Th.--Sci. nat.--Lille 1, 1977. N°: 374.

La tuberculose humaine, causée par Mycobacterium tuberculosis, est responsable de plus d'un million de décès par an et on estime qu'un tiers de la population mondiale est infecté de façon latente. Lors de leur arrivée dans les poumons, les mycobactéries sont détectées par les cellules du système immunitaire inné grâce à de nombreux récepteurs, tels que les lectines de type C. Le but de mes travaux était de caractériser les bases moléculaires et les conséquences fonctionnelles des interactions entre les mycobactéries et trois lectines de type C : Mincle, Dectine-1 et Dectine-2. Nous avons ainsi défini les relations structure/fonction de la reconnaissance des ligands de nature glycolipidique par Mincle et Dectine-2 et synthétisé des ligands de structure minimale de Mincle qui pourraient avoir de potentielles applications comme adjuvants de vaccination. Enfin, nous avons identifié Dectine-1 comme une possible voie d'entrée silencieuse des mycobactéries dans les cellules phagocytaires. / Mycobacterium tuberculosis is the causative agent of human tuberculosis leading to more than 1 million deaths every year and infecting latently one third of the population worldwide. Once in the lungs, mycobacteria are detected by innate immune cells through several pattern recognition receptors such as C-type lectins. The aim of my thesis was to characterize the molecular bases and the functional consequences mycobacteria recognition by three C-type lectins: Mincle, Dectin-1 and Dectin-2. We have characterized the structure/function relationships of the glycolipid ligands recognition by Mincle and Dectin-2 and synthesized ligands of Mincle with a minimal structure that could be used as vaccine adjuvants inducing Th1 and Th17 responses. We also identified Dectin-1 as a possible silent entry gate for mycobacteria into phagocytic cells allowing binding to immune cells without triggering intracellular signaling.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2011-2012 / L'arthrite rhumatoïde (AR) est une maladie incurable affectant 1% de la population mondiale et ayant comme origine une auto-immunité systémique. Les mécanismes moléculaires derrière la pathogenèse de l'AR sont mal définis, mais il s'avère que plusieurs facteurs environnementaux et génétiques sont impliqués. Basé sur des évidences récentes que la lectine myéloïde inhibitrice MICL puisse être impliqué dans la pathogenèse de l'AR, nous avons réalisé une étude génétique suggérant que le gène codant pour MICL pourrait être associé avec l'AR. De plus, des analyses d'expression au niveau protéique de MICL ont permis d'observer son expression dans le synovium et dans le liquide synovial d'articulations atteintes d'AR. Finalement, nos résultats suggèrent que MICL se situe dans le même complexe protéique que la vimentine. Cette étude a le potentiel de mener à une meilleure compréhension de la pathogenèse de l'AR et au développement d'un nouveau biomarqueur pronostique ou thérapeutique pour la maladie.

Différentes approches d'amarrage moléculaire sur des systèmes lectines calcium dépendantes – glucides ont été comparées, afin de reproduire les données expérimentales. En utilisant la méthode d'amarrage la plus appropriée, le site de liaison de la lectine humaine Langerine a été étudié, en rationalisant le mécanisme de reconnaissance de l'épitope du virus VIH. Les caractéristiques de la lectine Pseudomonas aeruginosa I ont été également étudiées par des calculs d'amarrage moléculaire, de dynamique moléculaire et d'énergie libre. Une analyse conformationnelle des facteurs Nod, signaux bactériens nécessaires à l'induction de la symbiose, a révélé des états conformationnels spécifiques en accord avec les résultats obtenus par RMN. Les modèles par homologie du domaine LysM2 et du domaine catalytique de la kinase LYK3, récepteurs hypothétiques des facteurs Nod exprimés sur les cellules racinaires de Medicago truncatula, ont été construits et utilisés comme support des données biologiques.

Les glycosyltransférases et les lectines sont deux familles de protéines impliquées respectivement dans la biosynthèse et la reconnaissance spécifique des glucides. Une partie de ces travaux a été consacrée à la mise à jour de la base de données des structures cristallographiques de glycosyltransférases. La modélisation par homologie de certaines glycosyltransférases d'intérêt biologique dont les structures cristallographiques n'ont pas encore été résolues a été effectuée. Des simulations de dynamique moléculaire de la glycosyltransférase LgtC, qui participe à la biosynthèse des lipooligosaccharides (LOS) chez la bactérie Neisseria meningitidis, ont permis de suggérer un mécanisme de réaction.<br />La lectine PA-IIL de Pseudomonas aeruginosa présente une affinité inhabituellement forte pour le fucose. Les calculs quantiques sur un modèle incluant le site de liaison de la lectine en complexe avec le fucose ont montré que la l'interaction forte entre la protéine et le ligand pourrait partiellement être causée par une délocalisation importante des charges électrostatiques.

