Les composés polyaromatiques polysoufrés représentent une classe de molécules peu étudiées, malgré leurs propriétés intéressantes. La présence du soufre influence les propriétés redox, photophysiques et de complexation. Nous avons préparé une série de ces composés par des réactions de substitution nucléophile aromatique. Ceux-ci peuvent être fonctionnalisés par des unités polyaromatiques, tels que l’anthracène ou le pyrène, ou par des glycosides. Leurs propriétés de luminescence ont été étudiées en particulier sous l’angle de l’émission induite par l’agrégation, où les composés deviennent émissifs lorsqu’ils sont immobilisés en phase solide ou fortement refroidis. Ils permettent également de stabiliser des nanoparticules de fer/platine, où une forte densité d’atomes de soufre divalent joue un rôle important en nanosciences. Les dérivés glycosylés ont été testés chez différentes lectines comme ConA, PAIL, PAIIL et Bc2lA, les trois dernières étant impliquées dans les infections bactériennes chez les patients atteints de mucoviscidose. Les études comprennent les propriétés photophysiques, de réticulation et des mesures d’affinité par des méthodes biophysiques (SPR, ITC et HIA). Ceci a ammené à la production de nouveaux biocapteurs ou sondes luminescentes basés sur des interactions sélectives lectine-sucre dans l’éventualité future de dispositifs de diagnostics et de détection à partir d’expression de lectines (ex. cancer, infections bactériennes, etc.).Une autre classe de composés polyaromatiques a été étudiée, les hélicènes. Ces molécules hélicoïdales chirales sont retrouvées sous deux formes énantiomériques, selon le pas d’hélice. Nous présentons ici une nouvelle méthode de synthèse des hélicènes par une voie organométallique de réactions d’annulation et d’insertions C-H. Une étude poussée des conditions réactionnelles a été réalisée. Nous avons préparé des hélicènes fonctionnalisés. Les dérivés bromés et cyanés du [5]-hélicène ont été déposés sur la surface de Suzuki, afin d’étudier par nc-AFM les propriétés de structuration de ces produits sur une surface isolante. Le [5]-hélicène a aussi été fonctionnalisé par des unités mannosylés, dans les mêmes perspectives que pour les astérisques soufrés glycosylés. Ces hélicènes glycosylés sont les premiers de la sorte décrit dans la littérature. Ils ont présenté des propriétés convenables vers des sondes luminescentes chirales et d’autres biocapteurs, qui sont basés sur les interactions lectine-sucre. / Polysulfurated polyaromatic compounds represent a class of molecules that are not extensively studied, despite their interesting properties. The presence of sulfur affects their redox, photophysical and complexation properties. We prepared a series of these compounds by using some aromatic nucleophilic substitutions. They can be further functionalized by some polyaromatic units, such as anthracene or pyrene, or by some glycosides.Their luminescence properties have been especially studied for their agregation induced emission properties, where the emission of the compounds is turned on when they are immobilized in solid phase or strongly cooled. These compounds can also be used to stabilize iron/platinum nanoparticles, where a high density of divalent sulfur atoms play an important role in nanosciences. Glycosylated derivatives have been tested with different lectins like ConA, PAIL, PAIIL and Bc2lA, the last three being involved in bacterial infections found in patient suffering from cystic fibrosis. Studies include photophysical and reticulation properties, and also affinitiy assays by using biophysical methods (SPR, ITC, and HIA). It provided some novel biosensors or luminescent sensors based on some selective lectin-carbohydrate interactions, in the event of future diagnostic devices and biological detection originating from lectins expressions (ex. cancer, bacterial infection, etc.).Another class of polyaromatic compounds has been studied, the helicenes,. Those chiral helical molecules can be found under two enantiomeric forms, according to the sense of the helical pitch.We herein present a new synthetic method of helicenes based on an organometallic route for some annulation reactions and C-H insertions. An exhaustive study of reaction conditions has been performed. We have prepared some functionnalized helicenes. Brominated and cyanated [5]-helicene derivatives have been deposited on a Suzuki surface, in order to study their structuration properties by nc-AFM on a non conductive surface. [5]-helicene was further functionnalized with some mannosylated units, with the same perspectives as for the glycosylated sulfurated asterisks. Those glycosylated helicenes are the first of their kind described in the literature. They provided some adequate properties toward new chiral and luminescent sensors, as well as other biosensors, which are based on lectin-carbohydrate interactions.

