Tesis de Magíster en Bioquímica área de Especialización en Bioquímica de proteínas y biotecnología y Memoria para optar al Título de Bioquímico / Las lacasas son enzimas de la familia de las multi-cobre oxidasas que han suscitado mucho interés debido a su amplia especificidad de sustrato, la variabilidad de sus propiedades entre cada especie, y su todavía elusivo mecanismo de reacción. La presencia de cuatro centros de cobre en su sitio activo la convierte en un modelo interesante para el estudio de la relación entre la estructura y la función de proteínas. Estos átomos de cobre son además responsables de las propiedades catalíticas de las lacasas y exhiben propiedades redox y espectroscópicas que son propias de estas enzimas. Es posible encontrarlas en hongos, plantas y en procariontes. Las lacasas bacterianas poseen muchas ventajas desde el punto de vista aplicado por sobre las lacasas de hongos, que hasta hoy se encuentran mejor caracterizadas. En general poseen una mayor termoestabilidad, y exhiben un perfil de pH distinto, lo que permite ampliar el número de aplicaciones de estas enzimas. Sus propiedades las hacen buenas candidatas para diversas aplicaciones biotecnológicas, que van desde la industria textil hasta la industria de alimentos, e incluyen su aplicación como biosensores, su uso en bioremediación de suelos y aguas entre otros. En este trabajo se caracteriza una lacasa recientemente detectada en el microorganismo termófilo antártico Geobacillus sp. ID17. Esta es la primera lacasa caracterizada de una bacteria antártica, y la primera lacasa intracelular descrita de este género bacteriano. La purificación de la enzima se logró utilizando cromatografía de intercambio aniónico y exclusión molecular. Luego de obtener una muestra pura se determinaron sus propiedades bioquímicas y su rango de sustratos. La lacasa purificada demostró poseer una alta estabilidad térmica a pH neutro y 55 ºC. Se detectó la mayor actividad enzimática en el rango entre 55 y 60 ºC, a pH 7,5. Además la enzima posee una mayor selectividad de sustrato que otras lacasas descritas a la fecha. Adicionalmente, se describe la purificación parcial de una segunda enzima presente en el extracto crudo del Geobacillus sp. ID17, que demostró poseer una actividad peroxidasa dependiente de cobre / Laccases are enzymes from the Multi-Copper Oxidase family that have gathered high attention due to their wide range of substrates, their interspecies variability and their still elusive mechanism of action. The presence of four copper atoms in their active site makes them an interesting model for the study of the relationship between the structure and function of proteins. These copper atoms are responsible for the catalytic properties of laccases and exhibit redox and spectroscopic features unique to this class of enzymes. It is possible to find them in fungi, plants, and prokaryotes. Bacterial laccases display many advantages over fungal laccases for their application. They have, in general, a higher thermal stability and a different pH profile, which contributes to widen the possible application of laccases. In this thesis a new laccase from an Antarctic microorganism, Geobacillus sp. ID17, is purified and characterized. This is the first Antarctic bacterial laccase to be functionally described, and the first intracellular laccase from this bacterial genus. The pH profile, catalytic constants, and thermal behavior of the enzyme is described. A screening of different laccase substrates reveals that this new laccase has different substrate specificity than the commercial laccase from Trametes versicolor. The enzyme was purified using anionic exchange and size-exclusion chromatography. After obtaining a pure enzyme, its biochemical parameters and substrate specificity were determined. The purified laccase showed high thermal stability at neutral pH and 55 ºC. The highest activity was detected between 55 ºC and 60 ºC, at pH 7,5. Additionally, this enzyme shows higher substrate selectivity than other previously described laccases. Additionally, the partial purification of a second enzyme present in the crude extract of Geobacillus sp. ID17, which seems to display a copper dependent peroxidase activity, is described

Aliasing is a potential source of problems in software development and can, for example,lead to data races in concurrent programs. More recent programming languages includealiasing control in order to catch more errors at compile time. However, this does notexist for most widely-used languages.LaCasa introduces aliasing control to Scala. LaCasa is a type system and program-ming model that provides lightweight unique and affine (consumable) object referencesin Scala. The unique references provided by LaCasa enable messages to be passed effi-ciently by reference. They also guarantee a deep-copy semantic which makes it possible tomore easily port a concurrent program from running on a single machine to being dis-tributed and running on a large cluster of machines.One aspect that makes LaCasa inconvenient to use is the fact that