As infecções humanas com Leishmania spp dão origem a um amplo espectro de manifestações clínicas que vão desde lesões tegumentares até compromisso visceral. O fenótipo da doença está intimamente relacionado com o tipo de resposta do hospedeiro mamífero à infecção do parasito e à variabilidade genética entre as espécies. Neste contexto, a identificação e caracterização de genes que regulam a virulência no fenótipo de Leishmania são essenciais para a compreensão dos mecanismos patogênicos do hospedeiro-parasita. Estudos anteriores realizados no laboratório mostraram a atenuação da virulência através da superexpressão do SL RNA em transfectantes de Leishmania (L.) major e Leishmania (V.) braziliensis em modelo murino. Para entender as mudanças fenotípicas encontradas em Leishmania (L.) major, a análise do perfil de expressão de genes permitiu identificar seis genes down-regulados e up-regulados, que poderiam contribuir individualmente com um padrão de virulência. Seis genes foram selecionados, os quais estão diferencialmente expressos entre as linhagens controle e transfectante. Para identificar genes específicos que poderiam compensar parcialmente a perda de virulência, foram analisados o fenótipo da infecção in vivo em camundongos suscetíveis. O conjunto de nossos dados sugerem que os genes estudados (LmjF 12.066 proteína fosfatase serina/treonina (PP2A); LmjF 36,5640 semelhante a ciclina; LmjF 36,4740 PIG-P (fosfatidilinositol N-acetilglucosaminil transferase - subunidade P) podem afetar negativamente a virulência de Leishmania (L.) major in vivo. Foram observadas diferenças significativas (p<0,005) entre os transfectantes contendo o vetor vazio e os transfectantes superexpressores, embora a caracterização do crescimento em condições axênicas não mostrou alterações. A localização destas proteínas superexpressas sugerem uma localização citoplasmática. Os resultados apresentados indicam que os altos níveis de expressão destes genes comparado com as linhagens controle afetam negativamente a capacidade de linhagens virulentas, induzam lesões quando são injetadas em camundongos susceptíveis. / Human infections with Leishmania spp give rise to a spectrum of clinical manifestations ranging from tegumentary lesions to a visceral disease. The phenotype of the disease isclosely related to the type of parasite mammalian host response to infection and genetic variability among species. In this context, the identification and characterization of genes that regulate virulence in Leishmania phenotype is essential to the understanding of the pathogenic mechanisms of host-parasite. Previous studies conducted in the laboratory showed attenuation the virulence due to overexpression of the SL RNA in transfectants of Leishmania (L.) major and Leishmania (V.) braziliensis in a murine model. To understand the phenotypic changes found in Leishmania (L.) major, analyzes gene expression profile allowed to identify genes over- or under-expressed that may individually contribute to the virulence pattern. Six genes were selected which are differentially expressed between the control lines and transfectant. To identify specific genes can partly compensate for the loss of virulence, were analyze the phenotype of infection in vivo susceptible mice. Our results suggest that the studied genes (LmjF. 12.0660- Serine/threonine protein phosphatase (PP2A); LmjF. 36.5640 cycline-like; LmjF. 36.4740 PIG-P (phosphatidyl inositol N-acetylglucosaminyl transferase subuni P) had a negative effect over virulence of Leishmania (L.) major in vivo. Significant differences were observed p=<0.005 between parental; transfectants with vector alone and overexpressor, although growth profile in axenic conditions has not shown any change. All the proteins were detected in the cytoplasm. The results presented here indicate that high levels of these proteins affect negatively the ability of a virulent line to induce lesions when injected in susceptible mice.