L'incidence des maladies hépatiques est en augmentation, ce qui rend urgente la recherche de systèmes de vectorisation d'agents thérapeutiques vers le foie. La maladie sur laquelle porte notre étude est la maladie orpheline de Wilson. Elle induit une accumulation de cuivre (Cu) principalement dans les hépatocytes et les chélateurs de Cu systémiques utilisés à ce jour pour la traiter présentent de nombreux effets secondaires. C'est dans ce contexte que nous proposons une stratégie innovante qui consiste à piéger sélectivement le cuivre en excès dans les cellules hépatiques. Des chélateurs sélectifs du Cu(I), degré d'oxydation du Cu disponible intracellulaire, ont été conçus. Afin de cibler ces derniers vers les cellules hépatiques, nous avons focalisé notre intérêt sur le récepteur aux asialoglycoprotéines (ASGP-R), une lectine abondamment et presque exclusivement exprimée à la membrane des hépatocytes.Deux familles de glycoconjugués contenant une unité de ciblage associée à une unité de vectorisation des hépatocytes ont été développées : l'une possède une plateforme cyclodécapeptidique et l'autre une plateforme pseudopeptidique d'architecture tripodale. Les unités de ciblage sont composées de N-acétylgalactosamines présentés de manière multivalente, permettant une reconnaissance et une endocytose sélective des glycoconjugués dans les hépatocytes par l'intermédiaire de la lectine ASGP R. Les deux familles de composés ont montré leur capacité à entrer dans les cellules hépatiques et à faire diminuer le taux de Cu intracellulaire disponible.L'objectif de ce travail de thèse est l'étude et l'optimisation du système de ciblage. Les efficacités d'internalisation des deux familles de glycoconjugués dans les hépatocytes sont pour cela comparée. En outre, l'influence de la structure moléculaire des glycoconjugués sur l'efficacité de ciblage est étudiée. Plusieurs glycoconjugués appartenant à chacune des deux familles de composés ont donc été synthétisés, et leur propriétés d'internalisation dans les hépatocytes humains analysée par cytométrie en flux. / Regarding the increasing incidence of liver diseases in the past decades, the discovery of drug delivery systems is becoming a major research area. In particular, the Wilson disease is a liver dysfunction, which needs more specific treatments than those available nowadays. This genetic disorder induces a toxic copper overload in the hepatocytes. Because current copper chelating therapies present many side effects due to their lack of specificity, we propose an innovative strategy that would selectively detoxify copper in liver cells. Since excess intracellular Cu is in the +I oxidation state, we figured that a chelator that would enter the hepatocytes and be specific for Cu(I) could represent an efficient strategy. To selectively target the hepatic cells, we focus our interest on a lectin, which is highly and exclusively expressed in the membrane of the hepatocytes: the asialoglycoprotein receptor (ASGP-R).Two different kinds of glycoconjugates that contain a Cu(I) chelating unit associated to liver targeting systems have been obtained : one has a cyclodecapeptide scaffold and the other a tripodal pseudopeptide core. The targeting units are composed of N-acetylgalactosamine (GalNAc) residues multivalently presented, allowing the selective recognition and endocytosis of the glyconconjugates thanks to ASGP-R. These two families of molecules were demonstrated to enter hepatocytes and to chelate intracellular copper.The aim of the present work is to study and optimise the targeting system. We have compared the efficiency of the targeting systems of the two families of molecules. Moreover the influence of several structural parameters on the internalisation efficiency was determined. Several compounds belonging to cyclodecapeptide and tripode families have been synthesised, and their ability to enter in human hepatocytes has been analysed by flow cytometry.

