt and FAK. HARP/NRP-1 interaction is crucial for endothelial cell migration and invasion of tumor cells. In conclusion, these results provide new advances on molecular partners of HARP in particular and also show the complexity of the interactions between these growth factors and their receptors. More generally, this study allows considering therapeutic strategies targeting the interaction of NRP-1 with HARP as well as other growth factors.

Le complexe Arp2/3 génère des réseaux d’actine branchés, qui produisent une forcée de poussée permettant à la cellule de remodeler ses membranes. Le complexe WASH active le complexe Arp2/3 à la surface des endosomes et facilite ainsi la scission membranaire des intermédiaires de transports contenants des récepteurs internalisés tels que les intégrines α5β1. De ce fait, le complexe WASH en favorisant le recyclage des intégrines, joue un rôle crucial dans l’invasion des cellules tumorales durant la progression tumorale. Cependant, le mécanisme d’assemblage du complexe WASH est inconnu. Dans cette étude, nous rapportons l’identification du premier facteur d’assemblage du complexe WASH. Nous avons identifié la protéine HSBP1 grâce à un crible des protéines qui se lient aux formes précurseurs des sous-unités mais plus au complexe une fois assemblé. La reconstitution biochimique et la modélisation moléculaire nous a permis de montrer que HSBP1 est associé avec le précurseur trimérique CCDC53, le dissocie et forme un hétérotrimère qui va éventuellement libérer une forme monomérique de CCDC53 pour l’assemblage du complexe WASH. Le rôle de HSBP1 dans l’assemblage du complexe WASH est conservé. En effet, WASH est déstabilisé dans des cellules mammaires par le knock-down de HSBP1 et dans l’amibe Dictyostelium par le knock-out de HSBP1. La déstabilisation du complexe WASH par le knock-out de HSBP1 phénocopie la déplétion de WASH dans l’amibe Dictyostelium. Dans des cellules humaines de carcinomes mammaires l’inhibition de l’expression de HSBP1 altère le recyclage des intégrines à la membrane plasmidique. Il en résulte des adhésions focales défectueuses et des capacités invasives réduites. De plus, HSBP1 est localisé aux centrosomes et est requis pour la polarité des cellules lors de la migration. Enfin, nous avons trouvé que la surexpression de HSBP1 dans des tumeurs mammaires est associée à une augmentation des niveaux du complexe WASH et à un mauvais pronostic pour les patientes atteintes de cancer du sein. En conclusion, HSBP1 est un facteur d’assemblage conservé qui contrôle les niveaux du complexe WASH. / The Arp2/3 complex generates branched actin networks, which produces a pushing force that helps the cell to remodel its membranes. The WASH complex activates the Arp2/3 complex at the surface of endosomes and thereby, facilitates the membrane scission of the transport intermediates containing internalized receptors such as α5β1 integrins. Hence, by promoting integrin recycling, the WASH complex plays a crucial role in tumor cell invasion during cancer progression. However, how cells assemble the WASH complex at first is unknown. Here we report the identification of the first assembly factor of the WASH complex. We identified HSBP1 in a proteomics screen for proteins binding to precursor forms of subunits, but not to the fully assembled WASH complex. Through biochemical reconstitution and molecular modeling, we found that HSBP1 associates with the precursor CCDC53 trimer, dissociates it and forms a heterotrimer that will eventually contribute a single CCDC53 molecule to the assembling WASH complex. The role of HSBP1 in WASH complex assembly is well conserved since WASH is similarly destabilized upon HSBP1 knock-down in mammalian cells or upon HSBP1 knock-out in Dictyostelium amoeba. In line with the defective assembly of the WASH complex, the HSBP1 knock-out closely phenocopies WASH knock-out in amoeba. In human mammary carcinoma cells, HSBP1 depletion results in impaired integrin recycling to the plasma membrane leading to the defective development of focal adhesions and reduced invasion abilities. Moreover, HSBP1 was found to localize at the centrosome and was required for the polarization associated with the migration. On the other end, in mammary breast tumors, we found that HSBP1 was often overexpressed and that its overexpression was associated with increased levels of the WASH complex and with poor prognosis for breast cancer patients. Hence, HSBP1 is a conserved assembly factor that controls the levels of the WASH complex.