Le peptidoglycane (PG) est le composant majeur de la paroi des bactéries à Gram positif. Il assure la forme et l’intégrité de la cellule bactérienne. Le PG ou des fragments dérivés sont connus pour être des inducteurs du système d’immunité innée de l’hôte, en particulier au travers des récepteurs Nod2. Au cours de ce travail, nous avons étudié l’influence du métabolisme du PG sur les propriétés immunomodulatrices de Lactobacillus casei BL23, en étudiant principalement sa capacité à moduler la réponse des cellules dendritiques humaines. Nous avons tout d’abord caractérisé les hydrolases du PG (PGHs) majeures de L. casei BL23. Une recherche in silico a révélé que L. casei possède un système de PGHs relativement complexe comprenant treize enzymes putatives avec des domaines catalytiques variés. Une analyse protéomique d’extraits de paroi de L. casei BL23 a permis de détecter la production de sept d’entre elles pendant la croissance bactérienne. Quatre d’entre elles ont été étudié plus en détails. La PGH la plus fortement exprimée, Lc-p75, a une activité de -D-glutamyl-L-lysyl-endopeptidase et est responsable de la séparation des cellules après division. De plus, Lc-p75 associée à la paroi est localisée au niveau des septa cellulaires. Il s’agit également de l’une des protéines majeures secrétée dans le surnageant de culture de L. casei BL23. Lc-p75 possède la particularité d’être une glycoprotéine. La PGH Lc-p40 possède un domaine CHAP doué d’une activité endopeptidase avec un site de clivage situé au niveau des ponts interpeptidiques du PG. Lc-p40 parait localisée au niveau de la paroi latérale des cellules de L. casei. Lc-p45 est une deuxième -D-glutamyl-L-lysyl-endopeptidase avec un rôle dans le maintien de la forme de la bactérie. Enfin nous avons caractérisé deux enzymes de prophages, Lc-Lys et Lc-Lys2, codée par le génome de L. casei BL23, qui possède toute deux un domaine de liaison au PG d’un nouveau type qui possède la particularité de lier spécifiquement le D-Asp amidé présent dans les ponts interpeptidiques du PG de L. casei BL23. La délétion des deux gènes qui codent pour les endopeptidases Lc-p75 et Lc-p45 chez L. casei BL23 conduit à l’absence de disaccharide dipeptide dans la structure du PG du mutant, tandis que la délétion de Lc-p75 seulement conduit à une réduction de la quantité du disaccharide-dipeptide. Ce disaccharide dipeptide est un ligand des récepteurs Nod2. Les deux mutants obtenus par délétion de Lc-p75 ou bien par délétion des deux endopeptidases ont été comparés avec la souche sauvage BL23 pour leur capacité à activer in vitro des cellules dendritiques humaines dérivées de monocytes sanguins. Suite à l’activation des cellules dendritiques par les souches de L. casei, quatre cytokines pro-inflammatoires, les interleukines IL-6, IL-8, IL-12 et le TNF- ont été produites. La quantité de chaque cytokine sécrétée en réponse aux mutants simple Lc-p75 et double Lc-p75/Lc-p45 était diminuée par rapport à celle induite par la souche sauvage L. casei BL23.En conclusion, L. casei BL23 est doté d’un équipement complexe en PGHs. Les PGHs caractérisées au cours de ce travail présentent des caractéristiques uniques et jouent un rôle important dans la division des bactéries ainsi que dans le maintien de leur morphologie. Nos résultats indiquent que la souche sauvage de L. casei Bl23 et les mutants dérivés obtenus par inactivation d’enzymes à activité endopeptidase, qui diffèrent à la fois au niveau de leur contenu enzymatique ainsi qu’au niveau de la structure de leur PG, ont des effets différents sur les cellules dendritiques humaines, avec un caractère anti-inflammatoire plus élevé pour les mutants / Peptidoglycan (PG) is the major component of the Gram-positive bacteria cell wall. It ensures bacterial cell shape and integrity. PG or PG-derived fragments have been shown to stimulate the host innate immune system, through Nod-2 receptors. In this work, we studied the influence of PG metabolism on immunomodulatory properties of Lactobacillus casei BL23, mainly its ability to modulate the response of human dendritic cells (DCs).We have first characterized the main peptidoglycan hydrolases (PGHs) of L. casei BL23. In silico search revealed that L. casei BL23 has a rather complex PGH complement including thirteen predicted PGHs with various catalytic domains. Proteomic analysis of bacterial cell wall extracts revealed the expression of seven of them during bacterial growth. We characterized four of them in details. Lc-p75 is the major PGH with a γ-D-glutamyl-L-lysyl-endopeptidase specificity and is