L'objectif de cette thèse a été de contribuer à la compréhension des stratégies d'infection du pathogène opportuniste Aspergillus fumigatus. Ce pathogène est une cause émergente de morbidité et de mortalité chez les patients dont l'immunité est compromise et dans les milieux hospitaliers. Une infection avec Aspergillus est en général appelée une Aspergillose et ellepeut se développer dans un certain nombre d'organes, le plus fréquemment dansl'appareil respiratoire (poumons et sinus). Outre les infections (Aspergillosis invasive), la colonisation par ce champignon peut causer des réactions allergiques (Aspergilloses broncho pulmonaire allergique) et de l'asthme. Le nombre de patients immunodéprimés augmente régulièrement à cause des avancées des traitements du SIDA, du cancer, de la mucoviscidose ainsi que par le nombre grandissant de transplantation d'organes. De nouveaux médicaments antifongiques et des médicaments préventifs sont nécessaires pour venir en soutienaux soins médicaux des patients. Bien que plusieurs fongicides existent déjà sur le marché, l'Aspergillosisinvasive reste souvent fatale. Ceci est lié d'une part à la difficulté d'établir le diagnostic, et d'autre part au fait que des résistances émergent rapidement. La motivation de cette thèse est de comprendre les mécanismes impliqués dans le premier contact entre les conidies et le tissu de l'hôte. Ces mécanismes d'adhésion initiaux sont souvent réalisés par des liaisons entre les lectines et les carbohydrates. Le tissu épithélial et la surface muqueuse du système respiratoire sont couverts de structures possédants des carbohydratestels que les glycoprotéines, les glycolipides et les glycosaminoglycanes. L'identification des lectines d'A. fumigatus et leurs caractérisations devraient dorénavant contribuer à la compréhension de la glycostratégie de ce pathogène opportuniste ainsi que des mécanismes impliqués dans l'adhésion et l'infection. L'analyse détaillée de la structure des lectines permettra d'établir le rôle de cesprotéinesdans la virulence et de guider la conception de glycomimétiques, afin d'inhiber le phénomène d'adhésion. Cettenouvelle approche consistant à bloquer l'adhésion de l'agent pathogène plutôt que sa prolifération, vise à diminuer les résistances par une réduction de la pression évolutive. Deuxstratégies différentes ont été utilisées pouridentifier de nouvelleslectines. Tout d'abord une purification des lectinesà partir d'extraits fongiques brutsa été tentée et d'autre part un criblage pour trouver des séquences similaires avec les protéines codées par A. fumigatusa été réalisé parmi une banque de lectines fongiques connues. / The aim of this thesis was to contribute to the understanding of infection strategies of the opportunistic pathogen Aspergillusfumigatus. This pathogenic mould is an emerging cause of morbidity and mortality in immuno-compromised patients and hospital environments. An infection with Aspergillus is generally referred to as Aspergillosis; it can develop in a variety of organs but the most common sites are the respiratory apparatus i.e. lungs and sinuses. Besides infections (invasive aspergillosis), colonization with the fungus can cause allergic reactions (allergic broncho pulmonary aspergillosis) and asthma. The number of immuno-suppressed patients is steadily increasing due to advancement in the HIV, cancer and cystic fibrosis medical care, as well as an increasing number of organ transplantations. Needless to say that new antifungal drugs and preventive medication is desperately needed to support medical care for those patients. Even though several fungicides already exist on the market, invasive aspergillosis remains to be often fatal. On one hand, this is due to difficulties in diagnosis and on the other hand, resistances are emerging rapidly. The motivation behind this thesis is to understand the underlying mechanisms that are involved in the first contact between conidial spores and host tissues. Initial adhesion steps often involve carbohydrate binding proteins, called lectins. They recognize glycoconjugates such as glycoproteins, glycolipids and glycosaminoglycans which cover the epithelial tissue and mucosal surface of the respiratory tract.. Identification and characterization of the lectins from A. fumigatus will therefore contribute to the understanding of the glycostrategy of this opportunistic pathogen and of the mechanisms involved in adhesion and infection. Detailed structural analysis of the carbohydrate-protein interactions will allow ascertaining the lectins role in virulence and guide the design of glycomimetics, as adhesion inhibitors. With this novel approach of targeting the pathogen adhesion rather than its proliferation, resistances are believed to be less frequent due to the lack of evolutionary pressure. In this work, two different strategies were employed to obtain novel lectins. Firstly, lectins were purified from crude fungal extracts and secondly the A. fumigatus genome was screened for encoded proteins showing sequence similarity with known fungal lectins. While lectin purification from the crude extracts was inconclusive due to low lectin activity in the starting material, genome screening showed that several putative lectins were present. One of these lectins, named AFL6, belonged to the cyanovirin-N homolog (CVNH) family and it was recombinantly expressed and purified. Glycan array and micro calorimetry techniques were carried out to investigate its carbohydrate binding specificityand the three dimensional structure was determined using X-ray crystallography. The structure showed an overall similarity with other CVNHs with slight differences in the presumed carbohydrate binding sites. Unlike other family members, it shows a low affinity for mannosides and an apparent affinity for lactosamine containing glycan structures.