Les lectines spécifiques du rhamnose ont été découvertes comme nouvelle classe de lectines dans les années 1990. La plupart de ces lectines a été isolée à partir d'animaux aquatiques. Des récepteurs spécifiques du rhamnose sur les kératinocytes ont été découverts en 1991 quand les reconnaissances entre des glycoprotéines synthétiques incorporées dans des liposomes et des kératinocytes ont été étudiées. Nous avons synthétisé des nouveaux dérivés de rhamnose à cibler ces lectines. / Rhamnose binding lectines were discovered as new class of lectines in 1990's. Most of these lectines has been isolated from aquatic animals. It was discovered in 1991 that rhamnose specific receptors may be present in human skin while studying the interaction between liposomes incorating synthesitic glycoproteins and keratinocytes. We have synthesized new derivatives of rhamnose to target these lectines.

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 provoque une infection définitive de l’organisme. Il entraine une déroute du système immunitaire depuis la primo-infection occasionnant ainsi, une déplétion massive des lymphocytes T CD4 (LTCD4). Le DCIR (Dendritic Cell Immuno Receptor) qui constitue le socle de notre travail, est une lectine de type C. Il est exprimé sur les cellules myéloïdes comme les cellules dendritiques mais aussi sur les cellules B, les LTCD4 infectés par le VIH-1 et apoptotiques ainsi que sur les LTCD4 polarisés en Th17. Il constitue un facteur d’attachement et d’internalisation du virus dans la cellule dendritique. Il permet son transfert aux LTCD4 dans les organes lymphoïdes secondaires, jouant ainsi un rôle dans la pathogenèse associée au VIH-1. En plus, le DCIR assure la régulation négative de la réponse cellulaire, favorisant ainsi la propagation et la réplication du virus au détriment de la réponse immunitaire contre le VIH-1. Le rôle que joue le DCIR est dépendant du sentier de signalisation induit à la suite de la phosphorylation des résidus tyrosine de son motif ITIM. Le blocage de DCIR par des inhibiteurs spécifiques pourrait empêcher cette phosphorylation et réduire l’attachement, l’internalisation et le transfert du virus. Nous avons montré que la stimulation des cellules dendritiques et des LTCD4 polarisés en Th17 avec un anticorps anti-DCIR générait un patron de phosphorylation des résidus tyrosine des protéines. De plus, les inhibiteurs de la portion extracellulaire du DCIR inhibent cette activation. Afin de développer une mesure plus directe de l’interaction de DCIR avec ces inhibiteurs, nous avons purifié le DCIR à partir des cellules Raji-CD4-DCIR. En conclusion, ce projet de maitrise montre que l’activation directe de DCIR peut être renversée par des inhibiteurs montrant ainsi leurs spécificités. De plus, le profil d’activation de DCIR est spécifique pour chaque type cellulaire. A long terme, l’inactivation de DCIR par des inhibiteurs efficaces pourrait être une stratégie thérapeutique capable d’inhiber l’infection et de préserver une réponse immunitaire efficace.