As infecções humanas com Leishmania spp dão origem a um amplo espectro de manifestações clínicas que vão desde lesões tegumentares até compromisso visceral. O fenótipo da doença está intimamente relacionado com o tipo de resposta do hospedeiro mamífero à infecção do parasito e à variabilidade genética entre as espécies. Neste contexto, a identificação e caracterização de genes que regulam a virulência no fenótipo de Leishmania são essenciais para a compreensão dos mecanismos patogênicos do hospedeiro-parasita. Estudos anteriores realizados no laboratório mostraram a atenuação da virulência através da superexpressão do SL RNA em transfectantes de Leishmania (L.) major e Leishmania (V.) braziliensis em modelo murino. Para entender as mudanças fenotípicas encontradas em Leishmania (L.) major, a análise do perfil de expressão de genes permitiu identificar seis genes down-regulados e up-regulados, que poderiam contribuir individualmente com um padrão de virulência. Seis genes foram selecionados, os quais estão diferencialmente expressos entre as linhagens controle e transfectante. Para identificar genes específicos que poderiam compensar parcialmente a perda de virulência, foram analisados o fenótipo da infecção in vivo em camundongos suscetíveis. O conjunto de nossos dados sugerem que os genes estudados (LmjF 12.066 proteína fosfatase serina/treonina (PP2A); LmjF 36,5640 semelhante a ciclina; LmjF 36,4740 PIG-P (fosfatidilinositol N-acetilglucosaminil transferase - subunidade P) podem afetar negativamente a virulência de Leishmania (L.) major in vivo. Foram observadas diferenças significativas (p<0,005) entre os transfectantes contendo o vetor vazio e os transfectantes superexpressores, embora a caracterização do crescimento em condições axênicas não mostrou alterações. A localização destas proteínas superexpressas sugerem uma localização citoplasmática. Os resultados apresentados indicam que os altos níveis de expressão destes genes comparado com as linhagens controle afetam negativamente a capacidade de linhagens virulentas, induzam lesões quando são injetadas em camundongos susceptíveis. / Human infections with Leishmania spp give rise to a spectrum of clinical manifestations ranging from tegumentary lesions to a visceral disease. The phenotype of the disease isclosely related to the type of parasite mammalian host response to infection and genetic variability among species. In this context, the identification and characterization of genes that regulate virulence in Leishmania phenotype is essential to the understanding of the pathogenic mechanisms of host-parasite. Previous studies conducted in the laboratory showed attenuation the virulence due to overexpression of the SL RNA in transfectants of Leishmania (L.) major and Leishmania (V.) braziliensis in a murine model. To understand the phenotypic changes found in Leishmania (L.) major, analyzes gene expression profile allowed to identify genes over- or under-expressed that may individually contribute to the virulence pattern. Six genes were selected which are differentially expressed between the control lines and transfectant. To identify specific genes can partly compensate for the loss of virulence, were analyze the phenotype of infection in vivo susceptible mice. Our results suggest that the studied genes (LmjF. 12.0660- Serine/threonine protein phosphatase (PP2A); LmjF. 36.5640 cycline-like; LmjF. 36.4740 PIG-P (phosphatidyl inositol N-acetylglucosaminyl transferase subuni P) had a negative effect over virulence of Leishmania (L.) major in vivo. Significant differences were observed p=<0.005 between parental; transfectants with vector alone and overexpressor, although growth profile in axenic conditions has not shown any change. All the proteins were detected in the cytoplasm. The results presented here indicate that high levels of these proteins affect negatively the ability of a virulent line to induce lesions when injected in susceptible mice.

