Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-10-15T17:46:51Z No. of bitstreams: 1 amanda_b_r_b_macedo_ioc_bcm_0038_2011.pdf: 6569786 bytes, checksum: 14dd4b1254c99bb75e49af1ca06a9072 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-15T17:46:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 amanda_b_r_b_macedo_ioc_bcm_0038_2011.pdf: 6569786 bytes, checksum: 14dd4b1254c99bb75e49af1ca06a9072 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / As Leishmanioses são doenças causadas por diferentes espécies de protozoários do gênero Leishmania, que afetam indivíduos em aproximadamente 88 países. Atualmente, a medida de controle da doença mais aceita é o desenvolvimento de uma vacina profilática; porém, para que uma vacina efetiva seja alcançada, torna-se necessário a compreensão dos fatores que regulam e participam na proteção durante e após a infecção natural. São comuns trabalhos em que a resposta imune do tipo Th1 é medida exclusivamente pela produção in vitro de IFN-γ, porém a avaliação de um só parâmetro nem sempre é suficiente para predizer proteção. O presente trabalho visou estudar a qualidade de resposta Th1 induzida por diferentes antígenos de Leishmania em pacientes com a forma cutânea de leishmaniose tegumentar americana (LTA) provenientes do RJ. Utilizando-se ensaios de citometria de fluxo multiparamétrica para marcadores de superfície, e para as citocinas IL-2, TNF-α e IFN-γ, bem como ELISA para IFN-γ, foram feitas comparações da resposta induzida pelos extratos totais de promastigotas de fase estacionária de L. (V.) braziliensis (LbT) e L. (L.) amazonensis (PH8T), assim como frações enriquecidas em componentes subcelulares de L. (L.) amazonensis, em células mononucleares de sangue periférico de pacientes com LTA, antes e 140 dias após o tratamento, e indivíduos controles sadios. A análise das subpopulações de linfócitos T por citometria de fluxo não identificou alterações significativas nos percentuais de células CD8 +, CD4+ e CD25+ induzidas pelos diferentes estímulos, dentro de um mesmo grupo, nem entre os grupos de pacientes e controles. A avaliação individual da MFI integrada (frequência de células produtoras de uma citocina multiplicada pela intensidade média de fluorescência) para cada citocina estudada, não evidenciou nenhuma diferença marcante na resposta imune do tipo Th1 induzida pelos diferentes estímulos; porém, através da avaliação da contribuição dos fenótipos CD4+ produtores de 3, 2 ou 1 única citocina na resposta imune do tipo Th1 total, observamos diferenças qualitativas bem distintas entre as respostas obtidas antes e após o tratamento, e entre os antígenos estudados. Todos os estímulos apresentaram aumento da porporção de células multifuncionais nos pacientes PT, em relação aos AT. Após o tratamento, LbT foi o estímulo que induziu maior proporção de células multifuncionais (produtoras de IL-2, TNF-α e IFN-γ, simultaneamente; 28%), seguido da fração de membrana de L. (L.) amazonensis (PH8M; 23%), enquanto que, PH8T induziu a menor proporção de células multifuncionais (10%), e a maior proporção de células simples produtoras de IFN-γ (38%). Corroborando alguns outros relatos da literatura, observamos que as células multifuncionais são as que possuem a maior intensidade média de fluorescência para as 3 citocinas estudadas. A avaliação quantitativa da produção de IFN-γ por ELISA, demonstrou que LbT foi o estímulo que induziu significativamente a maior produção desta citocina, em comparação aos demais estímulos, tanto antes como após o tratamento. Este último resultado parece se correlacionar com os dados de citometria já mencionados, em que este mesmo estímulo foi capaz de induzir o maior percentual de células T multifuncionais, células essas com a capacidade de produzir uma quantidade maior de citocinas, do que os outros fenótipos estudados, como evidenciado nos resultados de MFI. Nossos resultados levam a discussão sobre a importância da avaliação da qualidade de uma resposta imune do tipo Th1 medida por mais de um parâmetro, a nível de uma única célula, e sugerem que a avaliação das células multifuncionais é importante para correlacionar com a cura da doença. / Leishmaniasis is a group of disease caused by different species of protozoan parasites from the genus Leishmania, that affects 88 countries around the world. Currently, the most accepted approach to control the disease is a prophylactic vaccine. However, to develop such a vaccine, it becomes necessary to understand the factors that regulate and participate in the healing process as well as protection during and after natural infection. It is well established that Th1-immune response is important for the protection against intracellular parasites. Many studies evaluate this response only by the in vitro IFN-γ production, but the evaluation of this single parameter not always is sufficient to predict protection. The present work assessed the quality of the Th1-immune response induced by different Leishmania antigens in patients affected with the cutaneous form of American Tegumentary Leishmaniasis (ATL) from Rio de Janeiro, Brazil. Using multiparametric flow cytometry to access surface markers and cytokines, such as IL-2, TNF-α and IFN-γ, as well as ELISA to measure IFN-γ in culture supernatants, we evaluated the immune responses induced by total antigens of stationary phase promastigotes of L. (V.) braziliensis (LbT) and L. (L.) amazonensis (PH8T), as well as subcellular components, composed of enriched fractions of L. (L.) amazonensis promastigotes, in peripheral blood mononuclear cells of ATL patients, before and 140 days after antimonial therapy, and healthy controls. Analysis of the T lymphocytes subpopulations by flow cytometry did not show significant variations in the percentage of CD4+, CD8+ and CD25+ cells induced by all different stimuli within the same group, or among the three studied groups. The individual evaluation of integrated MFI (frequency x MFI) for each cytokine assessed did not show any marked difference in the Th1-immune response induced by the different stimuli; however, by assessing the contribution of the CD4+ phenotypes producing 3, 2, or a single cytokine in the total Th1-immune response, we were able to identify very interesting differences. In the group of patients analyzed after treatment, LbT induced the highest proportion of multifunctional CD4+ T cells (producing IL-2, TNF-α and IFN-γ, simultaneously; 28%), followed by the membrane fraction of L. (L.) amazonensis (PH8M; 23%), whereas PH8T induced the lowest proportion of multifunctional CD4+ T cells (10%) and the highest proportion of single positive-cells for IFN-γ (38%). Corroborating previously published data, our results also showed that multifunctional CD4+T cells are those with the highest mean fluorescence intensity for the three cytokines studied. The quantitative evaluation of IFN-γ by ELISA showed that LbT significantly induced the higher production of this cytokine, in comparison to the other stimuli, both before and after treatment. This last result appears to show a relationship with our flow cytometry data, in which the same antigen was able to induce the highest percentage of multifunctional T cells, coincidently the cells that produced the larger amounts of cytokines, in comparison to the other CD4+ T cells phenotypes, as observed by the MFI values. Our results support the actual discussion about the importance of evaluating not only the quantity, but also the quality of a Th1-immune response by more than one parameter at a single-cell level, and indicate the importance of studying multifunctional CD4+ T cells in the cure of of ATL lesions.