L'interaction des glycosphingolipides de la membrane plasmique avec les protéines de liaison aux glucides (lectines) est d'une importance vitale pour l'infection de la cellule hôte par divers virus et bactéries. Dans ce travail, nous avons exploré l’interaction des lectines LecA de la bactérie P. aeruginosa et de la sous-unité B de la toxine Shiga (StxB) de S. dysenteriae avec son récepteur à membrane plasmatique, le globotriaosylcéramide (Gb3). De plus, nous avons étudié l'interaction de la bactérie complète P. aeruginosa avec Gb3. Afin de déchiffrer l'interaction lectine-Gb3 en l'absence d'autres composants cellulaires, nous avons utilisé les systèmes de membrane artificielle - vésicules unilamellaires géantes (GUV) et bicouches lipidiques supportées (SLB). Nous avons observé la liaison de la lectine en utilisant différents modes de microscopie à fluorescence (confocal, TIRF, etc.). Nous examinons la liaison des deux lectines aux domaines membranaires de différents ordres et compositions. Nous avons constaté que StxB préfère des domaines membranaires plus ordonnés alors que LecA est moins préférentiel. De plus, les deux lectines induisent la réorganisation des domaines membranaires: StxB stabilise les domaines ordonnés, les réduit et induit la formation des nouveaux domaines ordonnés. D'autre part, LecA ainsi que la bactérie P. aeruginosa induisent la dissolution des domaines ordonnés. Nous pensons que ces processus de réorganisation membranaire sont cruciaux pour l’infection bactérienne. / The interaction of plasma membrane glycosphingolipids with the carbohydrate binding proteins (lectins) is of vital importance for the infection of the host cell by various viruses and bacteria. In this work, we explored the interaction of the lectins LecA from the bacterium P. aeruginosa and B subunit of Shiga toxin (StxB) from S. dysenteriae with its plasma membrane receptor globotriaosylceramide (Gb3). Moreover, we studied the interaction of the complete bacterium P. aeruginosa with Gb3. In order to decipher the lectin-Gb3 interaction in absence of other cellular components we employed the artificial membrane systems – Giant unilamellar vesicles (GUVs) and Supported lipid bilayers (SLBs). We observed the lectin binding using different modes of fluorescence microscopy (confocal, TIRF, etc…). We examine the binding of both lectins to the membrane domains of different ordere and composition. We found that StxB prefers more ordered membrane domains whereas LecA is less preferential. Moreover, both lectins induce the reorganization of the membrane domains: StxB stabilizes ordered domains, shrinks them and induces the formation of the novel ordered domains. On the other hand LecA, as well as the bacterium P. aeruginosa induce the dissolution of the ordered domains. We believe, these membrane reorganization processes are crucial for the bacterial infection.

Les lectines de type C (CLRs) sont des récepteurs impliqués dans la reconnaissance d’oligosaccharides et principalement exprimés à la surface des cellules présentatrices d’antigène (APCs) et notamment des cellules dendritiques (DCs), véritable sentinelle de notre système immunitaire. Elles sont impliquées dans la reconnaissance de motifs spécifiques exprimés à la surface d’agents pathogènes et sont capables de stimuler le système immunitaire afin de déclencher une réponse adaptée. Ce rôle crucial joué par les CLRs dans l’équilibre de la réponse immunitaire confère aux interactions CLR/glycane des perspectives d’applications pharmaceutiques. L’objectif à long-terme du projet de recherche dans lequel cette thèse s’intègre consiste à utiliser ces CLRs pour modeler les réponses du système immunitaire. A cette fin, des néoglycoconjugués spécifiques de chaque CLR doivent être développés. Au cours de cette thèse, 9 CLRs ont été produits BDCA2, DC-SIGN, DC-SIGNR, dectin-1, dectin-2, langerin, LSECtin, MCL and Mincle. Différentes stratégies de production ont été testées en parallèle, incluant des techniques d’adressage au périplasme en vue d’obtenir des protéines solubles et fonctionnelles et de l’expression cytoplasmique, sous forme de corps d’inclusion suivie d’étapes de renaturation qui s’est révélé la plus efficace au final. Une stratégie permettant de construire des tétramères artificiels de CLRs, appelés TETRALEC, a été mise au point. Cet