Le vieillissement est associé à des changements de la composition corporelle, tels que l’augmentation de la masse grasse et la diminution de la masse musculaire. La sarcopénie, qui fait référence à la perte de masse musculaire avec le vieillissement, peut augmenter les risques de chute, d'incapacité physique et a été associé à un risque accru de mortalité. L’entrainement en résistance est considéré comme la stratégie la plus efficace pour lutter contre la sarcopénie, mais les résultats semblent dépendre de l’apport en acides aminés essentiels, qui proviennent principalement de sources animales. Dans notre laboratoire, une étude d’intervention de 16 semaines a permis de démontrer que l’entrainement musculaire permettait un gain de masse et force musculaire chez des hommes âgés sarcopéniques et cela avec ou sans supplémentation riche en protéines d’origine animale (lait de vache). Néanmoins, cette même étude a aussi révélé que la combinaison de l’entrainement musculaire et de la supplémentation riche en protéines est nécessaire pour induire une perte de masse grasse. Afin de comprendre ces résultats, nous avons alors décidé d’étudier l’impact aigu de ce type de stratégie sur l’oxydation des substrats et la mobilisation des graisses afin de tenter d’identifier les mécanismes à l’origine de la perte de masse grasse. Pour ce faire, 9 hommes âgés entre 60 et 75 ans et actifs ont été recrutés et ont terminé l’étude. Chaque participant a été invité à réaliser 3 conditions expérimentales de manière aléatoire: 1) Entrainement en résistance + Lait de vache (ER+LV), 2) Entrainement en résistance + Lait de riz (condition sans protéines; ER+LR), 3) Entrainement en résistance + Eau (condition témoin; ER+EAU). Pendant les 3 heures qui suivaient la fin de chaque intervention, nous mesurions la dépense énergétique, l’oxydation des substrats (calorimétrie indirecte), la mobilisation des graisses (concentrations plasmatiques de glycérol et d’acides gras libres) et le métabolisme glucidique (concentration plasmatique de glucose et insuline). Nos principaux résultats montrent que l’oxydation des lipides (%) est similaire entre les conditions ER+LR et ER+LV bien que plus faible que celle observée dans la condition ER+EAU durant les 2 premières heures. Concernant la mobilisation des graisses, les concentrations de glycérol ne montrent aucune différence au cours des 3 heures. Néanmoins, les niveaux sanguins d’acides gras libres ont augmenté de manière plus importante dans la condition ER+EAU suite à la fin de la séance d’entrainement. Enfin, suite à la condition ER+LV, nous avons observé une réponse du métabolisme glucidique similaire à ER+EAU. Bien qu’il soit possible que l’effet chronique diffère de l’effet aigu, la similitude des résultats entre les conditions ER+LR et ER+LV nous pousse à croire que la perte de masse grasse plus élevée qui a été observée suite à 16 semaines d’entrainement musculaire combiné à une supplémentation en protéines d’origine animale n’est pas expliquée par une plus grande mobilisation des graisses, ni une plus grande oxydation des substrats. Cependant, l’utilisation de méthodes indirectes (acides gras libres et glycérol) pour estimer la mobilisation des graisses pourrait aussi expliquer l’absence de différence entre ces conditions expérimentales.