Made available in DSpace on 2016-06-17T14:12:51Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1914 bytes, checksum: 7d48279ffeed55da8dfe2f8e81f3b81f (MD5) Dissertaçao-AlmeidaAF-Final.pdf: 1255683 bytes, checksum: a7eec12079ba89af0a1d43bf178a08d9 (MD5) Previous issue date: 2013 / Made available in DSpace on 2016-07-05T22:00:04Z (GMT). No. of bitstreams: 3 Disserta?ao-AlmeidaAF-Final.pdf.txt: 152410 bytes, checksum: edb416d121ad44fbbca484f722d9f79f (MD5) Disserta?ao-AlmeidaAF-Final.pdf: 1255683 bytes, checksum: a7eec12079ba89af0a1d43bf178a08d9 (MD5) license.txt: 1914 bytes, checksum: 7d48279ffeed55da8dfe2f8e81f3b81f (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / As leishmanioses são um grave problema de saúde em todo o mundo e a forma cutânea é encontrada em todas as regiões do Brasil, sendo endêmica no estado de Pernambuco. Infecções por Leishmania levam à ativação da resposta imunológica no hospedeiro, destacando-se a resposta celular. Esta é caracterizada por expansão de vários tipos celulares, sobretudo de linfócitos T, com produção de diferentes perfis de citocinas. Este estudo teve como objetivo caracterizar imunofenotipicamente pacientes portadores de leishmaniose tegumentar ativa quanto à produção das citocinas IL-17, IL-21, IL-22, IL-23, IFN-γ, TNF-α, IL-10 e IL-4. Verificou-se a produção sérica de IL-6, IL-10, TNF-α, IFN-γ e IL-17 em pacientes com doença ativa (AT), após tratamento (PT) e de pacientes que apresentaram cura espontânea das lesões (CE). Buscou-se também a associação entre produção de citocinas na resposta imune celular de pacientes AT, relacionando a resposta imune dos perfis Th1, Th2 e Th17. Foi observada maior proporção de linfócitos T CD3+ e T CD4+ , maior produção de IL- 17 e IL-23 por linfócitos T CD4+ e de IL-4 por linfócitos T CD4+ e T CD8+ em AT, em comparação aos controles, e também maior produção de IL-10 por linfócitos T CD8+ em AT. Os resultados revelaram maior concentração sérica de IL-6 em CE em comparação aos outros grupos. Além disso, observou-se associação positiva significativa entre citocinas Th1 (IFN-γ) e Th2 (IL-4) em AT. Os resultados mostram que a proporção de linfócitos T CD3+ e T CD4+ é importante no processo de cura das lesões. O predomínio de citocinas Th2 na doença ativa sugere uma desregulação imunológica temporária inicial. No entanto, pode haver um favorecimento para a cura clínica nos pacientes que apresentam uma boa indução para a resposta Th17 com produção significativa de IL-6, como observado em CE. Portanto, um balanço adequado entre as respostas imunes no paciente pode ser o ideal para uma melhor resolução das patologias causadas L. (V.) braziliensis.

A leishmaniose é uma protozoonose que apresenta diferentes manifestações clínicas, associadas a fatores relacionados ao parasita, a resposta imune do hospedeiro e epidemiologia da doença. Esses fatores podem influenciar no desfecho da doença e na efetividade da terapia antileishmania que até hoje se baseia no uso de fármacos de alto custo, alta toxicidade e que podem causar diversos efeitos colaterais. A pentamidina é um fármaco de segunda escolha no tratamento da leishmaniose utilizada em casos específicos de Leishmaniose Tegumentar nas regiões da América do Sul. Por causa dessas limitações, novos fármacos ou novos regimes terapêuticos vêm se mostrando cada vez mais necessários no tratamento contra as leishmanioses devido ao surgimento de falhas terapêutica e resistência aos fármacos existentes. Linhagens de L. amazonensis resistentes a PMD superexpressoras ou não do gene PRP1 tiveram o fenótipo de resistência revertido após a associação de pentamidina com verapamil. Deste modo, propomos verificar o efeito da associação de pentamidina com verapamil, anfotericina B e miltefosina contra parasitos de L. (L.) amazonensis suscetíveis (La M2269) e resistentes à pentamidina (La PRP1 e La PEN 0,5). O efeito das interações entre a pentamidina e os demais fármacos foi avaliado pelo método modificado de isobolograma e a natureza da interação foi classificada através da análise dos valores de Concentração Inibitória Fracionada (CIF). As associações de pentamidina com o verapamil, anfotericina B e miltefosina contra promastigotas de La M2269 foram classificadas como indiferente a partir da análise dos valores de CIF. Interações indiferentes também foram observadas contra promastigotas de La PRP1 e La PEN 0,5 quando tratadas com as mesmas associações. Macrófagos foram infectados com parasitos de La M2269 e tratados com diferentes concentrações de PMD. Nossos resultados sugerem que altas concentrações de PMD (17,5uM) foram tóxicas contra macrófagos e apresentaram baixa atividade quando utilizada contra amastigotas de La M2269 em até 72 horas de incubação. Observamos que ao prorrogar a incubação para 120 horas, concentrações inferiores a 1uM de PMD reduziram a taxa de infecção para aproximadamente 30%. Já ao analisarmos o efeito das combinações de pentamidina com o verapamil observamos baixa atividades desses fármacos quando combinado, indicando possivelmente uma interação indiferente/ antagônica. A associação de pentamidina com anfotericina B contra amastigotas de La M2269 foi avaliada pelo método de isobolograma e a natureza da interação foi classificada como indiferente por apresentar um valor de CIF = 0,65. / Leishmaniasis is a protozoan disease that presents different clinical manifestations, associated to factors related to the parasite, the host immune response and the epidemiology of the disease. These factors may influence the outcome of the disease and the effectiveness of antileishmania therapy, which is still based on the use of high-cost, high toxicity drugs that can cause several side effects. Pentamidine is a second-choice drug in the treatment of leishmaniasis used in specific cases of cutaneous leishmaniasis in the South American regions. Because of these limitations, new drugs or new therapeutic regimens are proving increasingly necessary in the treatment