outil permettant le criblage et la caractérisation des lectines a été obtenu avec DC-SIGNR par un marquage spécifique de la lectine. Le complexe TETRALEC a été caractérisé au niveau structural et des tests fonctionnels ont été menés sur des puces à glycanes et des cellules pathogènes. La série de CLRs que nous avons produites a été utilisée pour cribler des puces à glycanes et à glycomimétiques. Ces études nous ont permis de mettre en évidence des interactions dépendantes de l’environnement du glycane et d’identifier de nouveaux glycanes ou glycomimétiques spécifiques de certains CLRs. En effet, de manière étonnante, plusieurs des CLRs testés sont capables, pour un glycane donné, de discriminer des isomères de position ouvrant ainsi de nouveaux questionnements sur la signification biologique de cette sélectivité. De plus des glycomimétiques reconnaissant préférentiellement dectin-2 par rapport à DC-SIGN, DCSIGNR et langerin ont été identifiés. Le choix des glycomimétiques et l’évaluation des étapes de leur optimisation ont été permis par diverses études biophysiques qui ont quantifié la force et la spécificité des interactions. Ceci a permis le développement d’un ligand optimisé sélectif de DC-SIGN. La co-cristallisation de la protéine avec ce ligand a révélé un intéressant mode de liaison qui amène également de nouvelles questions. Simultanément à l’optimisation de ligands monovalents, un premier pas a été réalisé vers la conception d’une molécule pour permettre une vaccination contre le cancer médiée par les CLRs. Les résultats de SPR ont identifié des candidats potentiellement intéressants et des tests biologiques préliminaires ont été réalisés. / C-type Lectin Receptors (CLRs) are carbohydrate-binding proteins mainly expressed on Antigen Presenting Cells (APCs), including dendritic Cells (DCs), the sentinel of the innate immune system. They recognize pathogens or damaged cells by interacting with glycan features and the encounter between the CLR and its ligand constitutes a necessary step for the activation of the adaptive immune system. This crucial role played by CLRs in the balance of immune responses offers to CLR-glycan interactions pharmaceutical applications. The long-term objective of the research project in which this PhD is included is to use these CLRs as modulators in order to tailor the immune system responses. To do so, neoglyco-conjugates selective to each individual CLR have to be developed.Nine different CLRs were produced in this work: BDCA2, DC-SIGN, DC-SIGNR, dectin-1, dectin-2, langerin, LSECtin, MCL and Mincle.Several approaches have been explored in parallel for CLR production, ranking from bacterial periplasmic targeting, aiming to express soluble and functional protein, to inclusion bodies production into the bacterial cytoplasm, with subsequent protein refolding. Our collection of CLRs were used to screen glycan and glycomimetic arrays, highlighting context-dependent binding and identifying natural ligands or glycomimetics selective to each CLRs. Thus, several CLRs were surprisingly able to differentiate between positional isomers of a given N-Glycan, which opens new questions regarding the biological significance. Moreover, glycomimetics with a selectivity towards dectin-2 over DC-SIGN, DC-SIGNR and langerin CLRs have been identified.To guide the choice of the glycomimetics and estimate their optimisation, diverse biophysical studies were performed to evaluate the strength and specificity of the interaction. This enabled the development of an ultimate ligand selective towards DC-SIGN. A co-crystallised structure of the protein with this ligand revealed an interesting binding mode that also opens new questions.Simultaneously to monovalent ligand optimization, a first step towards the design of a highly defined molecule for cancer vaccination by CLR targeting was made. SPR results revealed potential candidates to exploit and preliminary biological assays were performed. Finally, a strategy for tetrameric lectin engineering as been explored, termed TETRALEC. This tool for screening and lectin characterization, has been obtained with one the lectin of the study, DC-SIGNR, by a site-specific labelling of the lectin. The TETRALEC complex was structurally characterised and functional assays were performed on glycan array and pathogen cells.

