Thèse de doctorat : Ingénierie Cellulaire et Tissulaire : Nancy 1 : 2008. / Titre provenant de l'écran-titre.

Thèse de doctorat : Neurosciences : Paris 12 : 2005. / Version électronique uniquement consultable au sein de l'Université Paris 12 (Intranet). Titre provenant de la version papier. Bibliogr. : 356 réf.

Reproduction de : Thèse de doctorat : Biologie, médecine, santé, spécialité Physiologie : Poitiers : 2008. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 321 réf.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèses (Ph.D.)--Université de Sherbrooke (Canada), 2001. / Titre de l'écran-titre (visionné le 20 juin 2006). Publié aussi en version papier.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr.: f. 76-82. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Les canaux de jonctions (CJ) composés des connexines (Cxs) assurent la communication intercellulaire directe qui par leur propriétés électriques régulent la propagation du potentiel d’action (PA) cardiaque. Dans les myocytes ventriculaires Cx43 et Cx45 exprimées à des niveaux et ratios physiopathologiques variables assurent cette fonction. Cette étude détermine la contribution de Cx43 et Cx45 dans la formation des CJ et leurs propriétés électriques. La lignée cellulaire épithéliale de foie de rat exprimant la Cx43 endogène et transfectée de manière stable pour exprimer des ratios Cx43:Cx45 précis a été utilisée. Les propriétés électriques des CJ ont été obtenues par double voltage clamp sur paires de cellules. L’expression de la Cx45 diminue le couplage électrique et augmente la dépendance au potentiel de jonction indépendamment du ratio. Les cinétiques de désactivation sont ralenties avec l’augmentation du niveau d’expression de Cx45 et les cinétiques de restitution sont modifiées en fonction du ratio. Les conductances unitaires suggèrent la formation de CJ composés de Cx43 et Cx45. La diminution du niveau d’expression de Cx43 par ARNi anti-Cx43 entraine une diminution du couplage électrique tandis que les autres propriétés électriques restent inchangées. Ces résultats montrent une contribution spécifique de Cx43 et Cx45 dans la régulation de la formation et des propriétés électriques des CJ caractérisées. Ces propriétés seront corrélées à la participation des CJ dans la régulation de la propagation du PA en fonction des profils d’expression des Cxs en conditions physiologiques et pathologiques. / Gap junction channels (GJCs), composed of connexins (Cxs) allow a direct intercellular communication that ensures the cardiac action potential (AP) propagation. Cx43 and Cx45 co-expressed in ventricular myocytes with changing expression levels and ratios in the healthy and the diseased heart ensure this function. The purpose of this study is to determine the contribution of Cx43 and Cx45 on the formation of GJCs and their electrical properties. Rat Liver Epithelial cells that endogenously express Cx43 and stably transfected to co-express accurate Cx43:Cx45 ratios have been used. The electrical properties of GJCs at each ratios were obtained by performing dual voltage clamp recordings on cell pairs. Expression of Cx45 decreases the electrical coupling and increases the voltage dependence independently of the ratio. The kinetics of deactivation are slowed with the increases of Cx45 level of expression and the kinetics of recovery are modified in a Cx43:Cx45 ratio dependent manner. Unitary conductances suggest a formation of GJCs composed by Cx43 and Cx45. The decreases of Cx43 level of by a SiRNA treatment induces a decrease of the electrical coupling, while other electrical properties are not affected. Our data show a specific contribution of Cx43 and Cx45 in regulation of the GJCs characterized by specific electrical properties. Such properties will be correlated to the function of GJCs in regulating the AP propagation in the specific patterns of expression of Cxs in the healthy and diseased heart.