Le développement de l’allergie peut être influencé par le microbiote intestinal qui est impliqué dans la maturation du système immunitaire de l’hôte lors de la colonisation du tractus digestif dès la naissance. L’objectif de mon travail a été d’étudier l’impact du microbiote intestinal sur le développement d’une sensibilisation allergique à des protéines de lait de vache à l’aide d’un modèle de souris BALB/c gnotoxéniques. Dans une première étude, nous avons montré que les souris axéniques (Ax, sans germe) sont plus réactives que les souris conventionnelles (CV) au potentiel immunogénique et allergénique de la β-lactoglobuline (BLG) et de la caséine (CAS), lorsque ces deux protéines sont injectées intrapéritonéalement sans adjuvant. A l’aide d’un autre modèle de sensibilisation par voie orale au lait, nous avons confirmé que les souris Ax développent des réponses IgE contre la BLG plus fortes que celles des souris CV. Les mécanismes de sensibilisation contre la BLG et la CAS sont alors différemment affectés par la présence ou non d’un microbiote intestinal. Par ailleurs, une colonisation tardive du tractus digestif de souris Ax à l’âge de 6 semaines par le microbiote de souris CV induit chez les souris conventionnalisées (CVd) le développement, après sensibilisation, de réponses humorales toujours plus fortes que celles observées chez les souris CV. A l’inverse, une conventionnalisation des souris Ax au moment du sevrage à l’âge de 3 semaines, induit un niveau de sensibilisation plus faible que celui des souris CV. Dans ce cas, des différences de composition du microbiote intestinal entre souris CV et CVd pourraient jouer un rôle dans le faible niveau de sensibilisation des souris CVd. Nous avons enfin évalué l’impact de l’implantation dès la naissance d’une souche de Lactobacillus casei en monoxénie (souris Mx). La réponse humorale contre la CAS, mais pas contre la BLG, est alors significativement plus élevée chez les souris Mx que chez les souris Ax. Ces différentes études suggèrent que l’influence du microbiote sur le développement d’une sensibilisation aux protéines du lait de vache diffère selon les allergènes et selon le mode d’exposition aux allergènes. Ces résultats soulignent également qu’un retard de colonisation du tractus digestif peut perturber durablement la réactivité du système immunitaire à une sensibilisation contre des antigènes alimentaires. / The development of allergic responses can be influenced by the gut microbiota, which critically stimulates the maturation of the host immune system during colonization of the digestive tract at birth. We thus aimed to study the impact of the gut microbiota on the development of an allergic sensitization to cow's milk proteins by using a gnotobiotic BALB/c mouse model. First, we showed that germ-free (GF) mice are more responsive than conventional mice (CV) to the immunogenic and allergenic potential of β-lactoglobulin (BLG) and casein (CAS) when these proteins are injected intraperitoneally without adjuvant. With another model of oral sensitization to cow’s milk, the development of higher BLG-specific IgE responses in GF mice compared to CV mice was confirmed. We also observed that the mechanisms leading to oral sensitization to BLG and CAS are differentially affected by the absence of gut microbiota. Furthermore, a delayed colonization of the digestive tract of 6-week-old GF mice by a conventional microbiota was studied. The conventionalized mice (CVd) still developed, after sensitization, higher antibody responses than those measured in CV mice. In contrast, GF mice conventionnalized just after weaning, at 3 week of age, displayed a level of sensitization lower than that of CV mice. Differences in the gut microbiota composition evidenced between CVd and CV mice could also play a role in the lower level of sensitization of CVd mice. Finally, we evaluated the impact of the neonatal mono-colonization of mice by a strain of Lactobacillus casei. The antibody responses against CAS, but not against BLG, were then significantly higher in mono-associated mice than in GF mice. These studies suggest that the influence of microbiota on the development of sensitization to cow's milk proteins depends on the nature of the allergens and the mode of exposure. These results also underline that delayed bacterial colonization altered persistently the host immune response to oral sensitization against food antigens.

Le développement de l'allergie peut être influencé par le microbiote intestinal qui est impliqué dans la maturation du système immunitaire de l'hôte lors de la colonisation du tractus digestif dès la naissance. L'objectif de mon travail a été d'étudier l'impact du microbiote intestinal sur le développement d'une sensibilisation allergique à des protéines de lait de vache à l'aide d'un modèle de souris BALB/c gnotoxéniques. Dans une première étude, nous avons montré que les souris axéniques (Ax, sans germe) sont plus réactives que les souris conventionnelles (CV) au potentiel immunogénique et allergénique de la β-lactoglobuline (BLG) et de la caséine (CAS), lorsque ces deux protéines sont injectées intrapéritonéalement sans adjuvant. A l'aide d'un autre modèle de sensibilisation par voie orale au lait, nous avons confirmé que les souris Ax développent des réponses IgE contre la BLG plus fortes que celles des souris CV. Les mécanismes de sensibilisation contre la BLG et la CAS sont alors différemment affectés par la présence ou non d'un microbiote intestinal. Par ailleurs, une colonisation tardive du tractus digestif de souris Ax à l'âge de 6 semaines par le microbiote de souris CV induit chez les souris conventionnalisées (CVd) le développement, après sensibilisation, de réponses humorales toujours plus fortes que celles observées chez les souris CV. A l'inverse, une conventionnalisation des souris Ax au moment du sevrage à l'âge de 3 semaines, induit un niveau de sensibilisation plus faible que celui des souris CV. Dans ce cas, des différences de composition du microbiote intestinal entre souris CV et CVd pourraient jouer un rôle dans le faible niveau de sensibilisation des souris CVd. Nous avons enfin évalué l'impact de l'implantation dès la naissance d'une souche de Lactobacillus casei en monoxénie (souris Mx). La réponse humorale contre la CAS, mais pas contre la BLG, est alors significativement plus élevée chez les souris Mx que chez les souris Ax. Ces différentes études suggèrent que l'influence du microbiote sur le développement d'une sensibilisation aux protéines du lait de vache diffère selon les allergènes et selon le mode d'exposition aux allergènes. Ces résultats soulignent également qu'un retard de colonisation du tractus digestif peut perturber durablement la réactivité du système immunitaire à une sensibilisation contre des antigènes alimentaires.