responsible for daughter cell separation. Lc-p75 associated to the cell wall localizes at the cell septa. It is also one of the major secreted proteins of L. casei found in culture supernatant. Besides, we showed that L. casei Lc-p75 is a glycosylated protein. Lc-p40 is a PGH with a CHAP-domain endowed with endopeptidase hydrolytic specificity toward peptidoglycan cross-bridges and appears to localize on lateral cell wall. Lc-p45 is a second γ-D-glutamyl-L-lysyl endopeptidase with a role in cell shape maintenance. We further demonstrated that two prophage endolysins Lc-Lys and Lc-Lys2, encoded in L. casei BL23 genome, share a common novel type peptidoglycan-binding domain that recognizes specifically D-Asn cross-bridge, present in L. casei BL23 peptidoglycan.Deletion of the two endopeptidases, Lc-75 and Lc-p45, resulted in a complete loss ofdisaccharide-dipeptide, which is a ligand of Nod-2 receptor, in the muropeptide structure of L. casei BL23, whereas deletion of Lc-p75 gene led only to a reduction of disaccharide dipeptide. The two PGH-mutants, obtained by deletion of Lc-p75 gene alone or both Lc-p75 and Lc-p45 endopeptidase genes were compared with wild type L. casei BL23 for their capacity to stimulate signaling pathways in vitro in DCs derived from human monocytes. As a consequence of DC activation by L. casei strains, four pro-inflammatory cytokines IL-6, IL-8, IL-12 and TNF-α were produced. The concentrations of secreted cytokines in response to the single Lc-p75 and Lc-p75/p45 double mutant were lower than those induced by wild type L. casei BL23.In conclusion, L. casei BL23 has a complex PGH complement. The PGHs described in this work present unique features and play important role in cell division and morphology of L. casei. Our results indicate that wild type L. casei and endopeptidase-negative mutants, which differ in their PGH content and in their PG structure, have distinct effects on human DCs, with a higher anti-inflammatory character of the endopeptidase-negative mutants.

Le microbiote intestinal affecte la plupart des processus physiologiques de l’hôte, et plus particulièrement la digestion et le métabolisme. Cependant, les mécanismes moléculaires en jeu restent encore peu connus. Pour répondre à cette question, nous utilisons un modèle gnotobiotique simple : la larve de Drosophile monoassociée à un de ces symbiont naturel : Lactobacillus plantarum. Notre groupe a montré que L. plantarum promeut la croissance larvaire d’individus soumis à une carence en protéines. En effet, les larves monoassociées à L. plantarum se développent bien plus rapidement que des individus axéniques. Ainsi, L. plantarum tempère l’effet délétère de la carence nutritionnelle. Cette amélioration de la croissance repose en partie sur la hausse du niveau d’expression des protéases digestives de l’hôte ainsi que sur la modulation de la voie de signalisation TOR (Target Of Rapamycin) de la Drosophile par les bactéries symbiotiques. Notre travail s’est focalisé sur la recherche d’autres mécanismes génétiques impliqués dans l’interaction entre la Drosophile et L. plantarum au cours de la croissance larvaire. Nos résultats montrent que les variations génomiques naturelles de la Drosophile affectent l’intensité du bénéfice de croissance conféré par L. plantarum. En outre, les bases de notre étude ont permis de mettre en évidence que le microbiote intestinal a la capacité d'agir comme "tampon génétique" en compensant les défauts de croissance causés par le fond génétique des mouches. De plus, L. plantarum permet de diminuer la variation phénotypique de plusieurs caractères de la mouche tels que la croissance, la taille de certains organes et la durée du cycle larvaire. Nous avons également identifié le gène dawdle, codant un ligand de la voie TGF-β, comme acteur de l’interaction Drosophile-L. plantarum. De plus nous avons montré que Dawdle régule les protéases digestives de la Drosophile dans un contexte nutritionnel de carence en protéine, et cette régulation peut-être activatrice ou bien inhibitrice selon l’environnement microbien. / Intestinal microbiota can modulate virtually all aspects of their host physiology, and particularly, digestion and metabolism. However, the molecular mechanisms at play remain largely unknown. To tackle this question, we use a simple gnotobiotic model: Drosophila larvae monoassociated with one of its major natural symbiont, Lactobacillus plantarum. Previous work from our group showed that L. plantarum promotes the juvenile growth of larvae facing a protein scarcity, thereby dampening the deleterious