of leishmaniasis due to the emergence of therapeutic failures and resistance to existing drugs. L. (L.) amazonensis strains resistant to PMD overexpressors or not of the PRP1 gene had the resistance phenotype reverted after the association of pentamidine with verapamil. Thus, we propose to verify the effect of the association of pentamidine with verapamil, amphotericin B and miltefosine against parasites of L. (L.) amazonensis susceptible (La M2269) and resistant to pentamidine (La PRP1 and La PEN 0,5). The effect of the interactions between pentamidine and other drugs was evaluated by the modified isobologram method and the nature of the interaction was classified through the analysis of the Fractional Inhibitory Concentration (FIC) values. The associations of pentamidine with verapamil, amphotericin B and miltefosine against La M2269 promastigotes were classified as indifferent from the analysis of FIC values. Indifferent interactions were also observed against La PRP1 and La PEN 0.5 promastigotes when treated with the same associations. Macrophages were infected with parasites of La M2269 and treated with different concentrations of PMD. Our results suggest that high concentrations of PMD (17.5uM) were toxic against macrophages and showed low activity when used against La M2269 amastigotes within 72 hours of incubation. We observed that by extending the incubation to 120 hours, concentrations below 1uM PMD reduced the infection rate to approximately 30%. When analyzing the effect of the combinations of the pentamidine and the verapamil we observed low activities of these drugs when combined, possibly indicating an indifferent / antagonistic interaction. The association of pentamidine with amphotericin B against amastigotes of La M2269 was evaluated by the isobologram method and the nature of the interaction was classified as indifferent because it presented a FIC = 0.65.

A espécie Leishmania (Viannia) shawi foi caracterizada recentemente pelo grupo de Lainson. Estudos recentes indicam o importante papel médico epidemiológico deste parasito no Brasil. Portanto, os objetivos do presente estudo foram caracterizar o modelo experimental murino desta infecção, purificar antígenos protéicos e avaliar seus graus de proteção após desafio. Para caracterizar o modelo murino de infecção, camundongos das linhagens BALB/c e C57BL/6 foram infectados na pata com formas promastigotas e os achados histopatológicos e imunológicos foram avaliados durante a evolução da infecção. Para os estudos de imunização foram utilizados 10 diferentes antígenos: três secretados/excretados pelas formas promastigotas de L. (V.) shawi, dois intracelulares solúveis das formas amastigotas (AgAma) e promastigotas (AgPro), e cinco frações protéicas purificadas a partir do antígeno intracelular solúvel das formas promastigotas. Estes antígenos foram utilizados para imunizar camundongos da linhagem BALB/c duas vezes, subcutaneamente no dorso. Após uma semana da última imunização, os animias foram desafiados com formas promastigotas. O desenvolvimento das lesões nos animais foram acompanhadas por seis ou oito semanas pós desafio (PD), quando os animais foram sacrificados para análise da carga parasitária e dos aspectos relacionados às respostas imune celular e humoral. Camundongos da linhagem BALB/c foram altamente susceptíveis à infecção, uma vez que as mudanças histopatológicas e da imunidade humoral foram mais pronunciadas nos camundongos BALB/c que em C57BL/6. Os antígenos secretados/excretados de baixa massa molecular induziram alta taxa de proteção em comparação aos animais não imunizados, já os antígenos secretados/excretados de média massa molecular protegeram intermediariamente os animais, possivelmente pela alta expressão de IFN-g e IL-4 nos linfócitos T CD8+. AgAma e AgPro tiveram uma resposta antagônica nos animais, pois o AgAma suprimiu a produção de IFN-g e IL-12, contudo houve maior produção de TGF-b, facilitando o aumento do parasitismo na pele e em linfonodos. A despeito da detecção de TGF-b nos animais imunizados com AgPro, houve um balanço entre a produção de citocinas, com a participação de IL-12 e IFN-g, que levou a um controle do parasitismo em pele. Através da purificação do AgPro foi visto que os antígenos F1 e F5 protegeram os animais da infecção na pele após desafio, e ainda F1 também protegeu os linfonodos destes animais. Os antígenos F3 e F4 levaram a exacerbação das lesões de pele. A identificação, por espectrometria de massa, do antígeno F1 revelou a presença de 67 componentes, sendo que a maioria deles não possui identificação. Ainda, o antígeno F1 protegeu duradouramente os animais associado à estimulação de linfócitos T CD8+ de memória, contudo a presença de baixos números de parasitos pode ser o reflexo da alta produção de IL-10. Estes dados indicam que o antígeno F1 pode representar um importante candidato vacinal contra a Leishmaniose Tegumentar Americana / Leishmania (Viannia) shawi specie was recently characterized by Lainson group. Currently, studies indicate important medical and epidemiological role of this parasite in Brazil. Therefore, the aims of this study were to characterize the experimental murine model of this infection, purify proteic antigens and evaluate their protection degrees after challenge. To characterize the murine model of infection, BALB/c and C57BL/6 mice were infected in the footpad with promastigote forms, and the histopathological and immunological findings were evaluated during the evolution of infection. For the immunization studies, 10 different antigens were used, as follow: three released/excreted by promastigote forms of L. (V.) shawi; two intracellular soluble antigens from amastigote (AgAma) and promastigote forms (AgPro), and 5 proteic fractions purified from soluble intracellular antigens from promastigote forms. These antigens have been used to immunize BALB/c mice twice, subcutaneously in the rump. After 1 week of last immunization, the