code needs to bewritten in an explicit continuation-passing style (CPS), different to how code is usuallywritten, which makes programs harder to write, understand and maintain.This project presents a flow-sensitive version of LaCasa which avoids the use of con-tinuations. Flow-sensitivity is achieved by adding an extra compiler phase that performsa static analysis, enforcing LaCasa’s type-checking rules. The flow-sensitive version wasevaluated by measuring the code complexity compared to the original flow-insensitiveLaCasa. A few case studies were performed, as part of the evaluation, to show how flow-sensitive LaCasa can be used to extend LaCasa into other fields of application.The evaluation showed that a flow-sensitive LaCasa can reduce the complexity of ap-plications using LaCasa. It allows programmers to write code in a more usual way whichmakes LaCasa easier to use. / Aliasing är en potentiell källa till problem inom mjukvaruutveckling och can till exempelleda till data races i samtidiga program. Nyare programmeringsspråk inkluderar aliasing-kontroller för att kunna fånga fel vid kompilering. Sådana kontroller existerar inte för deflesta utbredda språken.LaCasa introducerar aliasing-kontroll till Scala. LaCasa är ett typsystem och program-meringsmodell som tillhandahåller unika och affina (förbrukningsbara) objektreferenser iScala. De unika references som tillhandahålls av LaCasa gör det möjligt att effektivt skic-ka meddelanden via referenser. De garanterar också en djup-kopierings-semantik som gördet möjligt att mer enkelt konvertera ett samtidigt program från att köras på en endamaskin till att distribueras och köras på ett stort maskinkluster.En aspekt som gör LaCasa obekvämt att använda är att kod måste skrivas i en ex-plicit continuation-passing-stil (CPS), olik det vanliga sättet att skriva kod, som gör pro-gram svårare att skriva, förstå och underhålla.Det här projektet presenterar en flödeskänslig version av LaCasa som unviker an-vändningen av continuations. Flödeskänslighet uppnås genom att lägga till en extra kom-pileringsfas som utför en statisk analys som upprätthåller LaCasas typ-regler. Den flö-deskänsliga versionen utvärderades genom att mäta kodkomplexitet jämfört med denursprungliga flödesokänsliga LaCasa. Några fallstudier utfördes, som en del av utvär-deringen, för att visa hur flödekänsliga LaCasa kan användas för att utöka LaCasa tillandra användningsområden.Utvärdering visade att ett flödeskänsligt LaCasa kan reducera komplexiteten hos ap-plikationer som använder LaCasa. Det tillåter programmerare att skriva kod på ett mervanligt sätt som gör LaCasa enklare att använda.

La presente tesis parte del interés de blanquear pasta de lino (Linum usitatissimum) mediante procesos más respetuosos con el medio ambiente, a partir de secuencias totalmente libre de cloro (TCF) y de la utilización de fibras no madereras para la fabricación de papeles especiales de alta calidad.Asimismo, se ha estudiado la aplicación de enzimas en el blanqueo de pasta de eucalipto (Eucalyptus saligna y Eucalyptus grandis) en la fábrica de Jacareí de Votorantim Celulose e Papel (Brasil) para conseguir una mejora de las propiedades de las pastas y un ahorro de reactivos en la secuencia de blanqueo industrial.Los estudios realizados permiten obtener dos tipos de secuencias para el blanqueo de pasta de lino TCF, ambas con reactivos químicos utilizados individualmente (secuencias químicas) o combinados con tratamientos biotecnológicos (secuencias bioquímicas). Las secuencias químicas incluyen una etapa de ozono y las secuencias bioquímicas incluyen un tratamiento enzimático. Las secuencias bioquímicas constan de etapas que son fácilmente aplicables en la industria, donde la primera de ellas es un sistema lacasa mediador con lacasa comercial de Trametes versicolor y el mediador HBT.En cuanto a los tratamientos biológicos, en primer lugar, se ha estudiado la influencia de la adición de oxígeno y del tiempo de tratamiento en el sistema enzimático y se ha comprobado como influyen ambas variables en las propiedades de la pasta de lino. También se ha estudiado la formación de compuestos cromóforos en la pasta a partir de la determinación de las propiedades ópticas. Posteriormente, se ha realizado un estudio estadístico de las variables de proceso del sistema lacasa mediador y su influencia en las propiedades de las pastas y los efluentes después de cada etapa de blanqueo. La optimización de las variables de tratamiento en el bioblanqueo de lino permite determinar las condiciones de aplicación más adecuadas para conseguir unas determinadas propiedades de la pasta a un menor coste y que resulten fácilmente adaptables a los procesos existentes. Gracias a este estudio, se consigue reducir las dosis de reactivos y el tiempo de tratamiento. El estudio sistemático de cada una de las etapas de blanqueo permite determinar cuál es el efecto sobre la pasta de cada reactivo en cada una de las etapas de las secuencias bioquímicas. Por otro lado, también se ha comprobado como el sistema lacasa mediador es capaz de oxidar