IGF-I induz proliferação e diferenciação celular. Neste estudo visamos sua participação na imunidade específica na leishmaniose. Estudamos efeito de citocinas Th1 (IFN-g) e Th2 (IL- 4 mais IL-13) na modulação da produção de IGF-I e seu reflexo no parasitismo de macrófago (MØ) de camundongos BALB/c e C57BL/6, infectados por amastigotas e promastigotas de Leishmania (L.) major. Iniciamos avaliando os efeitos de IGF-I no modelo, onde no desenvolvimento da lesão IGF-I induziu aumento maior de lesão em camundongos BALB/c. Nos camundongos C57BL/6 o efeito foi marcante com evolução progressiva da lesão enquanto que sem o fator, a lesão se controlava. Como a produção de IGF-I por MØ é modulada por citocinas, onde IFN-g diminui e IL-4 e IL-13 aumentam a sua expressão, fomos estudar seus efeitos no modelo proposto onde MØ foram infectados com amastigotas ou promastigotas de L.(L.) major (parasitos/célula = 2:1) e incubados com IFN-g (200U/mL) ou IL-4 (2ng/mL) mais IL-13 (5ng/mL). IFN-g induziu aumento significante na produção de NO nos dois modelos estudados. O efeito de citocinas Th1 e Th2 sobre o parasitismo em MØ foi distinto em BALB/c e C57BL/6. Quando infectados por amastigotas, o parasitismo aumentou sob estímulo com IL-4 mais IL-13 e diminuiu com IFN-g como era esperado. No entanto, quando infectado por promastigota, o parasitismo aumentou com IL-4 mais IL-13 somente em células BALB/c. Por outro lado, o parasitismo diminuiu com IFN- g somente em células C57BL/6. Mesmo na ausência do estímulo por citocinas, observou-se aumento na expressão de RNA de IGF-I nos MØ de animais BALB/c infectados por formas amastigotas ou promastigotas e de C57BL/6 infectados por promastigotas. Um resultado destoante foi à diminuição da expressão de IGF-I em MØ de C57BL/6 infectados por amastigotas. Em células BALB/c, essa expressão aumentada de IGF-I ocorrida em função da infecção, somente se alterou com IL-4 mais IL-13 quando infectadas por amastigotas. Em células C57BL/6, a expressão aumentada de IGF-I com a infecção por prormastigota, sofreu diminuição sob estímulo com IFN-g, não se alterando com citocinas Th2. A expressão diminuída de IGF-I com a infecção por amastigotas diminuiu ainda mais com IFN-g e aumentou com citocinas TH2. Os dados sugerem a possibilidade de modulação do efeito de citocinas pela expressão diferenciada de IGF-I em macrófagos infectados por L. (L.) major / Insulin-like growth factor (IGF)-I induces cell proliferation and differentiation. In this study, we focused on its participation on specific immunity. We studied the effect of Th1 (IFN-g) and Th2 (IL-4 plus IL-13) cytokines on the modulation of the production of IGF-I and its influence on BALB/c and C57BL/6 macrophage (MØ) parasitism using Leishmania (L.) major amastigote and promastigote. IGF-I expression was increased in infected macrophages. Initially, we substantiated the effect of IGF-I on in vitro growth of Leishmania (L.) major promastigote, on cutaneous lesion development in vivo and diminished production of nitric oxide in MØ. On development of the lesion, IGF-I induced greater increase of the lesion in BALB/c mice. In C5BL/6 mice, its effect was more pronounced with progression of the lesion whilst without the factor it was controlled. Since IGF-I production by MØ is modulated by cytokines where IFN-g decreases and IL-4 plus IL-13 increase its expression, we studied their effects in BALB/c and C57BL/6 MØ. Macrophages were infected with L.(L.) major amastigotes or promastigotes (parasites/cell = 2:1) and incubated with IFN-g (200U/mL) or IL-4 (2ng/mL) plus IL-13 (5ng/mL). IFN-g induced a significant increase of NO production by MØ from both models. The effect of Th1 and Th2 cytokines on parasitism was distinct when MØ infected with amastigotes, the parasitism increased upon IL-4 plus IL-13 stimuli and diminished with IFN-g as expected. However, when infected with promastigotes, the parasitism increased with IL-4 plus IL-13 only in BALB/c cells. Conversely, the parasitism diminished with IFN-g only in C57BL/6. Even in the absence of cytokine stimuli, an increase of the expression of IGF-I mRNA was observed in L (L.) major amastigote- and promastigote- infected BALB/c MØ and in promastigoteinfected C57BL/6 MØ. A dissonant result was a diminished IGF-I expression in amastigoteinfected C57BL/6 MØ. In BALB/c this increased IGF-I expression with infection only altered with IL-4 plus IL-13 in amastigote-infected cells. In C57BL/6 cells, the increased IGF-I expression upon prormastigote infection diminished under IFN-g stimulus that was not altered with Th2 cytokines. A decreased IGF-I expression with amastigote-infection diminished even more with IFN-g and increased with Th2 cytokines. These data suggest a possibility of modulation of the effect of cytokines on distinct expression of IGF-I in L. (L.) major-infected MØ