animals were challenged. The lesion developments in animals were followed during either six or eight weeks post-challenge (PC), when the animals were sacrificed to evaluate the parasite load and aspects of cellular and humoral immune responses. BALB/c mice were the most susceptible to L. (V.) shawi infection, since the histopathological and humoral changes were higher in BALB/c than C57BL/6 mice. Secreted/excreted antigens of low molecular mass induced high protection rate compared to non-immunized mice, already mice immunized with secreted/released antigens of medium molecular mass showed mild protection, possibly caused by high expression of IFN-g and IL-4 by CD8+ T lymphocytes. AgAma and AgPro showed antagonic response in animals, since AgAma suppressed the IFN-g and IL-12 production, however high level of TGF-b has been detected, allowing the increasing of parasitism in the skin and lymph nodes. In spite of the detection of TGF-b in AgPro-immunized mice, there was a balance in the cytokines production, with the participation of IFN-g and IL-12, leading to parasite control in skin. Through the purification of AgPro, it was observed a protective effect of F1 and F5 antigens in the skin after challenge; in addition, F1 also protected the lymph nodes of BALB/c mice. Both F3 and F4 antigens exacerbated the skin infection. The identification, by mass spectrometry, revealed that F1 was composed by 67 components, and the majority has not been identified till now. Moreover, F1 induced long-lasting immunity in BALB/c mice, associated to generation of memory CD8+ T lymphocytes, however low parasitism could be the reflect of high production of IL-10. These data indicate which F1 antigen could be an important vaccine candidate against American Tegumentar Leishmaniasis

A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é causada por várias espécies de protozoários do gênero Leishmania e compreende um grupo de doenças que apresentam características clínicas, histopatológicas e imunológicas distintas. O diagnóstico é realizado em base epidemiológica, clínica e patológica, confirmadas por exames parasitológicos positivos e demonstração de hipersensibilidade retardada a antígeno de leishmânia. Os testes sorológicos para o diagnóstico, utilizados até o momento, apresentam várias limitações e por isso é de grande importância identificar proteínas recombinantes de leishmânia, para que sejam testadas como potenciais antígenos para o desenvolvimento de técnicas para o diagnóstico da LTA. Neste estudo, foram utilizadas duas proteínas recombinantes de leishmânia altamente conservadas, Lb8E e Lb6H, derivadas de Leishmania (Viannia) braziliensis (Lb), avaliando a sua capacidade para detectar anticorpos no soro de vários grupos de pacientes por teste imunoenzimático (ELISA). Os antígenos recombinantes reagiram com amostras de 83,3% e 100,0% (Lb6H) dos pacientes com LTA e 95,4% (Lb8E) e 89,4% (Lb6H) dos soros de pacientes de leishmaniose visceral (LV). Em amostras de indivíduos saudáveis, as reações com Lb8E e Lb6H foram altamente específicas. Soros de 219 pacientes com LTA infectados com diferentes espécies de leishmânia prevalentes no Brasil (Leishmania (Leishmania) amazonensis, L. (Viannia) braziliensis, L. (V.) guyanensis e L. (V.) shawi) e amostras de pacientes com outras infecções parasitárias foram avaliados para a presença de anticorpos anti-rLb6H, obtendo-se sensibilidade de 100,0% nas 219 amostras de LTA e especificidade geral de 93,9% (considerando 68 indivíduos saudáveis e 213 pacientes com outras doenças infecciosas). Além disso, as amostras de outras doenças infecciosas indicaram provável ausência de reação cruzada, pois apenas uma minoria de amostras de pacientes com doença de Chagas possuía anticorpos contra rLb6H e essas respostas foram baixas. Enfim, os resultados obtidos sugerem que a técnica de ELISA utilizando o antígeno rLb6H pode ser consideradoa para uso na rotina do diagnóstico sorológico da LTA. / American tegumentary leishmaniasis (ATL) is caused by various species of protozoan of the genus Leishmania and comprises a group of diseases that present distinct clinical, histopathological and immunological characteristics. The diagnosis is performed based on epidemiological, clinical and pathological features, supported by positive parasitological tests and presence of delayed hypersensitivity to Leishmania antigens. The serological tests used to date have several limitations and therefore it is of great importance to identify recombinant proteins from Leishmania so that they can be tested as potential antigens for the development of techniques for the diagnosis of ATL. In this study, two highly conserved Leishmania recombinant proteins, Lb8E and Lb6H, derived from Leishmania (Viannia) braziliensis (Lb), were used, evaluating their ability to detect antibodies in the serum of several groups of patients by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Recombinant antigens detected 83.3% (Lb8E) and 100.0% (Lb6H) ATL patients, and 95.4% (Lb8E) and 89.4% (Lb6H) visceral leishmaniasis (VL) patients. These reactions with Lb8E and Lb6H were highly specific in healthy subjects. Sera from ATL patients infected with different species of Leishmania, prevalent in Brazil, (Leishmania (Leishmania) amazonensis, L. (Viannia) braziliensis, L. (V.) guyanensis and L. (V.) shawi) and samples from patients with other parasitic infections were evaluated for the presence of anti-rLb6H antibodies. In 219 ATL, the sensitivity was 100.0% e the general specificity, considering 68 healthy subjects and 213 patients with other infectious diseases. In addition, samples from other infectious diseases indicated a probable lack of cross-reactivity, as only a minority of samples from patients with Chagas disease had antibodies against rLb6H and all of these responses were low. Finally, the results suggest that the ELISA using rLb6H antigen may be considered for routine use for serological diagnosis of ATL.