effect of the nutrient deficiency on larval growth. This growth enhancement partially relies on the upregulation of intestinal proteases, as well as on the modulation of the host TOR (Target Of Rapamycin) pathway by the symbionts. My thesis work aimed at unraveling other host genetic mechanisms involved in the interaction between Drosophila and L. plantarum during growth. Our work showed that host natural genomic variations affect the fly physiologic response to L. plantarum. Furthermore, the bases of our work enabled to unveil a novel role of intestinal bacteria, revealing their ability to act as a genetic buffer to compensate the growth impairments due to the fly genetic background. In addition, L. plantarum decreases the phenotypic variations in various host fitness traits (growth, organ size, timing to pupariation) and it also confers robustness to organ patterning. Finally, we showed that the TGF-β ligand, Dawdle plays an important regulatory role on digestive enzymes in a protein-deficient nutritional context, and that this regulation can be inhibitory or activating depending on the microbial environment.

Le peptidoglycane (PG) est le composé majeur de la paroi des bactéries à Gram positif. Il est constitué de chaines de sucres, formées de l’alternance de N-acétyl-glucosamine (GlcNAc) et d’acide N-acétyl-muramique (MurNAc) et reliées entre elles par des chaines peptidiques. Cette structure confère à la bactérie une grande résistance mais aussi une certaine flexibilité qui lui permettent de grandir et de se diviser tout en gardant sa forme. Cette dualité entre rigidité et flexibilité est assurée par un équilibre entre l’activité des enzymes qui polymérisent le PG, les protéines liant la pénicilline (PBP), et de celles qui l’hydrolysent, les hydrolases du PG (PGH). Pendant ou après sa synthèse, la structure du PG peut subir différentes modifications, qui vont moduler l’activité des enzymes de synthèse et dégradation du PG. Au cours de ce travail, nous avons caractérisé les modifications structurales du PG chez deux espèces de lactobacilles et étudié leur rôle fonctionnel. Nous avons identifié la première amidotransférase responsable de l’amidation de l’acide méso-diaminopimélique et montré l’influence de cette modification sur l’activité d’une PGH, la L,D-carboxypeptidase DacB, ainsi que sur la synthèse du PG septal par les PBPs chez Lactobacillus plantarum. Nous avons ensuite mis en évidence pour la première fois une O-acétylation des GlcNAc en plus de l’O-acétylation des MurNAc, ces deux modifications étant réalisées par deux O-acétyl-transférases distinctes, OatA et OatB, qui jouent des rôles antagonistes dans le contrôle de l’activité des PGHs chez L. plantarum. Nous avons aussi révélé l’implication de l’O-acétyl-transférase OatA dans le contrôle de la septation. Enfin, nous avons montré l’influence de l’O-acétylation des MurNAc du PG sur les propriétés anti-inflammatoires d’une souche de Lactobacillus casei. / Peptidoglycan (PG) is the major component of the gram positive cell wall. It is composed of glycan chains formed by the polymerization of the N-acetylglucosamine-N-acetyl muramic acid heterodimer, and cross-linked by peptidic stem. This structure confers high resistance to the bacterial cell wall but also some flexibility allowing growth and shape maintenance. This duality between rigidity and flexibility is the result of a steady-state between the PG polymerizing enzymes, the penicillin binding protein (PBP) and the PG hydrolases (PGH). More or less concomitantly with its synthesis, certain modifications can occur on PG structure that will modulate the activity of PG synthesis and degradation enzymes.During this work, we have characterized the PG structural modifications in two lactobacilli species and studied their functional role. We have identified the first amidotransferase involved in meso-diaminopimelic acid amidation and shown the influence of this modification on the activity of the L,D-carboxypeptidase, DacB, and also on the septal PG synthesis by the PBP in Lactobacillus plantarum. Then, we have highlighted for the first time, the presence of O-acetylation on GlcNAc in addition to O-acetylation on MurNAc. These two modifications are catalyzed by two dedicated O-acetyltransferases, OatB and OatA respectively, that control PGH activity in an antagonistic way. We have also demonstrated the implication of the OatA O-acetyltransferase in septation control. Finally, we have shown the influence of PG MurNAc O-acetylation on the anti-inflammatory properties of a Lactobacillus casei strain.