ciertos extractivos lipofílicos presentes en la pasta de lino.La optimización de las dosis y el tiempo de tratamiento en el bioblanqueo también se deben tener en cuenta por su influencia en las propiedades de los efluentes, debido a la potencial toxicidad del mediador, como también, a la posible pérdida de actividad enzimática durante el tratamiento. Como novedad, cabe decir, que los valores máximos de toxicidad medidos se encuentran por debajo de los límites que fija la legislación en Cataluña. En este estudio se determina que la pérdida de actividad enzimática en el tratamiento depende básicamente de la dosis de HBT utilizada, por lo que la aplicación de dosis de reactivos superiores a las óptimas, no sólo encarece el proceso de blanqueo, sino que además, una sobredosificación puede dificultar la posible reutilización de estos efluentes de blanqueo.En una segunda parte de la tesis, se estudia la influencia del tratamiento con diversas xilanasas comerciales en las propiedades de la pasta de eucalipto, en las condiciones de blanqueo industriales, a pH y temperatura elevados, en la fábrica de Jacareí de Votorantim Celulose e Papel (Brasil).La aplicación de xilanasas permite una mayor flexibilidad de la secuencia de blanqueo. También, permite ahorrar reactivos químicos, así como incrementar la productividad de aquellas plantas en las que la capacidad de producción de dióxido de cloro es un factor limitante. La aplicación de las xilanasas en la torre de almacenamiento de pasta de la línea de fibras B de la unidad de Jacareí permitiría la mejora de las propiedades de índice kappa y blancura de la pasta en la secuencia de blanqueo industrial. Para ello, no es necesario modificar el proceso existente, lo que es favorable desde el punto de vista industrial, ya que no se requiere una inversión en nuevos equipos. La efectividad del tratamiento enzimático disminuye considerablemente al aumentar la cantidad de licor negro y cuando el pH se encuentra por encima de 10. Por lo que, en el supuesto de que se aplicara un tratamiento enzimático en la torre de almacenamiento, se haría necesario un control, tanto de la cantidad de licor negro presente en la pasta, como del pH antes del punto de aplicación de enzima. / The aim of this thesis is to bleach flax pulp (Linum usitatissimum) by more friendly environmental processes, using totally chlorine free sequences (TCF) and non-wood fibers for the manufacture of high quality specialty papers. This work is framed by one of the research topics in the Textile and Paper Engineering Department of the Technical University of Catalonia. Part of this research topic is based on bleaching fibers, focused basically on the study of new bleaching agents and biotechnology application. Likewise, enzyme application has been studied in eucalyptus pulp bleaching (Eucalyptus saligna and Eucalyptus grandis) in Jacareí Mill of Votorantim Celulose e Papel (Brazil) in order to obtain an improvement of the pulp properties and reagent savings in the industrial bleaching sequence. Performed studies allow to obtain two kinds of TCF sequences for flax pulp bleaching, both with chemical reagents used individually (chemical sequences) or combined with biotechnological treatments (biochemical sequences). Before beginning the bleaching sequences studies, the ozonation pilot plant has been modified. This plant was designed by the research group CIPAGRAF. A new design has been carried out improving the distribution of the equipments, pipelines and valves, basically to minimize delay times in ozone measurements. Chemical sequences include an ozone stage and biochemical sequences include an enzymatic treatment. The biochemical sequences include stages that are easily applicable in the industry. The first one is a laccase-mediator system with a commercial laccase from Trametes versicolor and mediator HBT.Regarding biological treatments, firstly, the influence of oxygen addition and treatment time has been studied in the enzymatic system. Both variables have been proven to have influence on flax pulp properties. The formation of chromophores compounds in pulp has been also studied from the determination of optical properties. Later, it has been carried out a statistical study of the process variables in laccase-mediator system and their influence in pulp and effluent properties after each bleahing stage. References have not been almost found on pulp properties modeling as a function of the variables in an enzymatic process in this enclosed operation conditions regarding a future industrial application. Process variables optimization in flax pulp biobleaching allows to establish the application conditions most appropriated to obtain certain pulp properties to a lower cost and that turn out to be easily adaptable to existing processes. The results show that a reduction of reagent doses and treatment time can be obtained, and the study allows establishing those conditions which the system is not effective. The systematic study of each one of the bleaching stages allows determining the effect on the pulp of