Leishmania braziliensis é o agente responsável pela maior parte dos casos de leishmaniose tegumentar e mucocutânea no Brasil. Entre as espécies incriminadas como vetoras, na região Sudeste encontram-se Nyssomyia intermedia e Nyssomyia neivai. A comprovação destas espécies como responsáveis pela transmissão de Leishmania sp. depende de vários fatores, entre estes, a competência vetorial, definida como a capacidade da espécie se infectar e repassar a infecção para um hospedeiro vertebrado. Objetivo: O presente estudo teve como objetivo avaliar experimentalmente a competência vetorial de Ny. intermedia e Ny. neivai para transmitir L. braziliensis. Métodos: Fêmeas de primeira geração de ambas as espécies foram alimentadas em hamster infectado com L. braziliensis e após a oviposição, desafiados a um segundo repasto sanguíneo em hamsters susceptíveis (limpos). Adicionalmente, foram obtidos dados do desenvolvimento imaturo das duas espécies. Resultados: em relação ao ciclo imaturo, observou-se que a maior mortalidade ocorreu no primeiro instar larval para ambas as espécies, 27,6% para Ny. intermedia e 53,9% para Ny. neivai. O quarto instar larval teve a maior duração, com mediana de 8 a 12 dias. Quanto à susceptibilidade à infecção das fêmeas colonizadas de ambas as espécies 0,89% das fêmeas de Ny. intermedia e 8,33 % das fêmeas de Ny. neivai apresentaram infecção por L. braziliensis. Nenhuma fêmea de Ny. intermedia realizou um segundo repasto sanguíneo, enquanto que 3 fêmeas de Ny. neivai realizaram. Destas, duas estavam infectadas e o hamster potencialmente infectado ficou em observação por dois meses. Amostras de tecido do hamster exposto demostraram, por meio de PCR, a presença de L. braziliensis. Conclusão: Nyssomyia intermedia apresentou desenvolvimento de formas flageladas porém não repassou a infecção a um hospedeiro suscetível. Nyssomyia neivai, além de se infectar com a L. braziliensis, também repassou a infecção a um hospedeiro suscetível, demostrando assim sua competência vetora. / Leishmania braziliensis is the agent related to cases of cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis in Brazil. Among the sandflies involved in the Leishmania sp transmission in the Southeast Region, Ny. intermedia and Ny. neivai are suspected vectors. However, the incrimination of these species as vectors in the transmission of Leishmania sp. depends of several factors, including vector competence, defined as the ability of the species to develop the agent and transmit it to a vertebrate host. Objective: The present study aimed to demonstrate the vector competence to Ny. intermedia and Ny. neivai for L. braziliensis. Methods: To develop the experiments,specimens of both species were reared under laboratory conditions and the adults obtained were used to evaluate the vector competence. Thefemales were fed in infected hamsters and after oviposition, challenged to take a bloodmeal in suscetible hamsters (without infection). All females fed on infected hamster were dissected. The hamster bitted in the exposition were follow up for two months, after that, were euthanatized to evaluate the infection by PCR. Result: The highest immature mortality occurred in the first instar larval for both species, 27.6% for Ny. intermedia and 53.9% for Ny. neivai. The fourth larval instar had the longest duration, with a median varying between 8 to 12 days. About the females of Ny intermedia, only 0.89% of them develop the flagellates. For Ny. neivai, among 36 females feed on infected hamster, 2 were infected. None female of Ny intermedia take a second blood meal and 3 of Ny. neivai have had. The hamsters bitted by the infected females were follow up for 60 days. After that the hamster were euthanatized and the infection was observed. Conclusion: The vector competence of Ny. neivai to transmit Leishmania braziiensis was demonstrated. The susceptibility of Ny. intermedia to develop this leishmania was corroborated.

Introdução: Um dos primeiros sistemas de defesa contra os microrganismos é a via dos receptores Toll-like (TLRs). A ativação destes receptores leva à síntese de citocinas, dando início à resposta imune inata. Em modelos animais, o TLR2, TLR4 e TLR9 parecem estar relacionados com o reconhecimento de antígenos de Leishmania. A relação entre TLRs e leishmânia pode ser um mecanismo chave no desenvolvimento da doença ou no controle da mesma. Até o momento não existem estudos de TLRs na leishmaniose cutânea humana. Objetivo: Determinar o padrão de expressão e as células associadas com o TLR2, TLR4 e TLR9 na leishmaniose cutânea. O objetivo secundário é correlacionar a quantidade de TLRs com a quantidade de citocinas e células inflamatórias na pele. Métodos: Cem biópsias de pacientes com leishmaniose cutânea causadas por Leishmania (V.) braziliensis foram selecionadas inicialmente. Apenas os casos confirmados (presença de amastigotas no raspado, teste de Montenegro positivo, imunoistoquímica com presença de antígenos de Leishmania e reação em cadeia da polimerase com DNA de Leishmania (V.) braziliensis foram incluídos. Um grupo controle de pele normal foi incluído para comparação (quatro casos). A expressão de TLR2, TLR4 e TLR9 foi determinada por técnica imunoistoquímica, da mesma forma que os fenótipos celulares (células NK, macrófagos, células dendríticas, células CD4 e CD8) e citocinas (IL-1, IL-6, IL-12, TNF-alfa, IFN-gama). Dupla-marcação foi realizada para identificar as células que expressaram os TLRs analisados. Análise semi-quantitativa foi utilizada para avaliação da expressão de TLRs na epiderme, enquanto na derme foi realizada análise quantitativa. O nível de significância foi estabelecido com p<0,05. Resultados: Doze casos preencheram os critérios de inclusão. Os pacientes eram todos masculinos, com lesões apenas em membros inferiores e mediana de idade de 23 anos [16-47]. A expressão de TLR2, TLR4 e TLR9 na epiderme da pele normal foi alta. Quando comparados com pele normal, tanto TLR4 quanto TLR2 mostraram menor expressão no epitélio dos pacientes com leishmaniose e não houve expressão de TLR9. A média de células expressando TLR2 na derme foi de 136,36±82,46 células/mm2, ao passo que a média de células expressando TLR4 foi de 3,21±4,11 células/mm2. A contagem de TLR9 foi de 86,15±88,36 células/mm2 predominando em áreas de formação de granulomas. A regressão linear não demonstrou relação entre a contagem de células marcadas ou citocinas com TLR2 