Résumé confidentiel / Résumé confidentiel

Giardia duodenalis est le protozoaire responsable de la giardiose, la parasitose intestinale la plus répandue dans le monde. Cette infection se caractérise par une malabsorption intestinale, des diarrhées, une perte de poids et des douleurs abdominales intenses chez l’Homme et de nombreux mammifères. Par ailleurs, cette maladie dont l’impact en santé publique et vétérinaire est reconnu, peut entraîner d’importantes déficiences nutritionnelles en particulier chez les sujets jeunes. L’infection est causée par l’ingestion de kystes de Giardia duodenalis (syn. G. lamblia, G. intestinalis) présents dans les aliments ou l’eau contaminée. Infectieux à très faibles doses, ces kystes survivent pendant plusieurs semaines dans l’environnement et sont résistants aux différents désinfectants. Suite au dékystement, la forme végétative de Giardia, le trophozoïte, adhère à l’épithélium intestinal au niveau des parties supérieures de l’intestin grêle et se multiplie, causant les symptômes. Cette phase se termine par un nouvel enkystement et l’excrétion de kystes par les fèces. Le nombre croissant d’infections liées à la contamination de l’eau potable, à l’émergence de souches résistantes aux médicaments disponibles, à la fréquence des échecs thérapeutiques et à l’importance des effets secondaires associés aux traitements font de cette maladie un sujet d’actualité de plus en plus préoccupant qui nécessite le développement de traitements alternatifs. Il est désormais bien établi que le microbiote et/ou certaines souches de bactéries probiotiques ont un impact bénéfique dans la giardiose. En particulier, la bactérie probiotique Lactobacillus johnsonii La1 (LjLa1) a un rôle protecteur contre la croissance de Giardia in vitro et in vivo. Nous avons cherché dans ce travail de Thèse à décrypter les mécanismes moléculaires associés à l’effet inhibiteur des facteurs sécrétés par LjLa1. Nous avons montré qu’in vitro, LjLa1 agissait en libérant des enzymes de type Bile Salt Hydrolases (BSH) qui modifient alors des composants de la bile non-toxiques pour le parasite (sels biliaires conjugués) en des composants toxiques (sels biliaires déconjugués). Les 3 gènes BSH codés dans le génome de LjLa1 ont été clonés chez Escherichia coli et les protéines taguées histidine purifiées pour étudier leurs propriétés biochimiques et biologiques. Obtenues sous forme active, nous avons pu en définir les spécificités de substrats et montrer qu’elles sont capables d’inhiber significativement la croissance de G. duodenalis in vitro et in vivo, dans un modèle murin de la giardiose (souriceaux OF1 non sevrés). En parallèle, nous avons identifié, à l’issue d’un large criblage de souches de lactobacilles selon leur activité anti-Giardia in vitro, une souche probiotique aux effets inhibiteurs comparables à ceux de LjLa1 : Lactobacillus gasseri CNCM-4884. Administrée in vivo dans le modèle murin de la giardiose, cette souche a réduit de 93% la charge parasitaire dans l'intestin grêle des nouveaux nés et a également réduit de façon significative le nombre de kystes libérés dans l’environnement, permettant ainsi de réduire la transmission de Giardia. Des travaux parallèles ont été réalisés au cours de ce projet de Thèse, notamment le développement d’outils de moléculaire pour l’expression hétérologue de molécules d’intérêt en santé animale chez divers lactobacilles. Le développement de ces « vecteurs mucosaux » permettra à terme de proposer une stratégie de surexpression de BSH par les lactobacilles afin d’accroitre l’activité BSH in vivo, et renforcer ainsi l’élimination du parasite. Ces résultats permettent de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques originales contre les giardioses humaines et animales, basées sur l’utilisation de lactobacilles probiotiques ou sur les activités