IGF-I induz proliferação e diferenciação celular. Neste estudo visamos sua participação na imunidade específica na leishmaniose. Estudamos efeito de citocinas Th1 (IFN-g) e Th2 (IL- 4 mais IL-13) na modulação da produção de IGF-I e seu reflexo no parasitismo de macrófago (MØ) de camundongos BALB/c e C57BL/6, infectados por amastigotas e promastigotas de Leishmania (L.) major. Iniciamos avaliando os efeitos de IGF-I no modelo, onde no desenvolvimento da lesão IGF-I induziu aumento maior de lesão em camundongos BALB/c. Nos camundongos C57BL/6 o efeito foi marcante com evolução progressiva da lesão enquanto que sem o fator, a lesão se controlava. Como a produção de IGF-I por MØ é modulada por citocinas, onde IFN-g diminui e IL-4 e IL-13 aumentam a sua expressão, fomos estudar seus efeitos no modelo proposto onde MØ foram infectados com amastigotas ou promastigotas de L.(L.) major (parasitos/célula = 2:1) e incubados com IFN-g (200U/mL) ou IL-4 (2ng/mL) mais IL-13 (5ng/mL). IFN-g induziu aumento significante na produção de NO nos dois modelos estudados. O efeito de citocinas Th1 e Th2 sobre o parasitismo em MØ foi distinto em BALB/c e C57BL/6. Quando infectados por amastigotas, o parasitismo aumentou sob estímulo com IL-4 mais IL-13 e diminuiu com IFN-g como era esperado. No entanto, quando infectado por promastigota, o parasitismo aumentou com IL-4 mais IL-13 somente em células BALB/c. Por outro lado, o parasitismo diminuiu com IFN- g somente em células C57BL/6. Mesmo na ausência do estímulo por citocinas, observou-se aumento na expressão de RNA de IGF-I nos MØ de animais BALB/c infectados por formas amastigotas ou promastigotas e de C57BL/6 infectados por promastigotas. Um resultado destoante foi à diminuição da expressão de IGF-I em MØ de C57BL/6 infectados por amastigotas. Em células BALB/c, essa expressão aumentada de IGF-I ocorrida em função da infecção, somente se alterou com IL-4 mais IL-13 quando infectadas por amastigotas. Em células C57BL/6, a expressão aumentada de IGF-I com a infecção por prormastigota, sofreu diminuição sob estímulo com IFN-g, não se alterando com citocinas Th2. A expressão diminuída de IGF-I com a infecção por amastigotas diminuiu ainda mais com IFN-g e aumentou com citocinas TH2. Os dados sugerem a possibilidade de modulação do efeito de citocinas pela expressão diferenciada de IGF-I em macrófagos infectados por L. (L.) major / Insulin-like growth factor (IGF)-I induces cell proliferation and differentiation. In this study, we focused on its participation on specific immunity. We studied the effect of Th1 (IFN-g) and Th2 (IL-4 plus IL-13) cytokines on the modulation of the production of IGF-I and its influence on BALB/c and C57BL/6 macrophage (MØ) parasitism using Leishmania (L.) major amastigote and promastigote. IGF-I expression was increased in infected macrophages. Initially, we substantiated the effect of IGF-I on in vitro growth of Leishmania (L.) major promastigote, on cutaneous lesion development in vivo and diminished production of nitric oxide in MØ. On development of the lesion, IGF-I induced greater increase of the lesion in BALB/c mice. In C5BL/6 mice, its effect was more pronounced with progression of the lesion whilst without the factor it was controlled. Since IGF-I production by MØ is modulated by cytokines where IFN-g decreases and IL-4 plus IL-13 increase its expression, we studied their effects in BALB/c and C57BL/6 MØ. Macrophages were infected with L.