ou TLR4. O aumento proporcional da expressão de TLR9 relacionou-se com maior expressão de IL-12 e IL-4 (p < 0,05). A dupla marcação demonstrou que os macrófagos expressaram TLR2. A dupla marcação não mostrou expressão de TLR2 nas células dendríticas e nas células NK. Conclusão: A leishmaniose cutânea localizada associa-se com a presença de TLR2, TLR4 e TLR9. No epitélio a expressão de TLR2 e TLR4 em pacientes com leishmaniose está diminuída em relação aos pacientes controles. A expressão do TLR2 na derme é estatisticamente maior que a de TLR4 e TLR9, a qual é expressa pelos macrófagos. A expressão de TLR9 ocorre principalmente nas áreas de granulomas havendo relação com a expressão de IL-12 e IL-4 / Introduction: One of the first systems of defense against microorganisms is the Toll-like receptors (TLRs) pathway. The activation of these receptors promotes the cytokine synthesis, initiating the innate immune response. In animal models, TLR2, TLR4 and TLR9 appear to be related to the recognition of antigens of Leishmania. The relationship between TLRs and Leishmania can be a key mechanism in the development of the disease or it control. Until now, there are not studies about TLRs in human cutaneous leishmaniasis. Objective: To determine the expression pattern and the cells associated with TLR2, TLR4 and TLR9 in cutaneous leishmaniasis. The secondary objective is to correlate the amount of TLRs with the amount of cytokines and inflammatory cells. Methods: One hundred biopsies from patients with cutaneous leishmaniasis caused by Leishmania (V.) braziliensis were initially selected. Only confirmed cases of cutaneous leishmaniasis were included in the analysis (presence of amastigotes in the scraping, positive Montenegro test, immunohistochemistry with the presence of Leishmania antigens and polymerase chain reaction with DNA from Leishmania (V.) braziliensis. A control group (4 cases) of normal skin was included for comparison. The expression of TLR2, TLR4 and TLR9 was determined by immunohistochemistry, as well as cell phenotypes (NK cells, macrophages, dendritic cells, CD4 and CD8) and cytokines (IL-1, IL-6, IL-12, TNF-alpha, IFN-gamma). Double-staining was used to determine the cells expressing TLRs. Semi-quantitative analysis was used for evaluation of the expression of TLRs in the epidermis. Quantitative analysis was performed to evaluate the expression in the dermis. The level of significance was defined as p <0.05. Results: 12 cases fulfilled inclusion criteria. The patients were all male, with lesions in lower limbs and median age of 23 years [16-47]. The expression of TLR2 and TLR4 in the epidermis of normal skin was high. When compared with normal skin, TLR2 and TLR4 showed lower expression in the epidermis. There was no expression of TLR9 in the epidermis in cases of cutaneous leishmaniasis and normal skin. The mean number of cells expressing TLR2 in the dermis was 136.36±82.46 cells/mm2, while the average of cells expressing TLR4 was 3.21±4.11 cells/mm2. The count of TLR9 was 86.15±88.36 cells/mm2, and it was found mainly in the areas of granuloma formation. Linear regression showed no relationship between the number of labeled cells or cytokines with TLR2 or TLR4. There was an association between TLR9 and two cytokines (IL-12 and IL-4). This correlation suggested that the proportional increase in the expression of TLR9 was related to greater expression of IL-12 and IL-4 (p<0.05). The double staining showed that macrophages and endothelial cells expressed TLR2. The double staining showed no expression of TLR2 in dendritic cells and NK cells. Conclusion: The localized cutaneous leishmaniasis associated with the presence of TLR2, TLR4 and TLR9. The expression of TLR2 in the dermis was statistically greater than that of TLR4 and TLR9, which is expressed by macrophages. The expression of TLR9 occurs primarily in the areas of granulomas was associated with the expression of IL-12 and IL-4

As doenças tropicais negligenciadas (DTNs) causam um imenso sofrimento para a pessoa acometida e em muitos casos podem levar o indivíduo a morte. Elas representam um obstáculo devastador para a saúde e continuam a ser um sério impedimento para a redução da pobreza e desenvolvimento socioeconômico. Das 17 doenças desse grupo, a leishmaniose, incluindo a leishmaniose cutânea, tem grande destaque devido sua alta incidência, os gastos para o tratamento e as complicações geradas em processos de coinfecção. Ainda mais agravante, os investimentos direcionados ao controle, combate e principalmente a inovação em novos produtos é ainda muito limitado. Atualmente, a academia tem um importante papel na luta contra essas doenças através da busca de novos alvos terapêuticos e também de novas moléculas com potencial terapêutico. É nesse contexto que esse projeto teve como meta a implantação de uma plataforma para a identificação de moléculas com atividade leishmanicida. Como alvo terapêutico, optamos pela utilização da enzima diidroorotato desidrogenase de Leishmania Viannia braziliensis (LbDHODH), enzima de extrema importância na síntese de novo de nucleotídeos de pirimidina, cuja principal função é converter o diidroorotato em orotato. Esta enzima foi clonada, expressa e purificada com sucesso em nosso laboratório. Os estudos permitiram que a enzima fosse caracterizada cineticamente e estruturalmente via cristalografia de raios- X. Os primeiros ensaios inibitórios foram realizados com o orotato, produto da catálise e inibidor natural da enzima. O potencial inibitório do orotato foi mensurado através da estimativa do IC50 e a interação proteína-ligante foi caracterizada através de estudos cristalográficos. Estratégias in silico e in vitro foram utilizadas na busca de ligantes, através das quais foram identificados inibidores para a enzima LbDHODH. Ensaios de validação cruzada, utilizando a enzima homóloga humana, permitiram identificar os ligantes com maior índice de seletividade que tiveram seu potencial leishmanicida avaliado in vitro contra as formas promastigota e amastigota de Leishmania braziliensis. A realização do presente projeto permitiu a identificação de uma classe de ligantes que apresentam atividade seletiva contra LbDHODH e que será utilizada no planejamento de futuras gerações de moléculas com atividade terapêutica para o tratamento da leishmaniose. Além disso, a plataforma de ensaios otimizada permitirá a avaliação de novos grupos de moléculas como uma