Le lait de chamelle constitue l'une des principales ressources alimentaires pour les peuples nomades. Malgré sa richesse en différents composants et sa production non négligeable au niveau mondial, ce produit demeure relativement peu transformé à cause du manque d’études menées sur les caractéristiques et les aptitudes technologiques de ce lait.Dans la première partie de cette thèse, l’évolution de la structure au cours de la coagulation enzymatique et acide des laits de chamelle et de vache crus et chauffés (50 et 70 °C) enrichis en minéraux (calcium et phosphate) a été étudiée. Les cinétiques de coagulation enzymatique et acide des échantillons du lait ont été suivies aux moyens du test de cisaillement dynamique et de la spectroscopie de fluorescence frontale. Les résultats obtenus ont permis, d’une part, de montrer des différences significatives entre les propriétés du coagulum obtenu à partir du lait de chamelle et celui du lait de vache, et d’autre part, d’évaluer l'impact de l’ajout des minéraux (calcium et phosphate) sur les propriétés du coagulum. L’analyse des spectres de fluorescence par analyse en composantes principales (ACP) a permis de caractériser sur le plan moléculaire la structure des gels, et également de discriminer les différentes conditions de coagulation. Les résultats rhéologiques ont montré que l’enrichissement de ces deux types de lait avec le calcium améliorait la fermeté du gel et diminuait le temps de gélification, alors que des effets inverses ont été observés suite à l’ajout du phosphate. L’analyse conjointe des données spectrales et rhéologiques au moyen de l’analyse en composantes communes et poids spécifiques (ACCPS) a montré une forte relation entre la structure au niveau moléculaire et la texture au niveau macroscopique. La deuxième partie de cette thèse a porté sur l’impact du traitement thermique (55 à 75 °C à différents intervalles de temps) sur les changements moléculaires du lait de chamelle. L’application de l’ACCPS aux spectres de la vitamine A, des produits fluorescents de la réaction du Maillard (PFRM) et du NADH a montré une bonne discrimination des échantillons en fonction du couple température-temps. Les résultats obtenus montrent que, de par sa rapidité, la spectroscopie de fluorescence frontale couplée aux méthodes chimiométriques présente un potentiel intéressant pour la caractérisation du lait de chamelle dans différentes conditions. En outre, le spectre de fluorescence d’un lait pourrait être considéré comme une empreinte digitale de celui-ci permettant de l’identifier. / Camel milk is one of the main food resources for nomadic people. Despite its richness in different components and its production in the world, this product remains poorly processed because of the lack of studies conducted on the characteristics and the technological abilities of this milk. In the first part of this thesis, the evolution of the structure during the enzymatic and acid coagulation of raw and heated (50 and 70 °C) camel and cow’s milk following the addition of minerals (calcium and phosphate) was studied. The kinetics of acid and enzymatic-induced coagulation of milk were followed using shear dynamic testing rheology at the macroscopic level and front-face fluorescence spectroscopy at the molecular scale. The obtained results showed significant differences between the properties of the coagulum that depends on the milk species and the level of added minerals (calcium and phosphate). The analysis of spectral data by principal component analysis allowed to characterize the coagulum structure at the molecular level as well as the discrimination of different coagulation conditions. The rheological results showed that the enrichment of both types of milk with calcium improved the gels firmness and reduced the gelation time, while opposite trend was observed following the addition of phosphate. The joint analysis of fluorescence spectral data and rheological measurements by applying common components and specific weights analysis showed a strong relationship between the structure at the molecular scale and the texture at the macroscopic level. The second part of this thesis focused on the impact of heat treatment (55 to 75 °C at different times) on the molecular changes in camel milk. The application of common components and specific weights analysis to the vitamin A, fluorescent Maillard reaction products and NADH fluorescence spectra enabled the discrimination of milk samples according to the temperature and time. The obtained results showed that front-face fluorescence spectroscopy coupled with chemometric tools enabled the characterization of camel milk in different conditions. Additionally, the fluorescence spectrum recorded on milk could be considered as a fingerprint allowing its identification.