L'arthrite est une des principales causes d'invalidité et d'utilisation des soins de santé au Canada. Environ 16 % des Canadiens âgés de 15 ans et plus souffrent d'arthrite et l'incidence devrait atteindre 20 % de la population d'ici 2031. Les médicaments utilisés pour traiter l'arthrite ciblent les médiateurs pro-inflammatoires. Malheureusement, tous les patients ne répondent pas bien à ces médicaments et beaucoup souffrent d'effets secondaires indésirables. L'inflammation étant régulée par un équilibre délicat entre les voies d'inhibition et d'activation des cellules immunitaires, une stratégie thérapeutique alternative consiste à cibler les molécules et les voies de signalisation anti-inflammatoires. Les récepteurs inhibiteurs sont ainsi devenus un sujet d'étude important étant donné leur potentiel thérapeutique. Toutefois, leur fonctionnement et leur rôle dans les maladies inflammatoires demeurent peu connus, nécessitant ainsi leur étude. C'est dans ce but scientifique que cette thèse s'est déroulée. Mes travaux se sont basés sur l'identification du récepteur inhibiteur CLEC12A appartenant à la famille des lectines, dont notre laboratoire a montré qu'il était impliqué dans la pathogenèse de la goutte. Le récepteur CLEC12A est un récepteur inhibiteur exprimé chez les cellules d'origine myéloïde, dont les ligands naturels et la voie de signalisation restent à identifier. Toutefois, CLEC12A possède un motif ITIM ("Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibitory Motif") caractéristique des récepteurs inhibiteurs. Les motifs ITIM recrutent des phosphatases qui, à leur tour, inhibent les voies de signalisation activatrices des cellules immunitaires et permettent ainsi de moduler leurs fonctions. Cette capacité de modulation négative de l'activation des cellules myéloïdes du récepteur CLEC12A a été observée dans plusieurs études faisant de lui un candidat pertinent à étudier. CLEC12A apparaît notamment comme un facteur commun dans le syndrome de Behçet's, l'arthrite rhumatoïde et la goutte qui sont caractérisés par des épisodes inflammatoires aigus impliquant le neutrophile. Les études montrent que la diminution ou l'altération du récepteur CLEC12A est associée avec une inflammation exacerbée dans ces pathologies. De plus, en absence de CLEC12A, le neutrophile arbore une réponse accrue à des stimuli pro-inflammatoires. De ce fait, le laboratoire a étudié le rôle du récepteur CLEC12A dans la pathologie de la goutte dont l'agent étiologique connu, les cristaux d'urate monosodique (UMS) provoquent une inflammation exacerbée caractérisée par la suractivation des neutrophiles. Les cristaux d'UMS diminuent l'expression de CLEC12A à la surface des neutrophiles ce qui aboutit à une réponse inflammatoire accrue. De plus, nous savons que l'une des molécules (la colchicine) utilisées pour traiter les patients souffrant de la goutte prévient la diminution de l'expression de CLEC12A à la surface des neutrophiles par les cristaux d'UMS. Or, chez le neutrophile, notre laboratoire a démontré qu'en réponse aux cristaux d'UMS CLEC12A régule négativement l'influx de calcium intracellulaire, la phosphorylation des protéines intracellulaires ainsi que la production d'IL-8. Ceci a mené à notre hypothèse que CLEC12A modulerait la réponse des neutrophiles en ciblant les différentes voies de signalisation intracellulaires activées par les cristaux d'UMS. Ainsi, notre premier objectif était de mieux identifier les voies de signalisation modulées par CLEC12A chez le neutrophile en réponse aux cristaux d'UMS. Cependant, le manque de connaissance sur la signalisation du récepteur CLEC12A limitait notre approche afin de comprendre son rôle et les mécanismes altérant son expression dans la pathogenèse de la goutte. Ainsi, notre deuxième objectif était de caractériser les mécanismes moléculaires impliqués dans la signalisation de CLEC12A. Dans la pathologie de la goutte, nos travaux ont identifié l'axe de signalisation p38-MAPK-PI3K Akt dans la production de l'IL-8 par les neutrophiles en réponse aux cristaux d'UMS. Nous avons démontré la rapide phosphorylation du récepteur CLEC12A par une kinase Src dans les domaines membranaires résistants aux détergents (DRM) enrichies en flotilline-1 en réponse aux cristaux d'UMS, ce qui révèle qu'avant d'être dégradé par les cristaux, le récepteur module l'activation des neutrophiles par l'axe de signalisation p38-MAPK-PI3K-Akt. Afin de pouvoir comprendre les mécanismes dérégulant l'expression de CLEC12A dans la goutte, nos travaux ont identifié des mécanismes de signalisation du récepteur qui étaient encore méconnus. Nos résultats rapportent les premières évidences des mécanismes de signalisation du récepteur CLEC12A. Nous démontrons le rôle des cystéines 118 et 130 de la tige extracellulaire de CLEC12A dans son oligomérisation, expression, et signalisation selon un mécanisme de modification post-traductionnel des cystéines.