importante estratégia na busca por novos tratamentos contra a leishmaniose / Neglected tropical diseases (NTDs) pose a devastating obstacle to health and remain a serious impediment to poverty reduction and socioeconomic development. Of 17 diseases listed among NTDs, the leishmaniasis, including cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis, are characterized by high number of cases and high costs for the treatment, usually of low efficacy and highly toxic. Even more problematic, the investment devoted to combat to control and to develop new therapies remains limited. Nowadays, the Academy has had an important role in the fight against NTDs, contributing in the search of new therapeutic targets and in the development of lead compounds. Within this context, the present project aimed the development of a pipeline for identification of leishmanicidal compounds based on the selective inhibition of the enzyme dihydroorotate dehydrogenase from Leishmania Viannia braziliensis (LbDHODH). LbDHODH acts in the de novo biosynthetic pathway of pyrimidine nucleotides, by catalysing the conversion of dihydroorotate to orotate and has been considered an important macromolecular target against proliferative and parasitic diseases. LbDHODH was successfully cloned, expressed and purified. The target enzyme was characterized by kinetic studies and its structure was solved by X-ray crystallography techniques. Inhibition assays were performed in presence of orotate, product of catalysis and natural inhibitor of DHODH. Its inhibitory potential was evaluated by the estimative of IC50 and the protein-ligand interaction was characterized by crystallographic studies. In silico and in vitro strategies were used in the search for LbDHODH inhibitors. Cross-validation studies were performed against the human homologue enzyme. Inhibitors displaying higher selectivity index were evaluated against both promastigote and amastigote forms of Leishmania braziliensis. Our work allowed the identification of a new class of compounds that display selective inhibition of LbDHODH and show leishmanicidal activity. They will be used as prototypes for the development of new generations of LbDHODH inhibitors. Moreover, our pipeline can be used to screen large number of chemical libraries as tool for the identification of different chemical entities that can contribute to the development of new therapeutic strategies for the treatment of leishmaniasis.

Doenças negligenciadas acometem milhares de pessoas em todo o mundo, principalmente em países subdesenvolvidos. A exemplo destas encontram-se doenças como a leishmaniose e a doença de Chagas que representam relevantes problemas de saúde pública. As terapias disponíveis para estas doenças tropicais, contudo, estão longe de serem satisfatórias e eficazes, considerando-se que os quimioterápicos existentes apresentam reconhecida toxicidade, alto custo e eficácia moderada. Com o propósito de obter alternativas terapêuticas otimizadas, este projeto de pesquisa teve como objetivo a obtenção de pró-fármacos de compostos nitroderivados com comprovada atividade leishmanicida e antichagásica para serem utilizados em sistemas ADEPT visando maior eficácia e menor toxicidade no tratamento destas parasitoses. A princípio, duas frentes de trabalho em paralelo foram adotadas: uma teórica, para determinação do mecanismo catalítico da carboxipeptidase G2 (CPG2) e obtenção de informações relacionadas ao mecanismo de clivagem dos pró-fármacos propostos, e a outra sintética, para obtenção dos compostos propriamente ditos. Estudos teóricos de ancoramento e dinâmica molecular da CPG2 com um de seus reconhecidos substratos, o metotrexato, indicaram que o mecanismo de ação proposto para metaloproteases em geral também pode ser aplicado a esta enzima. Informações relacionadas ao mecanismo de clivagem dos pró-fármacos propostos também foram obtidas. A rota sintética inicialmente proposta para a obtenção dos pró-fármacos partia da ligação dos nitroderivados ao ácido glutâmico por intermédio de um agente espaçante, o ácido succínico. Com base nas informações obtidas nos estudos teóricos, entretanto, o projeto foi reformulado focando-se na síntese dos pró-fármacos sem agente espaçante, pois estes se mostraram mais favoráveis ao reconhecimento pela enzima. Com relação à síntese, a obtenção dos compostos planejados não foi alcançada a despeito dos esforços empreendidos. Estudos teóricos e experimentais de reatividade parecem comprovar a tese de que o grupo nitro desativa as funções nucleofílicas das estruturas dos nitrocompostos que seriam fundamentais para as reações de acoplamento ao transportador ácido glutâmico. Este achado, contudo, constitui um importante problema a ser solucionado, visto que nitroderivados parecem exercer suas atividades principalmente mediante redução do grupo nitro e produção de espécies reativas de oxigênio nas redondezas dos parasitas. / Neglected diseases affect millions of people around the world for the most part in underdeveloped countries. Leishmaniasis and Chagas disease are example of important public health problems spread through Africa, Asia and Latin America. Unfortunately, currently available chemotherapy to treat these diseases remains ineffective, being the most frequently applied drugs toxic, expensive and of moderate potency. By considering this actual picture and envisioning new therapeutic alternatives, the aim of this work was to design and synthesize potential antichagasic and antileishmanial prodrugs of nitroderivatives to be used in Antybody-Directed Enzyme Prodrug Therapy (ADEPT), a drug design approach which results in targeted delivery of the active compounds, increasing their potencies in addition to lowering their toxicity. Theoretical studies to determine the catalytic mechanism of the carboxypeptidase G2 (CPG2) and to obtain information about the cleavage mechanism of proposed prodrugs were performed whereas different synthetic approaches were made to obtain the compounds. Docking and molecular studies of the CPG2 considering theoretical interactions with its known substrate, methotrexate, indicated that the proposed general mechanism for metalloproteases could be indeed applied to this enzyme. Information about the cleavage mechanism of prodrugs was also obtained. Initially prodrugs proposed were composed by nitroderivatives structures attached to glutamic acid, the chosen transporter agent, by a spacer group, the succinic acid. Theoretical studies, however, had showed that prodrugs constructed without a spacer agent could be better recognized by the enzyme. These results re-directed the synthetic approach to new prodrug structure without spacer. Despite all efforts spent, it was impossible to obtain the proposed prodrug structures. Experimental reactivity studies were then accomplished, since it was possible that the nitro group, from nitroderivatives structure, was able to reduce the nucleophilic power of particular functional groups chosen to accomplish the coupling between the active compound and the transporter. The results corroborate this hypothesis and the absence of nitro group facilitates the prodrug synthesis. This, however, constitute an important problem to be solved since the nitroderivative seams to exert their function mainly by nitro group reduction and production of free radical species in the surrounding of the parasites.