Les équilibres en calcium (Ca) entre la phase soluble et la phase colloïdale ont été étudiés dans des systèmes lactés (laits de vache, de soja Hydrolysé ou Non-Hydrolysé). La supplémentation en Ca (CaCl2, CC, 25 mmoles.kg-1) a été suivie d’un cycle de pH (pHmin 5,5 ou 3,5). Le pH, la concentration en calcium ionisé (Ca2+), la turbidité et la viscosité apparente ont été reliés aux variations de la phase protéique. La concentration en Ca2+, initialement négligeable dans le lait de soja, augmente avec l’addition en Ca, ainsi qu’avec l’acidification et diminue lors de l’alcalinisation. Pour le lait de vache non supplémenté, le cycle de pH à 5,5 n’est réversible ni sur les variations en Ca2+, ni sur les variations de la phase protéique, contrairement au lait de vache supplémenté en Ca. Ceci pourrait être dû à la capture préalable en Ca, entraînant un renforcement des micelles de caséines. Pour des cycles de pH à 5,5, l’agrégation induite par l’acidification est partiellement ou complètement réversible lors de l’alcalinisation pour les laits de soja NH et H, mais l’agrégation induite par le Ca est irréversible. Quelque soit le système, des phénomènes sont irréversibles lors de cycle de pH à 3,5. Les interactions Ca-protéines (de vache ou de soja) étudiées par CTI montrent des signaux endothermiques similaires, probablement dû au relargage de molécules d’eau. La liaison du Ca pourrait être décrite comme un échange H+/Ca2+ étant donné les force électrostatiques impliquées. Les sites de fixation du Ca on été identifiés par IR-TF. L’énergie d’absorption diminue dans les région amides I et II et dans la région carboxylate lors de l’addition de Ca / Ca equilibrium between soluble and colloidal phases was studied in milky systems (milk, Non Hydrolysed, NH, or Hydrolysed, H, soy milks). Calcium chloride supplementation (CC, 25 mmoles.kg-1) was followed by pH cycle (pHmin 5.5 or 3.5). pH, Ca2+, turbidity and apparent viscosity were recorded in situ. Ca equilibria were related to protein phase variations. Contrarily to milk, Ca2+ concentration was initially negligible in soy milks. Yet, whatever the milky system, Ca2+ increased upon CC addition and with acidification, and decreased during alkalinization. For reference milk, pH cycle to 5.5 was reversible neither on Ca2+ variations nor on protein phase contrarily to CC-milk. This could be due to the previous capture of Ca during supplementation, involving casein micelles reinforcement through Ca-protein interactions. For pH cycle to 5.5, acid-induced aggregation was partially and completely reversible upon alkalinization for NH and H-soy milks, respectively. Once CC addition, Ca-induced aggregation was irreversible and pH cycle had minor effects. Whatever the system, the irreversibility of phenomena was observed for pH cycle to 3.5. Ca-(milk or soy) protein interactions studied by ITC showed similar endothermic signals, probably due to the water release occurring upon interaction. Ca binding should rather be described as H+/Ca2+ exchange with respect to the electrostatic forces involved. Finally, Ca-binding sites were identified with FTIR spectroscopy. A decrease of the absorption energy in the amide I and II region and in the carboxylate region occurred upon CC-addition, with higher variations in soy milks

Les maladies allergiques sont de plus en plus fréquentent. Elles atteignent souvent l’enfant jeune chez qui l’allergie respiratoire et l’allergie alimentaire sont les principales pathologies. L’unique traitement curatif est l’immunothérapie spécifique d’antigène (ITA), largement développée dans l’allergie respiratoire et encore à ses débuts dans l’allergie alimentaire. Pour adapter au mieux la prise en charge du patient, le diagnostic précis de l’allergie est indispensable et il n’existe actuellement pas d’examen biologique totalement fiable. Seul, la présence d’IgE spécifiques permet de diagnostiquer une sensibilisation à un allergène mais pas une allergie cliniquement symptomatique. Dans une première partie, nous avons étudié l’intérêt d’un test fonctionnel, l’ELISpot (Enzyme-linked immunosorbent spot), dans le diagnostic de l’allergie aux acariens chez l’enfant asthmatique. Le nombre de lymphocytes T circulants spécifiques d’acariens sécréteur d’interleukine (IL)-4 ou d’IL-13 était associé à la présence