(L.) major amastigotes or promastigotes (parasites/cell = 2:1) and incubated with IFN-g (200U/mL) or IL-4 (2ng/mL) plus IL-13 (5ng/mL). IFN-g induced a significant increase of NO production by MØ from both models. The effect of Th1 and Th2 cytokines on parasitism was distinct when MØ infected with amastigotes, the parasitism increased upon IL-4 plus IL-13 stimuli and diminished with IFN-g as expected. However, when infected with promastigotes, the parasitism increased with IL-4 plus IL-13 only in BALB/c cells. Conversely, the parasitism diminished with IFN-g only in C57BL/6. Even in the absence of cytokine stimuli, an increase of the expression of IGF-I mRNA was observed in L (L.) major amastigote- and promastigote- infected BALB/c MØ and in promastigoteinfected C57BL/6 MØ. A dissonant result was a diminished IGF-I expression in amastigoteinfected C57BL/6 MØ. In BALB/c this increased IGF-I expression with infection only altered with IL-4 plus IL-13 in amastigote-infected cells. In C57BL/6 cells, the increased IGF-I expression upon prormastigote infection diminished under IFN-g stimulus that was not altered with Th2 cytokines. A decreased IGF-I expression with amastigote-infection diminished even more with IFN-g and increased with Th2 cytokines. These data suggest a possibility of modulation of the effect of cytokines on distinct expression of IGF-I in L. (L.) major-infected MØ

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-22 / Quase todos os patógenos intracelulares não virais de importância humana e animal penetram nas células hospedeiras por fagocitose “clássica” ou modificada. Por este motivo os fagossomos constituem o primeiro e, às vezes, o último habitat dos patógenos intracelulares. Sua sobrevida e multiplicação na célula hospedeira dependem da modulação do fenótipo composicional e funcional dos fagossomos em que habitam, como o pH intravacuolar, a aquisição de substratos e nutrientes pela presença de canais e transportadores e a fusão com lisossomos, outros fagossomos e vesículas. Cada fagossomo ou fagolisossomo é uma entidade particular, cuja biogênese depende de sinais expressos ou disparados pela célula e pela partícula ou organismo internalizado. Uma vez internalizados pelas células hospedeiras, alguns patógenos escapam do fagossomo e se instalam no citosol. Outros interferem com a maturação dos fagossomos, de forma a excluí-los das vias endocítica e secretória ou gerar vacúolos de capacidade fusogênica seletiva. Os parasitas do gênero Leishmania permanecem, durante todo o ciclo de vida intracelular no hospedeiro mamífero, em estruturas semelhantes a fagolisossomos denominadas vacúolos parasitóforos (VPs). A diversidade morfológica e bioquímica desses vacúolos foi pouco estudada. Os VPs formados pelas espécies mais estudadas – (L.) L. major, L. (L.) donovani e L. (V.) braziliensis - abrigam uma ou duas formas amastigotas e apresentam pouco espaço vacuolar livre. À medida que os amastigotas se dividem, os VPs que os hospedam fissionam, porém os mecanismos envolvidos neste processo são desconhecidos. Já parasitas do complexo (L.) (L.) mexicana, incluindo L. (L.) amazonensis, L. (L.) mexicana e L. (L.) pifanoi, ocupam VPs espaçosos contendo mais de um amastigota. O presente estudo experimental teve como objetivo responder à questão: “qual a importância de um VP espécie-específico para o parasitismo intracelular de Leishmania?”. Nos experimentos descritos, macrófagos derivados de precursores de medula óssea de camundongo foram coinfectados por duas espécies de Leishmania para investigar a possibilidade de fusão entre VPs que hospedam diferentes parasitas e as consequências de uma possível coabitação intravacuolar sobre a viabilidade e multiplicação dos dois parasitas. Os macrófagos foram inicialmente infectados com L. (L.) amazonensis e em seguida superinfectados por L. (L.) major, espécies que desenvolvem VPs de tamanho, número de parasitas e biogênese distintos. Para permitir o reconhecimento inequívoco da espécie dos parasitas, os macrófagos foram infectados por amastigotas não fluorescentes de L. (L.) amazonensis e superinfectados com amastigotas ou promastigotas de L. (L.) major que expressam proteínas fluorescentes GFP ou DsRed2. Constatamos que os VPs contendo amastigotas de L. (L.) major aderiram aos espaçosos VPs de L. (L.) amazonensis mas a fusão entre os vacúolos não foi detectada. A multiplicação da L. (L.) major e a fissão de seus VPs nos macrófagos superinfectados não foram afetadas pela infecção pelos dois parasitas. Já os VPs contendo promastigotas da L. (L.) major se fundiram com os VPs da L. (L.) amazonensis. Nestes VPs “quiméricos” (contendo ambas as espécies de parasitas) os promastigotas de L. (L.) major dividiram-se mas não se diferenciaram em