each reagent in each of the stages of the biochemical sequences. On the other hand, it has been proved that laccase-mediator system is capable of oxidize certain lipophilic compounds on flax pulp.Besides, it must be also considered the influence of the process variables in effluent properties, due to the potential toxicity of mediator and possible enzymatic activity loss during the treatment. It is necessary to emphasize that studies on effluent characterization depending on process variables in laccase mediator system have not been found. As a novelty, maximum values of toxicity measured are below the legal limit that determines legislation in Catalonia. It has been also observed, that effluent toxicity in L stage is not only due to the presence of mediator HBT, but by-products of degradation show a major toxicity than the HBT in its initial form. In this study, enzymatic activity loss depends basically on the HBT dose. Therefore, a reagent dose application higher to the optimal doses, not only increases bleaching cost, but in addition, an overdosage can avoid the possible reutilization of bleaching effluents.In the second part of the thesis, the study is based on the influence of an enzymatic treatment with commercial xylanases on eucalyptus pulp properties at the industrial bleaching conditions, high pH and temperature, in Jacareí Mill of Votorantim Celulosa e Papel (Brazil). Xylanase application allows a major flexibility of the bleaching sequence. Moreover, it allows chemical reagents saving, as well an increase of productivity in those mills in which the production capacity of chlorine dioxide is a limiting factor, as it is the case of Jacareí's Mill. Xylanase application in storage tower would allow pulp properties improvement, like kappa number and brightness, in the industrial bleaching sequence. For this, it is not necessary to modify the existing process, which is an advantage from an industrial point of view, since an investment in new equipments is not needed. Enzymatic treatment efficiency decreases considerably when black liquor amount is increased and when the pH is over 10. For this reason, if an enzymatic treatment was applied in the storage tower, a control would become necessary for black liquor amount in pulp and for pH before the enzyme application point.

The aim of this thesis is to modify flax pulp fibres (Linum usitatissimum) by more friendly environmental processes. Pulp and paper research is focussing through enzyme systems investigation for developing green chemistry technologies due to existing environmental concerns and to legal restrictions. Moreover, it exists also an increasing strategic interest in using flax fibres to obtain high-quality specialty papers. That is why we study the application of biotechnology as an efficient alternative to traditional industrial processes based on the use of chemical agents. This work is framed by two of the main research topics of the Paper and Graphic Specialty Laboratory in the Textile and Paper Engineering Department of the Universitat Politècnica de Catalunya. One research line is based on pulp bleaching and is focused basically on the study of enzymatic systems as biobleaching agents; the other research topic that has been recently introduced in our investigation group is the use of enzymes as functionalisation agents by promoting the grafting of several compounds. Laccase is the main enzyme used in this thesis; it is an oxidoreductase that can assist reactions in an eco-friendly way since laccase uses air and produces water as the only by-product. Moreover, laccase can work under mill conditions and has wide application potential. The first part of this thesis involved the use of enzymes to bleach flax pulp. The aim was to explore the potential of various natural mediators (lignin-derived compounds) for delignifying flax fibres in order to identify the most efficient and ecofriendly choice among them. Afterwards, we assessed the use of various enzyme delignification stages in an industrial bleaching sequence. The ensuing totally chlorine free (TCF) sequence comprised various laccase-mediator system treatments (L stage) followed by a by a chelating stage (Q stage) and a subsequent bleaching step with hydrogen peroxide (Po stage). A xylanase pretreatment was additionally carried out. Laccases used came from the fungi Pycnoporus cinnabarinus and Myceliophthora thermophila; the performance of several natural mediators was compared with the obtained with the application of various synthetic mediators. In addition, the lack of studies on the properties of effluents from the treatment of non-wood pulp with laccase and natural mediators led A-1 A-2 us to examine effluent properties upon biotreatments and after different bleaching stages. The results obtained warrant upscaling any of the biobleaching sequences for flax pulp as they provide sustainable flax fibre with a high cellulose content and brightness above 80% ISO. The use of xylanase pretreatment was found to efficiently remove HexA and enhance delignification by laccase.

