Among 29 strains of bifidobacteria studied as sources of beta-galactosidase enzyme, Bifidobacterium infantis HL96 showed the highest hydrolytic and transgalactosylic activities. This strain grew well in a MRS medium containing various sugars including lactose, and produced three beta-galactosidases (termed beta-Gal I, II, III). / Two genes, beta-galI and beta-galIII, located on 4.6 and 4.4 kb DNA fragments respectively, were cloned into E. coli, and the nucleotide sequences were determined. The 3,069 by-long beta-galI, encoded a polypeptide with a Mr of 113 kDa. A putative ribosome-binding site and a promoter sequence were recognized at the 5' flanking region of beta-galI. A partial sequence of an ORF transcribing divergently from beta-galI resembled a lactose permease gene. The beta-galIII gene, which is 2,076 bp long, encoded a polypeptide with a Mr of 76 kDa. A rho-independent, transcription terminator-like sequence was found 25 bp downstream of the termination codon. / The amino acid sequences of beta-GalI and beta-GalIII were homologous to those in the LacZ and LacG families, respectively. The acid-base, nucleophilic, and substrate recognition sites conserved in the LacZ family were found in beta-GalI, and a possible acid-base site proposed for the LacG family was located in beta-GalIII, containing a glutamate at residue 160. beta-GalI and beta-GalIII were over-expressed 35 and 96 times respectively in E. coli by using a pET expression system. / Both beta-GalI and beta-GalIII were specific for beta-D -anomeric linked galactosides, but beta-GalI showed more hydrolytic and synthetic activities toward lactose than beta-GalIII. The galacto-oligosaccharides (GaOS) production mediated by beta-GalI at 37°C in 20% (w/v) lactose was 130 mg/ml, which is six times higher than that of beta-GalIII. The yield of GaOS further increased to 190 mg/ml in 30% (w/v) lactose. A major tri-saccharide produced by beta-GalI was characterized as O-beta- D-galactopyranosyl-(1-3)-O-beta-D-galactopyranosyl-(1-4)- D-glucopyranose. / beta-GalI was purified by ammonium sulphate precipitation, and anion-exchange (Mono-Q) and gel filtration (Superose 12) chromatographic steps. The enzyme appeared to be a tetramer, with a Mr of 470 kDa as estimated by native PAGE and gel-filtration chromatography. The optimum temperature and pH for ONPG and lactose as substrates were 60°C, pH 7.5, and 50°C, pH 7.5, respectively. The enzyme was stable over the pH range of 5~8.5, and was particularly active at 50°C for more than 80 min. The enzyme was significantly activated by reducing agents, especially glutathione, as well as by Na+ and K+ cations. Maximal activity required both Na+ and K+ at a concentration of 10 mM. The enzyme was strongly inhibited by p-chloromercuribenzoic acid, and by most bivalent metal ions. Hydrolytic activity using 20 mM lactose as substrate was significantly inhibited by 10 mM galactose. The Km and Vmax values for ONPG and lactose were 2.6 mM, 262 U/mg, and 73.8 mM, 1.28 U/mg, respectively. / The objectives of this research were to characterize beta-galactosidases of B. infantis HL96 at the molecular and biochemical levels, and to over-express the enzymes in Escherichia coli. Two beta-galactosidase isoenzymes with unique properties were genetically characterized for the first time. beta-GalI properties included a neutral pH optimum, relatively higher temperature stability and a high transgalactosylic activity that makes it very competitive for GaOS synthesis. The results were also important for the advancement of knowledge on the catalytic mechanism and the evolutionary aspect of this enzyme.

Zugl.: Karlsruhe, Universiẗat, Diss., 2007.

Thesis (Ph. D.)--Ohio state University, 1922. / Autobiography. Includes bibliographical references.

Thesis (Ph. D.)--Ohio state University, 1929. / Biography. Bibliography: p. [21].

Thesis (Ph. D.)--Ohio state University, 1929. / Biography. Bibliography: p. [21].