Les lectines de type-C (CLR) sont des protéines de liaison au glycane qui reconnaissent les sucres de manière dépendante du Ca2+. Ils ont des rôles divers dans l'organisme humain. Ils sont responsables des interactions et de l'internalisation d'agents pathogènes tels que Candida albicans, Mycobacterium tuberculosis, le VIH ou le virus Ebola. Ils sont également impliqués dans le développement ou la prévention du cancer par la reconnaissance de glycanes spécifiques exprimés à la surface des cellules tumorales.L'importance cruciale est de trouver des ligands pour les CLR qui induiront une réponse immunitaire ou des inhibiteurs pour les lectines impliquées dans la promotion des infections dans l'organisme. L'objectif du réseau IMMUNOSHAPE était d'examiner de près les rôles, les spécificités et les différences entre les CLR et d'essayer de trouver des molécules appropriées pour stimuler la réponse immunitaire. Au cours de cette thèse, les néoglycoprotéines (NGP) contenant des glycodendrons de différentes valences ont été synthétisées. Pour la synthèse ont été utilisés BSA et OVA comme porteurs de protéines sur lesquels sont couplés des composés monovalents et des dendrons avec αMan et Manα1-2Man de trois et neuf valences. Tous les NGP ont été synthétisés par la chimie click avec deux équivalents de glycodendron / BSA. De plus, des NGP avec des glycomimétiques sur la base de fucose et de Manα1-2Man ont été préparés.L'affinité des molécules synthétisées a été analysée avec GLYcoPROFILE, la plateforme technologique développée par GLYcoDiag dans le but de mieux étudier les interactions glycobiologiques. Il a été évalué que tous les composés testés présentaient un effet multivalent fort sur quatre lectines spécifiques du mannose, y compris deux CLR : DC-SIGN et Langerin. La néoglycoprotéine avec 11 dendrons Manaαl-2 Man nonavalés a obtenu la meilleure avidité pour toutes les lectines testées. Les IC50 obtenues pour la Langerine et le DC-SIGN sont respectivement de l’ordre du nanomolaire et picomolaire, c’est une des valeurs les plus faibles obtenues pour ces deux lectines.L'étude des interactions glycobiologiques a été élargie par l'analyse des différences entre les glycanes avec les liaisons O, C et S et leurs interactions avec les lectines. Il a été observé que les C-glycanes n'ont pas le même mode de liaison que les O-glycanes et, par la suite, ne présentent pas le même effet multivalent attendu, que les O-glycanes. Dans le contexte des glycosides, nous montrons que l’O-glucoside présente de meilleures interactions avec les lectines purifiées que le S-glucoside, tandis que le S-galactoside offre une inhibition significativement meilleure entre les kératinocytes humains normaux et les néoglycoprotéines correspondantes. En outre, une étude intéressante a porté sur les interactions entre les thio-sialosides et la sialidase NanA. Cette analyse a montré que la multivalence a un effet important non seulement sur la lectine, mais également sur la liaison de l’enzyme. Les NGP synthétiques thio-sialylés ont mis en évidence un inhibiteur multivalent efficace de l'enzyme NanA.Au final, cette thèse présente des résultats intéressants sur l'influence significative des composés multivalents sur les interactions glycobiologiques entre les glycanes et les lectines ainsi que sur les enzymes. Cette connaissance pourrait être utilisée dans la conception future des vaccins et de leurs adjuvants pour le traitement des infections,du cancer et, en général, pour la formation de la réponse immunitaire. / C-type lectins (CLRs) are glycan binding proteins which recognize sugars in Ca2+ dependent manner. They have diverse roles in human organism. They are responsible for interactions and internalization of pathogens like Candida albicans, Mycobacterium tuberculosis, HIV or Ebola virus. They are also involved in development or prevention of cancer through recognition of specific glycans expressed on surface of tumor cells.The crucial importance is to find ligands for CLRs which will induce immune response or inhibitors for lectins which are involved in promotion of infections in organism. The goal of IMMUNOSHAPE network was to closely examine roles, specificities and differences between CLRs and try to find appropriate molecules for driving immune response. During this thesis, neoglycoproteins (NGPs) containing glycodendrons with different valences were synthetized. For synthesis were used BSA and OVA as protein carriers on which are coupled monovalent compounds and dendrons with αMan and Manα1-2Man in three and nine valences. All NGPs were synthetized with click chemistry with two ratios of glycodendron/BSA. Additionally, NGPs with glycomimetics on the basis of fucose and Manα1-2Man were prepared.The affinity of synthetized molecules was analyzed with GLYcoPROFILE, technology platform developed in GLYcoDiag with the aim of better and more precise investigation of glycobiological interactions. It was evaluated that all tested compounds showed strong multivalent effect on four mannose specific lectins, including two CLRs: DC-SIGN and Langerin. Neoglycoprotein with 11 nonavalent Manα1-2Man dendrons achieved the best avidity for all tested lectins. Obtained IC50 for Langerin and DC-SIGN are of nanomolar and picomolar range respectively, which are one of the lowest values obtained for these two lectins.Studying glycobiological interactions was expanded by analysis of differences between glycans with O-, C- and S-linkage and their interactions with lectins. It was observed that C-glycans does not have the same mode of binding like O-glycans and subsequently, do not show the same expected multivalent effect such as O-glycans. In the context of glycosides, we show that even O-glucoside achieved slithly better interactions with purified lectins in comparison with S-glucoside, S-galactoside provide significantly better inhibition between normal human keratinocytes and corresponding neoglycoproteins in comparison with O-galactoside. Furthermore, interesting study was investigation of interactions between thio-sialosides and sialidase NanA. This analysis showed that multivalency has a strong effect not only on lectin, but also on enzyme binding. Synthetized thio-sialylated NGPs showed as efficient, multivalent inhibitor of NanA enzyme.Altogether, this thesis presents interesting results of significant influence of multivalent compounds on glycobiological interactions between glycans and lectins as well as enzymes. This knowledge could be used in future design of vaccines and their adjuvants for infection and cancer treatment and in general, for shaping immune response.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.