amastigotas. Essa diferenciação só ocorreu nos pequenos VPs que abrigavam exclusivamente a L. (L.) major. / Most non-viral intracellular pathogens gain entrance into human and animal host cells by “classic” or modifIed phagocytosis and are thus lodged in phagosomes which they may or not continue to occupy in the course of infection. Their survival and multiplication within host cells depend on modulation of the compositional and functional phenotypes of the phagosomes they occupy, including intravacuolar pH, substrate acquisition through membrane transporters and channels, and fusion with lysosomes, and other cell phagosomes and vesicles. Each phagosome thus exhibits particular features, whose biogenesis is conditioned to different signals triggered by both the host cell and the internalized particle/microorganism. Once internalized by host cells, some pathogens escape the phagosome and assume the host cell cytosol as their intracellular niche. Other pathogens interfere with phagosomal maturation, leading to the development of phagosomes excluded from host cell endocytic and secretory pathways or vacuoles with selective fusogenic properties. During their intracelular lifecycle, protozoan parasites of the genus Leishmania remain enclosed in phagolysosome-like structures called Parasitophorous Vacuoles (PVs). The morphological and biochemical diversity of Leishmania PVs were not extensively studied. Most species – such as L. major, L. donovani and L. braziliensis – are lodged in membrane-bound PVs, containing one or two amastigotes, that undergo fission as parasites divide. The mechanisms involved in PV fission remain to be elucidated. In contrast, species from the L. mexicana complex, such as L. amazonensis, L. mexicana and L. pifanoi, occupy large PVs which may contain many parasites. The present experimental aimed to answer the question: “what is the importance of a speciesspecific PV to Leishmania intracellular parasitism?”. In the experiments herewith described, mouse bone marrow-derived macrophages were co-infected with two Leishmania species to investigate the possibility of fusion between PVs that shelter different parasites, and the consequences of a possible intravacuolar cohabitation on their survival and multiplication. Macrophages were initially infected with L. amazonensis and later on superinfected with L. major, which represent species with different PV size, parasite content and biogenesis. In order to distinguish the two species, macrophages were infected with non-fluorescent L. amazonensis amastigotes and superinfected with either amastigotes or promastigotes of L. major transfected with the fluorescent proteins GFP or DsRed2. Although PVs contacted each other, fusion between L. amazonensis and L. major amastigote PVs was not detected. Leishmania major multiplication and PV fission were not affected by coinfection. In contrast, PVs containing L. major promastigotes fused with pre-established L. amazonensis PVs. In these “chimeric” vacuoles (containing both Leishmania), L. major promastigotes multiplied, however they did not differentiate into amastigotes. The differentiation of L. major promastigotes into amastigotes occurred exclusively within their own, unfused PVs. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Considerando o grave quadro das doenças negligenciadas, no Brasil e no mundo, e as limitações do tratamento empregado, na atualidade, torna-se urgente a pesquisa de novos fármacos, que sejam mais ativos e seguros. Para tanto, a busca de moléculas-protótipo, a partir de espécies vegetais, tem sido importante estratégia. Neste contexto, foi realizado o estudo de Annona crassiflora Mart. (Annonaceae), cujos alcalóides totais (AT) demonstraram promissora atividade antiprotozoária in vitro, em estudo anterior. Em paralelo, outras espécies de Annona mostraram atividade antimicobacteriana in vitro, igualmente, tendo motivado o presente estudo. Cinco das vinte frações alcaloídicas obtidas, por cromatografia em coluna, a partir dos AT das folhas, apresentaram atividade anti-Leishmania in vitro, tendo causado 100% de morte das formas promastigotas de Leishmania (L.) infantum chagasi. Além disto, três delas foram ativas frente ao Mycobacterium tuberculosis. O isolamento de dois