d’une allergie symptomatique, indépendamment des IgE spécifiques. Il était plus élevé dans le cas d’une rhinite allergique sévère et plus faible dans le cas d’une rhinite allergique légère. De plus, il variait au cours de l’année en fonction des saisons avec un pic en automne et un pic en début de printemps. Dans une deuxième partie, nous avons étudié l’intérêt de l’ELISpot dans le diagnostic de l’allergie au lait de vache chez l’enfant, confirmée par un test de provocation orale en double aveugle. Nous avons décrit que le nombre de lymphocytes T spécifiques de la caséine et sécréteurs d’IL-4 et d’IL-13 était associé à l’allergie au lait de vache avec une sensibilité de 100%. Par ailleurs, le nombre de lymphocytes T spécifiques de la caséine était également associé à la dose maximale de lait tolérée par l’enfant.Enfin, dans une troisième partie, nous avons étudié la réponse lymphocytaire T au cours d’une ITA sub-linguale (SLIT) d’une part et sous-cutanée (SCIT) d’autre part, chez des enfants asthmatiques allergiques aux acariens suivis pendant une année. Nous avons décrit une diminution des lymphocytes Th2 (sécréteurs d’IL-4 et IL-13) spécifiques d’acariens après 12 mois de SLIT associée à une augmentation des cellules sécrétrices d’IL-10 (Tr1) spécifiques d’acariens après 6 mois de SLIT. De plus, les lymphocytes T régulateurs (CD4+CD25hiCD127loFoxp3+) étaient augmentés après 12 mois de SCIT. Nous n’avons pas retrouvé de production accrue d’interféron γ (IFNγ) par les lymphocytes T spécifiques d’acariens au cours de la désensibilisation.Au total, ce travail nous a permis de décrire qu’un test fonctionnel, l’ELISpot, permet de réaliser un diagnostic fiable de l’allergie aux acariens et de l’allergie au lait de vache chez l’enfant. Par ailleurs, l’ITA induit une diminution des cellules Th2 et une augmentation des cellules Tr1 par voie sub-linguale ainsi qu’une augmentation des Treg Foxp3+ par voie sous-cutanée sans immunodéviation Th2/Th1, chez l’enfant allergique aux acariens. / Allergic diseases are steadily increasing steadily and especially in children. Allergen specific immunotherapy (desensitization) is the only curative treatment for which accurate diagnosis of allergy is essential. Currently, the presence of specific IgE diagnoses a sensitization to an allergen but not a clinically symptomatic allergy. In a first part, we studied the value of a functional test, the ELISpot (Enzyme-linked immunosorbent spot) in the diagnosis of allergy to house dust mites (HDM). The number of circulating HDM-specific IL-4 and IL-13 secreting T cells was associated with the presence of symptoms, regardless of specific IgE and was higher in severe rhinitis than in mild rhinitis. In addition, it varied according to the season with a peak in autumn and a peak in early spring (wet periods with greater allergen exposure). In a second part, we studied the value of ELISpot for the diagnosis of cow's milk allergy in children, confirmed by double blind placebo control food challenge. We found that the number of casein-specific IL-4 and IL -13 secreting T-cells was associated with allergy to cow's milk. It was also inversely correlated to the cow’s milk tolerated cumulative dose. Receiver-operating characteristic (ROC) curve of combined IL-4 and IL-13 analysis was generated. AUC was 0,98 (95% CI 0.90-1.06). For a cut-off of 10 IL-4- and 12 IL-13 secreting T-cells, sensitivity and negative predictive value were 100%.Finally, in the third part, we monitored antigen specific T-cell response in HDM allergic children treated with sublingual ITA (SLIT) on the one hand and subcutaneous ITA (SCIT) on the other hand, during one year. We found a decrease in HDM specific Th2 cells after 12 months of SLIT associated with an increase in HDM specific IL-10 secreting T-cells after 6 months of SLIT. In addition, regulatory T cells (CD4 + CD25hiCD127loFoxp3+) were increased after 12 months of SCIT. In conclusion, this work has allowed us to describe a functional test, the ELISpot, as a reliable tool for the diagnosis of mite allergy and cow's milk allergy in children. In addition, in HDM allergic children, a decrease of Th2 cells and an increase of IL-10 secreting T-cells was found in children treated with SLIT to HDM as well as an increase in Foxp3+ Treg in children treated with SCIT.