La tesi que ens ocupa, parteix de I'interes de blanquejar pasta kraft d'eucaliptus a traves de tecnologies netes, es a dir, utilitzant metodes mes respectuosos pel medi ambient. La motivacio per a la realitzacio d'aquesta tesi, sorgeix de la problematica ambiental ja coneguda que existeix amb relacio a la contaminacio produida pels reactius utilitzats en el blanqueig de pastes per a paper i de I'interes estrategic que representa per Espanya la utilitzacio de la fusta d'eucaliptus. D'aquesta manera, es volen estudiar nous sistemes enzimatics que puguin deslignificar i blanquejar aquesta pasta.La present tesi s'emmarca dins d'una de les linees d'investigacio del Departament d'Enginyeria Textil i Paperera, de la Universitat Politecnica de Catalunya, encaminada a ('Aplicacio de la Biotecnologia per al Blanqueig de Pastes.Aixi, s'enfoca la recerca cap a la utilitzacio de xilanases per a potenciar el blanqueig en sequencies ECF i TCF, i cap a la utilitzacio de lacases a traves del sistema lacasa-mediador per a blanquejar i deslignifcar la pasta. Degut al gran contingut en acids hexenuronics de les pastes kraft d'eucaliptus, i a la creixent importancia d'aquests en els processos de blanqueig, especial interes es dona en la seva evolucio al Ilarg dels diferents tractaments.Primerament es realitza un escrutini d'actuacio de diferents xilanases tant noves com comercials per tal d'identificar les mes eficients en potenciar el blanqueig. Aquests assajos es realitzen sobre sequencies XD, XP i XDP. Segons les propietats de la pasta d'index kappa, blancor, viscositat i HexA i segons I'analisi per cromatografia en capa fina dels efluents de I'etapa X, s'obte que la xilanasa comercial Xc i que la xilanasa nova XG son les mes eficients en potenciar el blanqueig. La xilanasa nova mes eficient pertany a la familia 11 de les glicosil hidrolases. D'altra banda, s'observa que la xilanasa XJ (familia 5) produeix Ileugers efectes sobre les pastes i que totes les xilanases noves (families 10, 11 i 5) contribueixen a la disminucio del contingut en HexA de les pastes.Seguidament, la millor xilanasa comercial (Xc) i nova (XG) s'apliquen en una sequencia complerta de blanqueig XDEopD1. Degut a I'interes cientific que representa aplicar per primera vegada una xilanasa de la familia 5 sobre les pastes, tambe s'aplica la xilanasa Xj en aquesta sequencia complerta. La xilanasa Xj s'aplica sola i combinada amb la xilanasa XG. Els resultats demostren que amb un pretractament amb xilanasa es milloren les propietats de les pastes al Ilarg de la sequencia i que el pretractament X podria permetre un estalvi en dioxid de clor. A mes, les xilanases no afecten a les propietats fisiques finals dels papers.En segon Iloc, s'aplica el sistema lacasa-mediador (L) sobre les pastes utilitzant HBT com a mediador. L'objectiu d'aquest tractament es d'una banda optimitzar les condicions d'aplicacio del sistema lacasamediador segons les propietats d'index kappa i blancor i d'altra banda veure si el pretractament amb xilanasa es capag de potenciar I'efecte del tractament L. Tambe es vol analitzar com el tractament L afecta als HexA, a la lignina i a la viscositat. Els resultats demostren que a dosis baixes de mediador i a temps curts s'obtenen bones propietats. El tractament L disminueix sobretot la lignina de la pasta tot i que tambe fa disminuir els HexA, i Ileugerament la viscositat. Els esterols de la pasta son tambe eliminats durant aquest tractament. A mes, es demostra que el pretractament X "facilita" I'efecte del sistema lacasa-mediador en eliminar els