Très tôt après l'entrée initiale du VIH-1 dans l'organisme, le système immunitaire est déjoué, permettant ainsi au virus de se répliquer activement. Cette replication engendre une depletion massive des lymphocytes T CD4⁺ ainsi qu'un dysfonctionnement des lymphocytes B. Nous savons que les premières cellules liant le VIH-1 sont les cellules dendritiques. De plus, ces cellules ont la capacité de migrer avec le virus jusqu'aux organes lymphoïdes secondaires où elles peuvent alors transmettre efficacement le VIH-1 aux lymphocytes T CD4⁺. Afin d'approfondir nos connaissances sur la pathogenèse associée au VIH-1, il est essentiel d'étudier intensivement les intervenants et plus particulièrement les cellules dendritiques et les récepteurs retrouvés à leur surface susceptibles de lier le VIH-1 lors de la primo-infection. La gpl20 du VTH-1 peut se lier au récepteur CD4 et corécepteurs afin de mener à une infection productive des cellules dendritiques. Toutefois, d'autres récepteurs, comme les récepteurs lectines de type C tels que le DC-SIGN sont connus pour leurs rôles dans l'infection en trans et donc le transfert efficace du vims des cellules dendritiques vers les lymphocytes T CD4⁺. Les cellules dendritiques myéloïdes, résidentes des muqueuses, expriment plusieurs lectines de type C dont le DCIR (dendritic cell ùnmunorecptor) qui a fait l'objet de mes études doctorales. Au cours de ces études, nous avons montré que le DCIR favorisait l'infection en trans et en cis des cellules dendritiques et que le domaine neck et le motif ITTM du DCIR étaient responsables de ces effets. De plus, nous avons mis en évidence pour la première fois que le DCIR était exprimé sur les lymphocytes T CD4⁺ en apoptose à la suite de l'infection par le VIH-1. L'expression du DCIR sur les cellules apoptotiques pourrait favoriser la dissémination et le transfert du VIH-1. Nous avons aussi montré l'importance de la signalisation engendrée par le domaine ITIM du DCIR dans l'infection par le VIH-1. L'ensemble de ces études ont permis de caractériser le rôle du DCIR dans la pathogénèse associé à l'infection par le VIH-1, en plus d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques très pertinentes pour contrer cette épidémie. Enfin, ces études montrent aussi l'importance d'étudier les autres récepteurs lectines de type C afin de bien comprendre le rôle de chacune dans l'infection par le VIH-1.

Le DCIR, une lectine de type C, a été identifié comme un facteur facilitant le transfert des virus des cellules dendritiques vers les lymphocytes TCD4 lors de l’infection au VIH-1. Cinq isoformes différentes du DCIR existent. L’expression de certaines isoformes peut être modulée de façon indépendante dans certaines pathologies. L’hypothèse qui a été posée est que les isoformes du DCIR sont modulées au cours de l’infection au VIH-1 et qu’il est possible de générer des cellules déficientes en DCIR par la technique de CRISPR/Cas9. Les objectifs étaient de développer une PCR quantitative spécifique pour chaque isoforme du DCIR, de quantifier l’expression des isoformes du DCIR dans des cellules immunitaires de patients infectés par le VIH-1, de déterminer s’il existe des corrélations entre le patron d’expression de chaque isoforme et les données cliniques des patients VIH-1 et, finalement, de développer un outil CRISPR/Cas9 permettant le knock-out du gène du DCIR dans des cellules souches hématopoïétiques. Les résultats montrent que l’expression des isoformes 1 à 4 n’est pas modulée par l’infection au VIH-1. Cependant, une corrélation existe entre le ratio CD4/CD8 des patients traités et l’expression de l’isoforme 1 du DCIR dans les cellules polynucléées. De plus, dans les cellules mononucléées sanguines périphériques, les isoformes 1 et 3 du DCIR sont les plus exprimées et, dans les cellules sanguines polynucléées, l’isoforme 1 du DCIR est la plus exprimée. Finalement, un outil CRISPR/Cas9, permettant d’inactiver le gène du DCIR dans des cellules souches hématopoïétiques par infection lentivirale, a été développé. Ces données permettront de mieux caractériser les rôles des isoformes du DCIR, contribuant ainsi au développement de stratégies thérapeutiques ciblant cette lectine. / The C type lectin DCIR was identified as viral transfer factor from dendritic cells to CD4 T cells during HIV-1 infection. There are five known isoforms of the DCIR protein. The expression of some of these isoforms can be modulated independently in some pathologies. The hypothesis of this project is that DCIR isoforms can be modulated during HIV-1 infection and that it is possible to generate DCIR deficient cells with CRISPR/Cas9 technology. Our objectives were: to develop a specific quantitative PCR for each isoforms of DCIR; to quantify the expression of DCIR isoforms in immune cells of HIV-1 infected patients; to determine if there are correlations between the expression pattern of each isoform and the patients’ clinical data and; to develop a CRISPR/Cas9 tool allowing the knock out of the DCIR gene in hematopoietic stem cells. The results show that the expression of DCIR isoforms 1 to 4 is not modulated by HIV-1 infection. However, a positive correlation exists between the CD4/CD8 T cell ratio of treated HIV-1 patients and the expression of DCIR isoform 1 in polymorphonuclear cells. Furthermore, the DCIR isoforms 1 and 3 are the most expressed isoforms in the patients’ peripheral blood mononuclear cells, while the DCIR isoform 1 is the most expressed isoform in the patients’ polymorphonuclear cells. Finally, our CRISPR/Cas9 tool, allowing the inactivation of the DCIR gene in hematopoietic stem cells by lentiviral infection, has been developed. These results will allow us to better characterize the roles of DCIR isoforms, contributing so to the development of therapeutic strategies targeting this lectin.