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2014-09-26T20:15:20Z No. of bitstreams: 2 Clayson Gomes - 2012 - dissertação.pdf: 1729605 bytes, checksum: 48dd1bd05f0e954a3dd14fb20b162e2f (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2014-09-26T21:28:37Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Clayson Gomes - 2012 - dissertação.pdf: 1729605 bytes, checksum: 48dd1bd05f0e954a3dd14fb20b162e2f (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-09-26T21:28:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Clayson Gomes - 2012 - dissertação.pdf: 1729605 bytes, checksum: 48dd1bd05f0e954a3dd14fb20b162e2f (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2012-02-03 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Introduction: Leishmaniasis is a tropical zoonoses that is endemic, causing different clinical forms including cutaneous, diffuse, disseminated, mucosal and visceral manifestations. The L. (V.) braziliensis is the most common parasite found in cutaneous leishmaniasis in Brazil and is the major agent for the mucosal leishmaniasis. The manifestation of the disease and the clinical forms are dependent on several factors related between the parasite and host. Objective: The aim of this study was to compare the ability of amastigote parasite isolated from patients with cutaneous or mucosal leishmaniasis to stimulate the production of cytokines in peripheral blood mononuclear cells cultures (PBMC) obtained from health donors. Methods: Isolates of patients with cutaneous or mucosal lesion were inoculated in IFNγ knockout mice to obtain amastigotes, which were purifyed by density using Percoll. The PBMCs from healthy individuals were separated by density using Ficoll. The cells were incubated in cultures at different times with amastigotes and then the supernatant were collect to quantify cytokines by ELISA or cells that are used to quantify cytokines using the real time PCR. Results: PBMCs produced higher amounts of IL-1β, IL-6, IL-10 and TGFβ in cultures after stimulation with amastigotes than uninfected controls. When comparing isolates from cutaneous or mucosal disease it was not found differerence regarding to the production of IL-6, IL-10 and TGFβ, but amastigotes from patients with cutaneous leishmaniasis induced more IL-1β than in parasites obtained from mucosal lesion. Production of IFNγ IL17, and TNF was was not detected at different times after stimulation with L. (V.) braziliensis amastigotes. Conclusion: The results suggest that amastigotes of patients with cutaneous leishmaniasis interact with innate immunity cells by inducing the production of proinflammatory or anti-inflammatory and isolated from mucosal lesions induce less IL-1 than parasites obtained from skin lesions. The greatest amount of IL-1 promotes an inflammatory response with migration of cells to the site of infection, so a low xvii production would cause a slower disease and would prejudice an effective acquired response. Thus, the parasite would be able to survive longer in host in a silent way. / Introdução: A leishmaniose é uma zoonose tropical endêmica com diferentes formas clínicas, incluindo as formas cutânea, difusa, disseminada, mucosa e visceral. L. (V.) braziliensis é o parasito mais comumente encontrado na leishmaniose tegumentar no Brasil sendo, o principal agente da leishmaniose mucosa. A manifestação da doença e as formas clínicas existentes são dependentes de diversos fatores relacionados ao parasito e ao hospedeiro. Objetivo: Comparar a habilidade de formas amastigotas isoladas de pacientes com leishmaniose cutânea ou mucosa em estimular a produção de citocinas em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) obtidas de doadores sadios. Métodos: Isolados obtidos de pacientes com lesões cutâneas ou mucosas foram inoculados em camundongos deficientes de IFNγ para obtenção de formas amastigotas, que foram separadas por gradiente de densidade usando o Percoll. As PBMCs de indivíduos sadios foram separadas por gradiente de densidade usando o Ficoll e cultivadas por diferentes tempos com as formas amastigotas. O sobrenadante foi coletado para quantificar as citocinas por ELISA e as células restantes foram lisadas para análise do mRNA para citocinas usando o PCR em tempo real. Resultados: As PBMCs produziram IL-1β, IL-6, IL-10 e TGFβ em culturas após a estimulação com amastigotas. Os isolados de lesões cutâneas produziram quantidades semelhantes de IL-6, IL-10 e TGFβ quando comparados com isolados de lesões mucosas. Formas amastigotas obtidas de pacientes com leishmaniose cutânea induziram uma maior produção de IL-1β do que parasitos obtidos de lesões mucosas. A produção de IFNγ, IL-17, e TNF não foi detectada em todos os tempos avaliados, após a estimulação com amastigotas de L. (V.) braziliensis. Conclusão: Os resultados sugerem que formas amastigotas de pacientes com leishmaniose tegumentar interagem com células da imunidade inata, induzindo a produção de citocinas pró e anti inflamatórias, sendo que isolados oriundos de lesão mucosa induzem menos IL-1 do que parasitos obtidos de lesões cutâneas. A maior quantidade de IL-1 favorece uma resposta inflamatória com a migração de células para xv o local da infecção. Uma baixa produção dessa citocina faria com que a doença fosse mais lenta prejudicando a formação de uma resposta adquirida eficiente. Portanto, o parasito poderia ser capaz de sobreviver por um tempo maior no hospedeiro de uma maneira silenciosa, causando a forma mucosa.