acids hexenuronics de la pasta. Per I ltim, queda reforgada la necessitat d'aplicar una etapa d'extraccio alcalina posterior a L.Posteriorment, es compara I'efectivitat del mediador NHA respecte I'HBT obtenint resultats molt prometedors amb aquest mediador ja que a part de ser mes barat i potencialment menys toxic que I'HBT, presenta una reaccio de tipus reversible i es tant eficient com aquest I ltim en deslignificar la pasta. Paral·lelament es realitza una recerca de mediadors naturals produits durant el creixement de P.cinnabarinussobre la fusta de pi. Per I ltim, s'aplica per primera vegada la tirosinasa en el blanqueig de pastes i els resultats indiquen que cal continuar la recerca sobre aquesta possible aplicacio biotecnolOgica d'aquest enzim. Aquest bloc d'experiencies s'ha realitzat a l'"Institut National de la Recherche Agronomique" (INRA) de Marsella, Franca.Finalment, es discuteix sobre la importancia dais acids hexenuronics al Ilarg dais processos de blanqueig, i sobre com aquests son eliminats pals diferents tractaments tant quimics corn enzimatics. Es troba la relacio antra aquests acids i I'index kappa de la pasta d'eucaliptus utilitzada.

Los neurotransmisores, las quinonas y las enzimas redox desempeñan un papel muy importante en muchos procesos biológicos. Todos ellos tienen en común su importante papel en diferentes reacciones redox biológicas. Los neurotransmisores participan en los procesos de transmisión de impulsos nerviosos de organismos multicelulares; las enzimas redox actúan como catalizadores de un gran número de procesos biológicos basados en reacciones de transferencia de electrones que permiten obtener la energía necesaria para el sustento de la vida, tales como la reducción de oxígeno (O2) a agua (H2O) durante la respiración, la oxidación de azúcares a CO2 u otras vías metabólicas como la glicólisis o la fosforilación oxidativa. Esta tesis se centra en la caracterización de neurotransmisores (dopamina), quinonas (4-etilcatecol, 4-metilcatecol y catecol) y enzimas redox (CueO, lacasa perteneciente al grupo de las multicobre oxidasas) desde un punto de vista fundamental utilizando la electroquímica como herramienta de trabajo. Para ello, se han empleado como principales técnicas experimentales la voltametría cíclica (CV), el desplazamiento de carga con CO, las espectroscopías infrarroja (FTIR y ATR), Ultravioleta-Visible (UV-vis) y Raman, así como la microscopía de efecto túnel (STM). En el primer capítulo el trabajo de la tesis se contextualiza dentro del campo de la bioelectrocatálisis y de las biopilas de combustible. Además, se describen también los diferentes procedimientos utilizados para la funcionalización de electrodos y la inmovilización de enzimas. De la misma forma, también se resumen las propiedades de las catecolaminas y multicobre oxidasas, así como sus estructuras típicas, reacciones, mecanismos de transferencia de electrones y métodos de síntesis. Los contenidos principales de la tesis están estructurados en dos partes diferentes. La primera parte describe la reactividad de las catecolaminas sobre electrodos de oro, platino y carbón tipo diamante, prestando especial atención a los procesos de adsorción y oxidación registrados a bajos y altos potenciales, respectivamente. La segunda parte describe las condiciones óptimas para la catálisis de la reacción de reducción de O2 por parte de la CueO y su comportamiento electroquímico y espectroscópico. El efecto de compuestos comúnmente descritos en la literatura como inhibidores también está recogido en los capítulos 6 y 8.