Depuis longtemps les réactifs isothiocyanates (ITCs) sont largement utilisés dans le domaine de la bioconjugaison. Ces électrophiles forts réagissent avec les cystéines et les lysines des protéines pour former une liaison stable. Cette réactivité click permet de réaliser des marquages sélectifs ainsi que des fonctionnalisations de protéines. Cependant, les ITCs ne sont pas faciles à synthétiser et à isoler et leur stabilité ne permet pas une conservation optimale.Le but de ce projet est de développer le système enzymatique myrosinase-glucosinolate (MG) comme outil de conjugaison capable de former un ITC in situ. Le tandem MG est un mécanisme de défense des plantes de l’ordre des Brassicales bien connu. Dans ce système biochimique, la myrosinase opère comme thioglucosidase, en hydrolysant les glucosinolates (GLs), pour générer des ITCs. L’avantage de ce tandem enzymatique est de produire les ITCs à partir de précurseurs solubles dans l’eau, non toxiques, sous conditions douces.Afin d’explorer cet outil enzymatique, deux types de GLs non naturels ont été conçus. En raison de l’importance de l’interaction lectine-mannose dans les mécanismes d’adhésion bactérienne, nous avons conçu une petite librairie de GLs intégrant un mannoside. De cette façon il est possible d’étudier des lectines bactérienne (FimH). Le second type de glucosinolate est caractérisé par une deuxième fonction chimique, permettant de réaliser des réactions orthogonales.Le système MG a été évalué dans plusieurs approches de bioconjugaison telles que le marquage sélectif d’une lectine, la synthèse de néoglycoprotéines et la fonctionnalisation de nanoparticules. / Since many decades, Isothiocyanate (ITCs) reagents are widely used in bioconjugation approaches to create a stable bond onto the lysin and cysteine residues of proteins and peptides. Thanks to this click reaction it is possible to achieve a selective ligation or a high functionalization of proteins. On the others hand, isothiocyanates are not easy to prepare, to isolate, to store and most of the time insoluble in water.The aim of this work is to explore the myrosinase-glucosinolate (MG) enzymatic tandem as a ligation system, in order to release ITCs in-situ. The MG tandem is a well-known mechanism of defense in plants of the order Brassicales. In this biochemical system, myrosinase acts as a thioglucosidase, hydrolyzing glucosinolates (GLs) to liberate transient species that spontaneously form ITCs. The advantage of this enzymatic tandem is to generate ITCs from a stable non-toxic GLs precursor, soluble in water, using mild conditions.In order to develop this enzymatic tool, two kind of unnatural GLs were synthetized. Due to the important role of the mannoside-lectins interaction in the bacterial adhesion mechanism, at first, we designed a small library of GL bearing mannosides, in order to target and study the bacterial lectin FimH. The second kind of GL possess a chemical function allowing to study orthogonal reactions. After, the ability of the myrosinase to hydrolyze those unnatural GLs was investigated, as well their chemical reactivity.Then, the performances of the MG system was studied in different approaches of bioconjugation, such as: the synthesis of neoglycoproteins (NGPs), the site selective labeling of a lectin and the functionalization of gold nanoparticles. The feasibility of these strategies confirmed that the MG system can be used as an enzymatic tool in some bioconjugation approaches.