BSH qui en sont dérivées. Ces traitements offrent alors une alternative sérieuse aux antibiotiques et permettront de pallier aux actuels fréquents échecs thérapeutiques. / Giardia duodenalis is a protozoan parasite responsible for giardiasis, the most common intestinal parasitic disease worldwide. This infection is characterized by intestinal malabsorption, diarrhea, weight loss and abdominal pain in humans and various mammalian species. Besides, this disease has a high veterinary and public health impact, leading to important nutritional deficiencies in young subjects. The infection is caused by the ingestion of food or water contaminated with infectious cysts of the parasite. Giardia cysts can survive for several weeks in the environment and are highly resistant to disinfectants. Giardia excysts in the intestinal tracts of its host and replicates under the trophozoite stage causing the symptoms. Trophozoites adhere to the intestinal epithelium of the small intestine and multiply, causing the symptoms. The cycle ends by a new encystment and infectious cysts are released in environments with feces. The increasing number of giardiasis cases, mainly due to water contaminations, the emergence of parasite strains resistant to drugs and therapeutic failures, make research on alternative therapeutic strategies and treatments highly needed. Nowadays, it is well known that the microbiota and probiotics play an important role in protection against this parasite. For instance, the probiotic strain Lactobacillus johnsonii La1 (LjLa1) prevents the establishment of Giardia in vitro and in vivo. In this thesis, we have tried to point out the molecular mechanism(s) involved in this inhibitory effect(s). We showed in vitro that LjLa1 was releasing "Bile Salt Hydrolases" (BSH) – like activities that modify some components of bile (conjugated bile salts) into toxic compounds (deconjugated bile salts) for Giardia. We have cloned and expressed each of the three bsh genes present in the genome of LjLa1 in Escherichia coli in order to study their enzymatic and biological properties. Two BSH were obtained as recombinant active enzymes and biochemical tests showed that they have distinct substrate specificities despite similar predicted 3D structures. Moreover, these two BSHs of LjLa1 exhibited anti-giardial effects in vitro and in vivo in a murine model of the giardiasis (OF1suckling mice), comforting the hypothesis of the biological role of active BSH, derived from probiotics, against Giardia. A wide collection of diverse lactobacilli strains was screened to assess their effectiveness to also display both anti-giardial and BSH activities. This screening allowed the identification of several strains exhibiting strong anti-giardial effects such as Lactobacillus gasseri CNCM I-4884. In a murine model of giardiasis, this strain dramatically reduced the parasite burden in the small intestine of treated animals and significantly reduced the number of cysts in the colon, which could contribute to blockage of parasite transmission in environments. Additional studies were realized in parallel in order to explore the potency of lactobacilli to exert beneficial effects on health. For this, molecular tools were successfully developed in various lactobacilli strains to express and deliver therapeutic molecules at mucosal surfaces. The development of these tools will further allow the overexpression of BSH by lactobacilli to increase their in vivo BSH-activity and strengthen the elimination of the parasite. Altogether, this thesis work proposes new original therapeutic strategies against human and animal giardiasis, based on the use of BSH-positive lactobacilli strains or recombinant BSH- derived from probiotic strains, to counteract the frequent therapeutic failures, offering a serious alternative to antibiotics.