Les jonctions communicantes (JCs) sont particulièrement importantes au sein du follicule ovarien puisque qu’elles vont participer à la régulation de la maturation ovocytaire. Les JCs vont contrôler le flux de molécules tels que l’AMPc et le GMPc qui passent entre les cellules du cumulus et l’ovocyte et qui inhibent la reprise de la méiose. La fermeture de ces canaux, tant in vivo qu’in vitro, va entrainer la reprise de la méiose en empêchant le passage de ces molécules. Dans les études que nous avons réalisées, nous avons tout d’abord développé une méthode d’analyse fonctionnelle des jonctions communicantes (le FRAP : Fluorescence Recovery After Photobleaching) dans la structure tridimensionnelle du complexe ovocyte-cumulus. Cette technique nous a permis de déterminer que les gonadotrophines et le liquide folliculaire présent dans le milieu de maturation pouvaient moduler la dynamique de transfert entre les cellules du cumulus pendant les premières heures de maturation in vitro (MIV). Par la suite, nous avons étudié la régulation des connexines (Cx), qui sont les protéines composant la JC. Nous avons identifié les principales connexines présentes dans le COC porcin, la Cx43, la Cx45 et la Cx60. Nous avons déterminé que les gonadotrophines régulaient l’expression, la dégradation ainsi que la localisation de la connexine 43 (la principale connexine présente dans les cellules du cumulus porcin). Enfin, nous nous sommes intéressés à la régulation de la reprise de la méiose par le peptide natriurétique de type C (CNP). En effet, le CNP a été proposé pour inhiber la reprise de la méiose en se liant à son récepteur NPR-B sur les cellules du cumulus, ce qui stimule la production de GMPc. Il est ensuite transféré dans l’ovocyte, via les JCs, où il va inhiber la reprise de la méiose. Nous avons montré que le CNP et un analogue du GMPc avaient un impact différent sur la dynamique de transfert entre les cellules du cumulus. De plus, le CNP agirait sur un autre récepteur (le récepteur NPR-C) pour promouvoir l’arrêt méiotique. En conclusion, ces résultats ajoutent un niveau de compréhension supplémentaire des mécanismes régulant les JCs et la reprise de la méiose durant la MIV chez le porc. / Intercellular gap-junctional communication (GJC) plays an important role in ovarian cell physiology. Closure of GJC has been proposed to be involved in oocyte maturation, particularly in the resumption of meiosis, both in vivo and in vitro, by controlling the flow of meiosis inhibitors, such as cAMP and cGMP. In the present study, we have first developed an assay based on recovery of calcein fluorescence in photobleached cumulus cells (FRAP: Fluorescent Recovery After Photobleaching) in the three-dimensional cumulus-oocyte complex (COC), during the first hours of porcine in vitro maturation (IVM). Results obtained using FRAP technology provide evidence that the composition of the IVM medium in terms of hormones and follicular fluid clearly affects cumulus-cumulus cell GJC. We then turned our attention to the effect of gonadotropins on connexins regulation. Indeed, GJC are composed of connexins proteins. We indentified Cx43, Cx45 and Cx60 as the main connexins expressed in swine COC. We show that gonadotropins regulate Cx43 protein level, degradation and localisation in the COC during the first hours of IVM. We finally turned our attention on the effect of natriuretic peptide C (CNP) on GJC regulation and meiotic resumption during porcine IVM. Indeed, CNP has been proposed to bind to receptor natriuretic peptide receptor B (NPR-B) where it triggers the production of cyclic guanosine monophosphate (cGMP). The cGMP produced is then transferred to the oocyte through gap junctions where it promotes meiotic arrest. Here we show that CNP and a cGMP analogue have different effects on GJC and Cx43 regulation suggesting that cGMP signaling may not be the only signaling pathway involving CNP. Moreover, we found that CNP is likely to bind to receptor natriuretic peptide receptor C (NPR-C) to play a role in maintaining meiotic arrest during porcine IVM, when activated in addition to NPR-B. In conclusion, we describe new mechanisms involved in the complex regulation of dynamic changes in GJCs and meiotic resumption. A better understanding of GJC regulation during IVM may in turn provide a powerful tool to improve assisted reproduction technologies and their efficacy in mammals.