Thesis (Ph. D.)--University of Alberta, 2010. / Title from pdf file main screen (viewed on June 29, 2010). A thesis submitted to the Faculty of Graduate Studies and Research in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy in Bioresource and Food Engineering, Department of Agricultural, Food and Nutritional Science, University of Alberta. Includes bibliographical references.

Th. 3e cycle--Biochim., microbiol. Lille 1, 1979. N°: 778.

A hipolactasia do tipo adulto é o fenótipo determinado pela diminuição da expressão da lactase após o período de lactação. Ela ocorre em um grande número de adultos em todo o mundo. A lactase é produzida pelos enterócitos e sua função principal é hidrolisar a lactose, que é o carboidrato do leite. Os indivíduos intolerantes à lactose irão apresentar sintomas como inchaço, flatulência, náusea e diarreia causados pela fermentação da lactose. A persistência da lactase (PL) é o fenótipo no qual a expressão da lactase se mantém elevada durante toda a vida. Na Europa, a PL foi relacionada a um polimorfismo de base única (SNP) localizado a aproximadamente 14 Kb do sítio de início da transcrição do LCT (gene da lactase), dentro de um íntron do gene MCM6, sendo este SNP uma troca de C para T na posição -13910 (rs4988235). Na África e Oriente Médio os seguintes SNPs foram relacionados a PL: - 13907C>G (rs41525747), -13915T>G (rs41380347), -14010G>C (rs145946881). O gene LCT também possui SNPs na região codificadora e na região promotora que não estão envolvidos com a PL. Estes SNPs apresentam alto desequilíbrio de ligação formando haplótipos, sendo que os haplótipos A, B, C e U são os mais frequentes na maioria das populações. No Brasil, dados sobre os alelos relacionados com a persistência da lactase são escassos. Além disso, dados populacionais relacionados à diversidade do gene LCT ainda não foram descritos para nossas populações. Portanto, o objetivo deste trabalho foi estudar a diversidade do gene LCT, da região codificadora do gene, da região promotora proximal e da região enhancer população brasileira. Um total de 1297 indivíduos foram analisados. As populações estudadas foram nativos brasileiros (Kaingang N=72, Xavante N=101, Guarani-Kaiowá N=84 e Guarani-Ñandeva N=59), eurodescendentes de Porto Alegre (Rio Grande do Sul, N=337), afrodescendentes de Porto Alegre (N=182), miscigenados de Belém (Pará, N=200) e de Recife (Pernambuco, N=262). Doze SNPs foram analisados, 10 nas regiões codificadora e promotora do LCT e 2 na região enhancer. As metodologias utilizadas na genotipagem destes SNPs foram PCR-RFLP, discriminação alélica pelo sistema TaqMan e sequenciamento. O sequenciamento também foi utilizado na busca de novos alelos da região enhancer. Com relação à população nativa, o único alelo de PL encontrado foi o -13910*T, variando de 0,5% em Xavante a 7,6% nos GuaraniÑandeva. O gene LCT foi altamente polimórfico apresentando 15 haplótipos com distribuição heterogênea nas populações nativas. Na população brasileira em geral, a frequência do alelo -13910*T foi maior (0,295) nos eurodescendentes de Porto Alegre e menor (0,175) na população de Belém. Nos grupos de afrodescendentes de Porto Alegre, Belém e Recife, 4 outras variantes, previamente descritas, da região enhancer foram encontradas: - 13779G>C, -13937G>A, -14010G>C, -14011C>T. Vinte e seis haplótipos previamente descritos foram identificados. O estudo de associação da presença do alelo -13910*T com a presença da síndrome metabólica nos eurodescendentes de Porto Alegre demonstrou que os indivíduos persistentes apresentam menor risco do que os não persistente de ter síndrome metabólica (OR=0,47; p=0,023). Na tentativa de auxiliar no entendimento das causas da PL foi realizado um estudo funcional da variante -13937G>A. Os resultados demonstraram que o alelo derivado não direciona maior expressão do gene repórter em células em cultura. Considerando os