alcalóides noraporfínicos foi realizado, por fracionamento biomonitorado em coluna cromatográfica, seguido de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) semipreparativa. As estruturas dos compostos isolados foram elucidadas empregando-se as análises espectroscópicas de ressonância magnética nuclear, mono e bidimensionais, e por CLAE acoplada à espectrometria de massas (CLAEIES-EM2). Um dos alcalóides foi identificado pela primeira vez, nesta espécie, sendo que o outro apresentou estrutura inédita. Ambos demonstraram significativa atividade anti-Leishmania in vitro (CE50&#8804; 10 &#181; g/ mL) frente às formas promastigotas de L. (L.) infantum chagasi [MHOM/BR/1972/LD]. O primeiro teve maior índice de seletividade (IS: 7,4), em relação à citotoxicidade em células do tecido conjuntivo NCTC Clone 929 de camundongos. Frente ao Mycobacterium tuberculosis (ATCC 27294) e ao M. smegmatis (ATCC 35798), os alcalóides isolados foram inativos (CIM &#8805; 128 &#181;g/ mL). O óleo volátil das folhas foi analisado por cromatografia gasosa acoplada à espectroscopia de massas (CG-EM), tendo sido identificados 41 constituintes, prevalecendo os sesquiterpenos (81,7%) em relação aos monoterpenos (0,8%). Entre os compostos majoritários encontrados no óleo, citam-se os sesquiterpenos &#945;-amorfeno (43,6%), E-cariofileno (17,7%) e o germacreno (5,3%). Nos testes de atividade anti-Leishmania in vitro frente às formas promastigotas de quatro espécies do parasita, o óleo foi mais ativo em L. (L.) infantum chagasi (CE50: 25,97 &#181;g/ mL). Nas formas tripomastigotas do Trypanosoma cruzi mostrou atividade 8,5 vezes superior àquela do fármaco-padrão benznidazol (CE50: 5,31 &#181;g/ mL). Os resultados obtidos ratificaram a importância da prospecção da flora, em particular de A. crassiflora, como fonte potencial de compostos bioativos, que venham a constituir novos fármacos, como alternativa à restrita terapêutica existente para o tratamento das doenças negligenciadas. / Neglected diseases are a serious health problem in Brazil and worldwide. The available drugs are limited in effectiveness with a high toxicity. There is an urgent need of more safe and bioactive compounds. The search of new molecules from plant species is a well known and important strategy to achieve this goal. In a previous work, Annona crassiflora Mart. (Annonaceae) showed a promising antiprotozoal activity. Beside this, other Annona species presented an interesting antimicobacterial action. In this bio-guided study, after the column fractionation of the leaves total alkaloids, in vitro tests were performed and five from twenty fractions were highly active (100% deaths) against promastigotes of Leishmania (L.) infantum chagasi, and only three were active against Mycobacterium tuberculosis. After purification of the bioactive fractions, two noraporphine alkaloids were isolated by HPLC and identified by the usual mono and bidimensional spectroscopic techniques. One of them was isolated from the first time from this species. The other one is a novel chemical entity. Both compounds presented anti- Leishmania activity (CE50 &#8804; 10 &#181;g/ mL) against L. (L.) infantum chagasi [MHOM/BR/1972/LD]. The first one showed a higher selectivity index (SI: 7.4) considering its mice connective tissue cells toxicity [NCTC Clone 929]. However, both were inactive against Mycobacterium tuberculosis (ATCC 27294) and M. smegmatis (ATCC 35798) (CIM &#8805; 128 &#181;g/ mL). In the leaves volatile oil 41 compounds were identified. The sesquiterpenes were in majority (81.7%), followed by monoterpenes (0.8%). The sesquiterpenes &#945;-amorphene (43.6%), E-caryophyllene (17.7%) and germacrene (5.3%) were the main constituents. The oil was little effective against the four tested Leishmania species and slightly more active against L. (L.) infantum chagasi (CE50: 25.97 &#181;g/ mL). However, it was highly active against the trypomastigotes of Trypanosoma cruzi (CE50: 5.31 &#181;g/ mL) showing to be 8.5 times more active than benznidazol. These results stimulate a deeper investigation of those alkaloids as antiprotozoal agents, confirming the importance of the plant species metabolites as a source of new bioactive molecules and their potential as future drugs.