La glycobiologie structurale est la branche de la biologie qui étudie la structure et les interactions de glucides, molécules jouant des rôles d'extrême importance dans tous les organismes. Dans la première partie de la thèse, nous nous sommes intéressés à la structure 3D de deux glycoconjugués, la tricolorine A et un O-glycanne de la protéine de Tamm-Horsfall, en utilisant les méthodes de cristallographie et de modélisation moléculaire. Le sujet développé dans la deuxième partie est centré sur l'interaction de glucides avec leurs récepteurs protéiques, les lectines. Les lectines sont une importante classe de protéines avec la capacité de “lire” l'information biologique qui est codifiée dans la structure 3D des sucres. La cristallographie macromoléculaire en combinaison avec des techniques de biophysique, telles que la microcalorimétrie de titration, ont été utilisées pour élucider les bases structurales et thermodynamiques de la reconnaissance lectine-sucre. Deux lectines, produites par les bactéries pathogènes opportunistes Pseudomonas aeruginosa et Chromobacterium violaceum et ayant un rôle dans l'infectivité, ont été étudiées. La structure tridimensionnelle de la lectine de Psathyrella velutina, le premier membre d'un nouvelle famille des lectines de champignon a également été résolue.

La capacité des lectines à reconnaître spécifiquement des glycoconjugués à la surface de cellules en font des outils de diagnostic biomédical pour les pathologies associées à des changements de glycosylation (inflammation, du cancer ...). De par leur interaction avec les glycosphingolipides, ces protéines peuvent aussi être utilisées pour étudier le trafic membranaire. Toutefois, un nombre réduit de lectines sont actuellement disponibles, limitant leur utilisation dans les biotechnologies et la recherche. Le but de ma thèse est d'une part de concevoir des néo-lectines de valence et topologie contrôlées pour comprendre l'effet de la multivalence sur le mécanisme d'endocytose, et d'autre part de concevoir des lectines de spécificité modulable afin de les utiliser dans la reconnaissance spécifique des cellules tumorales.RSL est une lectine à fucose de la bactérie Ralstonia solanacearum qui a une structure en β-propeller formée par l'association de trois monomères présentant deux sites de liaison très similaires. Cette protéine trimérique et hexavalente a été choisie comme structure de base pour la conception de néolectines. Des RSLs trivalentes ont été produites par mutation d'un acide aminé essentiel pour la stabilisation du fucose. Leur caractérisation a démontré qu'ils avaient perdu la capacité d'invaginer la membrane plasmique. Une protéine de même structure que RSL mais monomérique a été ingénierée, puis une librairie de plus de 13 mutants de valence présentant différentes topologies a été créée. L'analyse de tous les mutants a permis de démontrer que la formation de tubules dans les membranes dépend plus de la distance entre les sites que du nombre de sites.Nous avons ensuite mis au point un protocole de bio-informatique afin de prédire l'orientation et la conformation d'oligosaccharides fucosylés dans les sites de fixation de plusieurs lectines à fucose. Les affinités relatives ont pu être calculées avec une bonne corrélation avec les valeurs expérimentales. La modélisation et la structure cristallographique des complexes entre RSL et les oligosaccharides Lewis X et Sialyl Lewis X indiquent un changement conformationnel du glycanne très inhabituel lors de l'interaction, donnant ainsi des pistes pour la conception de mutants de plus haute spécificité. / The ability of lectins to specifically recognize glycoconjugates on cell surface makes them excellent biomedical diagnostics tools for diseases associated with glycosylation changes (e.g inflammation, cancer, etc.). Furthermore, because of their interaction with glycosphingolipids, lectins may also be used to study membrane trafficking. However, only small number of lectins are currently available, limiting their use in biotechnology and research. The aim of my thesis was first to develop neolectins with controlled valency and topology to understand the effect of multivalency on the endocytosis mechanism, and second to design lectins with tuned specificity for the recognition of tumor cells.RSL is a fucose binding lectin from the bacterium Ralstonia solanacearum which has a β-propeller structure that is formed by the association of three monomers each having two very similar binding sites. This trimeric and hexavalent protein was chosen as the scaffold structure for the design of neolectins. Trivalent RSLs were created by mutating an amino acid with essential role in fucose binding. Characterization showed that these mutants lost the ability to invaginate the plasma membrane. In addition, monomeric RSL was engineered and a library of more than 13 mutants, with different topologies and valencies, was created. Analysis of these mutants showed that the formation of tubules in the membrane depends mostly on the distance between the sites rather than on the number of sites.Then we developed a bioinformatic protocol to predict the orientation and conformation of fucosylated oligosaccharides in the binding sites of several fucose binding lectins. The relative affinities could be calculated with a good correlation to experimental values. Both the model and the crystal structures of RSL complexed with sialyl Lewis X and Lewis X oligosaccharides indicate a very unusual conformational change of the glycan during the interaction. These studies pave the way for the design of mutants with higher specificity.