Les maladies allergiques sont de plus en plus fréquentent. Elles atteignent souvent l'enfant jeune chez qui l'allergie respiratoire et l'allergie alimentaire sont les principales pathologies. L'unique traitement curatif est l'immunothérapie spécifique d'antigène (ITA), largement développée dans l'allergie respiratoire et encore à ses débuts dans l'allergie alimentaire. Pour adapter au mieux la prise en charge du patient, le diagnostic précis de l'allergie est indispensable et il n'existe actuellement pas d'examen biologique totalement fiable. Seul, la présence d'IgE spécifiques permet de diagnostiquer une sensibilisation à un allergène mais pas une allergie cliniquement symptomatique. Dans une première partie, nous avons étudié l'intérêt d'un test fonctionnel, l'ELISpot (Enzyme-linked immunosorbent spot), dans le diagnostic de l'allergie aux acariens chez l'enfant asthmatique. Le nombre de lymphocytes T circulants spécifiques d'acariens sécréteur d'interleukine (IL)-4 ou d'IL-13 était associé à la présence d'une allergie symptomatique, indépendamment des IgE spécifiques. Il était plus élevé dans le cas d'une rhinite allergique sévère et plus faible dans le cas d'une rhinite allergique légère. De plus, il variait au cours de l'année en fonction des saisons avec un pic en automne et un pic en début de printemps. Dans une deuxième partie, nous avons étudié l'intérêt de l'ELISpot dans le diagnostic de l'allergie au lait de vache chez l'enfant, confirmée par un test de provocation orale en double aveugle. Nous avons décrit que le nombre de lymphocytes T spécifiques de la caséine et sécréteurs d'IL-4 et d'IL-13 était associé à l'allergie au lait de vache avec une sensibilité de 100%. Par ailleurs, le nombre de lymphocytes T spécifiques de la caséine était également associé à la dose maximale de lait tolérée par l'enfant.Enfin, dans une troisième partie, nous avons étudié la réponse lymphocytaire T au cours d'une ITA sub-linguale (SLIT) d'une part et sous-cutanée (SCIT) d'autre part, chez des enfants asthmatiques allergiques aux acariens suivis pendant une année. Nous avons décrit une diminution des lymphocytes Th2 (sécréteurs d'IL-4 et IL-13) spécifiques d'acariens après 12 mois de SLIT associée à une augmentation des cellules sécrétrices d'IL-10 (Tr1) spécifiques d'acariens après 6 mois de SLIT. De plus, les lymphocytes T régulateurs (CD4+CD25hiCD127loFoxp3+) étaient augmentés après 12 mois de SCIT. Nous n'avons pas retrouvé de production accrue d'interféron γ (IFNγ) par les lymphocytes T spécifiques d'acariens au cours de la désensibilisation.Au total, ce travail nous a permis de décrire qu'un test fonctionnel, l'ELISpot, permet de réaliser un diagnostic fiable de l'allergie aux acariens et de l'allergie au lait de vache chez l'enfant. Par ailleurs, l'ITA induit une diminution des cellules Th2 et une augmentation des cellules Tr1 par voie sub-linguale ainsi qu'une augmentation des Treg Foxp3+ par voie sous-cutanée sans immunodéviation Th2/Th1, chez l'enfant allergique aux acariens.

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