Considerando o grave quadro das doenças negligenciadas, no Brasil e no mundo, e as limitações do tratamento empregado, na atualidade, torna-se urgente a pesquisa de novos fármacos, que sejam mais ativos e seguros. Para tanto, a busca de moléculas-protótipo, a partir de espécies vegetais, tem sido importante estratégia. Neste contexto, foi realizado o estudo de Annona crassiflora Mart. (Annonaceae), cujos alcalóides totais (AT) demonstraram promissora atividade antiprotozoária in vitro, em estudo anterior. Em paralelo, outras espécies de Annona mostraram atividade antimicobacteriana in vitro, igualmente, tendo motivado o presente estudo. Cinco das vinte frações alcaloídicas obtidas, por cromatografia em coluna, a partir dos AT das folhas, apresentaram atividade anti-Leishmania in vitro, tendo causado 100% de morte das formas promastigotas de Leishmania (L.) infantum chagasi. Além disto, três delas foram ativas frente ao Mycobacterium tuberculosis. O isolamento de dois alcalóides noraporfínicos foi realizado, por fracionamento biomonitorado em coluna cromatográfica, seguido de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) semipreparativa. As estruturas dos compostos isolados foram elucidadas empregando-se as análises espectroscópicas de ressonância magnética nuclear, mono e bidimensionais, e por CLAE acoplada à espectrometria de massas (CLAEIES-EM2). Um dos alcalóides foi identificado pela primeira vez, nesta espécie, sendo que o outro apresentou estrutura inédita. Ambos demonstraram significativa atividade anti-Leishmania in vitro (CE50&#8804; 10 &#181; g/ mL) frente às formas promastigotas de L. (L.) infantum chagasi [MHOM/BR/1972/LD]. O primeiro teve maior índice de seletividade (IS: 7,4), em relação à citotoxicidade em células do tecido conjuntivo NCTC Clone 929 de camundongos. Frente ao Mycobacterium tuberculosis (ATCC 27294) e ao M. smegmatis (ATCC 35798), os alcalóides isolados foram inativos (CIM &#8805; 128 &#181;g/ mL). O óleo volátil das folhas foi analisado por cromatografia gasosa acoplada à espectroscopia de massas (CG-EM), tendo sido identificados 41 constituintes, prevalecendo os sesquiterpenos (81,7%) em relação aos monoterpenos (0,8%). Entre os compostos majoritários encontrados no óleo, citam-se os sesquiterpenos &#945;-amorfeno (43,6%), E-cariofileno (17,7%) e o germacreno (5,3%). Nos testes de atividade anti-Leishmania in vitro frente às formas promastigotas de quatro espécies do parasita, o óleo foi mais ativo em L. (L.) infantum chagasi (CE50: 25,97 &#181;g/ mL). Nas formas tripomastigotas do Trypanosoma cruzi mostrou atividade 8,5 vezes superior àquela do fármaco-padrão benznidazol (CE50: 5,31 &#181;g/ mL). Os resultados obtidos ratificaram a importância da prospecção da flora, em particular de A. crassiflora, como fonte potencial de compostos bioativos, que venham a constituir novos fármacos, como alternativa à restrita terapêutica existente para o tratamento das doenças negligenciadas. / Neglected diseases are a serious health problem in Brazil and worldwide. The available drugs are limited in effectiveness with a high toxicity. There is an urgent need of more safe and bioactive compounds. The search of new molecules from plant species is a well known and important strategy to achieve this goal. In a previous work, Annona crassiflora Mart. (Annonaceae) showed a promising antiprotozoal activity. Beside this, other Annona species presented an interesting antimicobacterial action. In this bio-guided study, after the column fractionation of the leaves total alkaloids, in vitro tests were performed and five from twenty fractions were highly active (100% deaths) against promastigotes of Leishmania (L.) infantum chagasi, and only three were active against Mycobacterium tuberculosis. After purification of the bioactive fractions, two noraporphine alkaloids were isolated by HPLC and identified by the usual mono and bidimensional spectroscopic techniques. One of them was isolated from the first time from this species. The other one is a novel chemical entity. Both compounds presented anti- Leishmania activity (CE50 &#8804; 10 &#181;g/ mL) against L. (L.) infantum chagasi [MHOM/BR/1972/LD]. The first one showed a higher selectivity index (SI: 7.4) considering its mice connective tissue cells toxicity [NCTC Clone 929]. However, both were inactive against Mycobacterium tuberculosis (ATCC 27294) and M. smegmatis (ATCC 35798) (CIM &#8805; 128 &#181;g/ mL). In the leaves volatile oil 41 compounds were identified. The sesquiterpenes were in majority (81.7%), followed by monoterpenes (0.8%). The sesquiterpenes &#945;-amorphene (43.6%), E-caryophyllene (17.7%) and germacrene (5.3%) were the main constituents. The oil was little effective against the four tested Leishmania species and slightly more active against L. (L.) infantum chagasi (CE50: 25.97 &#181;g/ mL). However, it was highly active against the trypomastigotes of Trypanosoma cruzi (CE50: 5.31 &#181;g/ mL) showing to be 8.5 times more active than benznidazol. These results stimulate a deeper investigation of those alkaloids as antiprotozoal agents, confirming the importance of the plant species metabolites as a source of new bioactive molecules and their potential as future drugs.