Une propriété des astrocytes réside dans leur organisation en réseaux grâce à la présence de jonctions communicantes (CJ) composées par les connexines (Cxs) 43 et 30. A partir de l’observation indiquant que les ARN messagers codant pour la Cx30, mais pas ceux pour la Cx43, sont augmentés suite à une privation de sommeil (PDS), l’objectif de ma thèse a été de déterminer si et comment la Cx30 est impliquée dans la régulation du cycle veille-sommeil. D'abord, mon travail a consisté à analyser les effets de molécules qui perturbent veille-sommeil sur CJ astrocytaire étudiée dans des tranches aigues de cortex de souris. J’ai observé que le modafinil, un psychostimulant, augmentent la CJ. Par contre le GHB (acide γ-Hydroxybutyric), un agent qui induit le sommeil, et deux anesthésiques généraux, le propofol et la kétamine, ont des effets opposés. Ces résultats suggèrent que les réseaux astrocytaires sont régulés de manière différentielle par des drogues qui perturbent veille-sommeil. Et ensuite, ma thèse a consisté à étudier le rôle de la Cx30 en utilisant des souris dont le gène codant pour cette Cx a été invalidé (Cx30 KO). Les Cx30 KOs présentent un déficit dans le maintien de l’éveil lors d’épisodes de forte pression de sommeil: Cx30 KO présentent une augmentation du sommeil à ondes lentes pendant une PDS et elles requièrent un plus grand nombre de stimuli pour rester éveillée lors d’une PDS «douce». Afin d’identifier les causes de ce déficit nous avons observé que: 1) le CJ est augmenté après une PDS et cette augmentation ne s’observe que lorsque la Cx30 est présente 2) le niveau d’expression des ARN messagers de 7 gènes impliqués dans le métabolisme énergétique cérébral est diminué dans plusieurs régions du cerveau chez Cx30 KO. En résumé, ces résultats suggèrent que la Cx30 joue un rôle important dans la régulation du veille-sommeil, probablement en contribuant à la fonction métabolique des astrocytes, ceci afin de répondre à une demande énergétique accrue lors de situations de forte pression de sommeil. / Astrocytes are organized in networks via gap junction channels constituted by connexin (Cx) 30 and Cx43. Since we observed that the mRNA expression of Cx30, but not Cx43, was enhanced after sleep deprivations (SD) in the mouse cortex and hippocampus, the goal of my thesis was to investigate whether and how Cx30 is involved in sleep homeostasis. First, I investigated the effects of sleep/wake-affecting molecules on gap junctional communication (GJC) of astrocytes in acute slices of the mouse cortex. We found that modafinil, a wakefulness-promoting drug, enhanced astroglial GJC, whereas γ-Hydroxybutyric acid (GHB), a sleep-promoting agent, and two general anesthetics, propofol and ketamine, decreased GJC, suggesting that astroglial networks are bidirectionally regulated by sleep/wake-affecting drugs. Then I addressed the role of Cx30 using Cx30 knockout (KO) mice. Compared to wild type (WT) mice, Cx30 KO exhibited a deficit in maintaining wakefulness during periods of high sleep pressure: they needed more stimuli to be maintained awake during gentle SD and they exhibited an increase in slow wave sleep during instrumental SD. To probe the possible causes of the phenotype, we found that: 1) astroglial GJC was enhanced in WT mice after SD, and such enhancement depended on both neuronal activity and the presence of Cx30; 2) mRNA levels of several genes involved in brain energy metabolism were decreased in multiple brain structures of the Cx30 KO. In summary, these results suggest that astroglial Cx30 plays an important role in sleep homeostasis, possibly by enhancing astroglial metabolic functions to fulfil the high energy demand during periods of elevated sleep pressure.

L'ischémie cardiaque est une condition bien connue pour induire un déséquilibre ionique général dont une augmentation de la concentration du calcium intracellulaire, et une déplétion de la concentration d'ATP intracellulaire. Dans ce travail, nous avons donc étudié son effet sur l'ouverture des hémicanaux, structures à l'origine de la formation des jonctions gap, mais dans l'état où ils ne sont pas appariés pour former un canal intercellulaire. Pour ce faire, nous avons transfecté l'ADNc de la Cx43 dans des cellules CHO que nous avons soumises à une simulation d'ischémie et des bloqueurs d'hémicanaux ont été utilisés pour confirmer leur ouverture spécifique. Les résultats ont montré une augmentation de la concentration du calcium intracellulaire non spécifique à la présence d'hémicanaux. Par ailleurs, la conductance membranaire a été significativement augmentée par l'expression d'hémicanaux et réduite suite à l'application d'un inhibiteur. Ces résultats suggèrent l'implication des hémicanaux dans les dommages conséquents à l'ischémie cardiaque.