dados obtidos no presente trabalho e os disponíveis na literatura, ressaltamos a importância dos estudos que buscam compreender a PL pela busca de novos alelos, por estudos de correlação fenótipo-genótipo e também pelos estudos funcionais para a caracterização das variantes encontradas em relação ao fenótipo da lactase. / Adult-type hypolactasia is the phenotype determined by the decreased lactase expression after weaning. It occurs in a high number of adults in the world. Lactase is produced by the enterocytes and its major function is to hydrolyze lactose, the milk carbohydrate. The lactose intolerant individuals will have symptoms like bloating, flatulence, nausea and diarrhea caused by the lactose fermentation. Lactase persistence (LP) is the high lactase expression during adulthood. In Europe, the LP was related to a single nucleotide polymorphism (SNP) located approximately 14 Kb from the LCT (lactase gene) transcription initiation site, within a MCM6 gene intron, and this SNP is a C to T mutation in the -13910 position (rs4988235). In Africa and Middle East, the following SNPs were related to LP: - 13907C>G (rs41525747), -13915T>G (rs41380347), -14010G>C (rs145946881). LCT gene also has SNPs in the coding and promoter region that are not involved in the LP. These SNPs have high linkage disequilibrium forming haplotypes, with the A, B, C and U being the most frequent haplotypes in the majority of the populations. In Brazil, data about the LP related alleles are rare. Moreover, population data related to LCT gene diversity was not described for our population. Hence, the aim of this work was to study the LCT gene diversity in the coding region, in the proximal promoter region, and in the enhancer region in the Brazilian population. In total, 1297 individuals were investigated. The populations studied were Brazilian natives (Kaingang N=72, Xavante N=101, Guarani-Kaiowá N=84 and Guarani-Ñandeva N=59), Eurodescendants from Porto Alegre (Rio Grande do Sul state N=337), Afrodescendants from Porto Alegre (N=182), admixed individuals from Belém (Pará state, N=200) and from Recife (Pernambuco state, N=262). We analyzed 12 SNPs, 10 in the coding and promoter region of the LCT gene and 2 in the enhancer region. The genotyping methodologies applied were PCRRFLP, allelic discrimination by TaqMan system and sequencing. Sequencing was also employed for new alleles identification in the enhancer region. In relation to the native population, the only LP allele found was -13910*T, and the frequency ranged from 0.5% in Xavante to 7.6% in Guarani-Ñandeva. The LCT gene was highly polymorphic showing 15 haplotypes with heterogeneous distribution in the native populations. In the general population, the frequency of the -13910*T was higher (0.295) in Eurodescendants from Porto Alegre and lower (0.175) in the Belém population. In the groups of Afrodescendants from Porto Alegre, Belém and Recife, 4 other previously described variants in the enhancer region were found: -13779G>C, - 13937G>A, -14010G>C, -14011C>T. Twenty-six haplotypes previously described were found in the Brazilian population. The association study of the -13910*T allele and of the presence of the metabolic syndrome in the Eurodescendants from Porto Alegre showed that the persistent individuals have lower risk than the non-persistent of developing metabolic syndrome (OR=0.47, p=0.023). In an attempt to disclose LP causality, a functional study of the -13937G>A variant was performed. The results showed that the derived allele does not drive a higher expression of the reporter gene in cells in culture. Considering the results of this study and the data available in the literature, we emphasize the importance of the studies that try to determine the LP looking for new alleles, phenotype-genotype studies, and functional studies to characterize the variants found related to the lactase phenotype.

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Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T05:19:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2013-07-16T20:33:15Z : No. of bitstreams: 1 279411.pdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / O processo de ultrafiltração do soro de queijo, para a recuperação e concentração de suas proteínas, representa um importante avanço na utilização desde subproduto. O interesse comercial maior está na fração retida pela membrana constituída pelo concentrado. Entretanto, o permeado, que é composto basicamente por água, lactose e sais minerais, ainda representa um problema quando despejado diretamente no meio ambiente, pois a lactose que permanece no mesmo é a principal responsável pelos altos valores da demanda biológica de oxigênio (DBO). Assim, processos que visam à utilização da lactose presente no soro de queijo precisam ser investigados e implementados. Este trabalho teve por objetivo estudar a conversão da lactose pela enzima -galactosidase. Tanto a hidrólise, quanto a síntese de galacto-oligossacarídeos (GOS), foram estudadas em reatores em duas distintas configurações - fluxo perpendicular e fluxo tangencial. Para a hidrólise da lactose foram utilizadas membranas de ultrafiltração preparadas à partir de polifluoreto de vinilideno (PVDF) e polietersulfona (PES). Para a síntese de GOS foram utilizadas membranas de nanofiltração preparadas à partir de acetato de celulose (AC). Para a hidrólise da lactose utilizou-se o permeado obtido da ultrafiltração do soro de queijo. O permeado foi tratado termicamente a 80°C/20min para remoção, por precipitação, das proteínas e peptonas que, devido à baixa massa molar destes compostos, permeiam as membranas de ultrafiltração. A taxa de hidrólise no permeado foi quantificada através da massa de glicose liberada, utilizando-se de técnica colorimétrica. As maiores taxas de hidrólise foram obtidas quando foi utilizado 0.2 g.L-1 de enzima, tanto no reator com fluxo perpendicular (95%), quanto no reator com fluxo tangencial (78%). O efeito da interferência das proteínas presentes no permeado, no método analítico para determinação da glicose, também foi investigado. Verificou-se que na presença das proteínas, a quantidade de glicose medida é subestimada em até 50%, independentemente da concentração destes compostos presentes no permeado. Através de espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), constatou-se adsorção da enzima na superfície da membrana. Verificou-se que esta fração adsorvida ainda apresentava atividade enzimática residual. A síntese de GOS foi estudada utilizando-se soluções concentradas de lactose. Inicialmente, a síntese e o fracionamento de GOS foram estudados separadamente. A enzima foi imobilizada em resina Duolite A-568. Verificou-se que quanto maior a quantidade de enzima utilizada na imobilização, maior quantidade de proteína é adsorvida, mas com maior perda de sua atividade e quantidade de proteína dessorvida. A concentração de enzima de 10 U.mL-1 foi selecionada em reações descontínuas e implementada em reações contínuas, utilizando-se concentração de lactose de 150 g.L-1 e 300 g.L-1, a 40°C. A concentração total influenciou tanto a síntese, quanto no fracionamento dos GOS. Quanto maior a concentração inicial de lactose, maior foi a quantidade de GOS sintetizada. As misturas de açúcares obtidas destas reações foram fracionadas utilizando-se membranas de acetato de celulose, preparadas pela técnica de inversão de fase. O coeficiente de rejeição (Robs) dos açúcares aumentou com o aumento da pressão transmembrana utilizada na filtração e diminuiu com o aumento de sua concentração. Para a menor pressão aplicada, os valores de Robs obtidos foram 40% para monossacarídeos, 65-80% para os dissacarídeos e 100% para os trissacarídeos. A reação de síntese e fracionamento em simultâneo foi realizada com 10 U.mL-1 de enzima e 150 g.L-1 de lactose a 40°C. O efeito da pressão (20 e 24 bar) e da velocidade de circulação (1.7; 2.0 e 2.4 m.s-1) foram estudados e a quantificação dos açúcares foi feita através de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). O rendimento da reação e fracionamento em simultâneo foi de 60%, quando comparado com o rendimento da reação nas mesmas condições, mas sem permeação. Os coeficientes de rejeição foram distintos de acordo com as condições operacionais, sendo os monossacarídeos mais afetados que apresentaram rejeição de 40%, a 20 bar e 12% a 24 bar. A baixa rejeição dos monossacarídeos no meio reacional tem um papel fundamental na qualidade do produto final e na reação de hidrólise e síntese, uma vez que a sua presença inibe a atividade enzimática. Os GOS-4 foram totalmente retidos pela membrana e os GOS-3 apresentaram Robs em torno de 90%. Entre os dissacarídeos lactose, GOS-2 e GOS-2', os valores de Robs variaram de 41% a 84% de acordo com as condições operacionais utilizadas na filtração. Como esperado, a adsorção da enzima na membrana afeta o transporte dos sacarídeos através de sua estrutura, resultando em menor taxa de permeação.