A leishmaniose tegumentar é uma zoonose que ocorre endemicamente em 88 países, caracterizando-se como um grave problema de saúde pública nos países tropicais e subtropicais. Estima-se que o número de pessoas infectadas por Leishmania seja de cerca de 12 milhões e que ocorram entre 700 mil a 1,2 milhões de novos casos anualmente. O Brasil apresenta a maior prevalência de leishmaniose tegumentar na América, sendo que já foram identificadas seis espécies como causadoras de leishmanise tegumentar: Leishmania (Leishmania) amazonensis, Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania (Viannia) guyanensis, Leishmania (Viannia) lainsoni, Leishmania (Viannia) naiffi, Leishmania (Viannia) shawi. Apesar de termos diferentes espécies causadoras de leishmaniose tegumentar no Brasil e com diferentes formas clínicas, a discriminação das espécies de Leishmania responsáveis por determinada lesão ainda é um desafio. Utilizando as técnicas qPCR, HRM e PCR multiplex, com pares de oligonucleotídeos contruídos e direcionados para o gene alvo hsp70, propomos uma alternativa para os ensaios utilizados atualmente para a identificação de Leishmania e diferenciação dos subgêneros Leishmania e Viannia em cultura de promastigota. A identificação do subgênero Leishmania obtida nos nossos resultados em amostras de cepas referência e em amostras de isolados de pacientes com suspeita de leishmaniose tegumentar atendidos no Instituto de Infectologia Emílio Ribas, correspondem ao obtido por PCR-RFLP direcionada para o alvo kDNA com a enzima de restrição HaeIII realizada num estudo anterior. No entanto, este estudo permitiu a identificação do subgênero em apenas um passo, o que contribui para a redução do tempo, custo e manuseio de amostras. Diante desses resultados, sugere-se a validação da técnica em DNA de amostras de amastigotas de lesões tegumentares de pacientes diagnosticados com esta doença / The cutaneous leishmaniasis is a zoonotic disease that is endemic in 88 countries, characterized as a serious public health problem in tropical and subtropical countries. It is estimated that the number of people infected by Leishmania to be about 12 million, occurring between 700 thousand to 1.2 million new cases annually. Brazil has the highest prevalence of cutaneous leishmaniasis in America and six species have been identified as causes of cutaneous leishmaniasis: Leishmania (Leishmania) amazonensis, Leishmania (V.) braziliensis, Leishmania (V.) guyanensis, Leishmania (V.) lainsoni, Leishmania (V.) naiffi, Leishmania (V.) shawi. Although we have different species that cause cutaneous leishmaniasis in Brazil and with different clinical forms, discrimination against Leishmania species responsible for certain injury is still a challenge. Using the techniques qPCR, HRM and multiplex PCR with oligonucleotide engineer to the target gene hsp70, propose an alternative to the currently used assays for Leishmania identification and Leishmania and Viannia subgenus differentiation in parasite promastigote culture. The identification of Leishmania subgenus obtained in our results with parasite promastigote culture of reference strains samples and isolates in patients with suspected tegumentary leishmaniasis attended at the Institute of Infectious Diseases Emilio Ribas, corresponded to that obtained by PCR-RFLP directed to the target kDNA with HaeIII restriction enzyme carried out in a previous study. However, this review allowed the identification of the subgenus in just one step, contributing to the reduction of time, cost and handling of samples. Given these results, we suggest the validation of this technique in DNA of amastigote samples from tegumentary lesions of patients diagnosed with this disease

A leishmaniose tegumentar é uma zoonose que ocorre endemicamente em 88 países, caracterizando-se como um grave problema de saúde pública nos países tropicais e subtropicais. Estima-se que o número de pessoas infectadas por Leishmania seja de cerca de 12 milhões e que ocorram entre 700 mil a 1,2 milhões de novos casos anualmente. O Brasil apresenta a maior prevalência de leishmaniose tegumentar na América, sendo que já foram identificadas seis espécies como causadoras de leishmanise tegumentar: Leishmania (Leishmania) amazonensis, Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania (Viannia) guyanensis, Leishmania (Viannia) lainsoni, Leishmania (Viannia) naiffi, Leishmania (Viannia) shawi. Apesar de termos diferentes espécies causadoras de leishmaniose tegumentar no Brasil e com diferentes formas clínicas, a discriminação das espécies de Leishmania responsáveis por determinada lesão ainda é um desafio. Utilizando as técnicas qPCR, HRM e PCR multiplex, com pares de oligonucleotídeos contruídos e direcionados para o gene alvo hsp70, propomos uma alternativa para os ensaios utilizados atualmente para a identificação de Leishmania e diferenciação dos subgêneros Leishmania e Viannia em cultura de promastigota. A identificação do subgênero Leishmania obtida nos nossos resultados em amostras de cepas referência e em amostras de isolados de pacientes com suspeita de leishmaniose tegumentar atendidos no Instituto de Infectologia Emílio Ribas, correspondem ao obtido por PCR-RFLP direcionada para o alvo kDNA com a enzima de restrição HaeIII realizada num estudo anterior. No entanto, este estudo permitiu a identificação do subgênero em apenas um passo, o que contribui para a redução do tempo, custo e manuseio de amostras. Diante desses resultados, sugere-se a validação da técnica em DNA de amostras de amastigotas de lesões tegumentares de pacientes diagnosticados com esta doença / The cutaneous leishmaniasis is a zoonotic disease that is endemic in 88 countries, characterized as a serious public health problem in tropical and subtropical countries. It is estimated that the number of people infected by Leishmania to be about 12 million, occurring between 700 thousand to 1.2 million new cases annually. Brazil has the highest prevalence of cutaneous leishmaniasis in America and six species have been identified as causes of cutaneous leishmaniasis: Leishmania (Leishmania) amazonensis, Leishmania (V.) braziliensis, Leishmania (V.) guyanensis, Leishmania (V.) lainsoni, Leishmania (V.) naiffi, Leishmania (V.) shawi. Although we have different species that cause cutaneous leishmaniasis in Brazil and with different clinical forms, discrimination against Leishmania species responsible for certain injury is still a challenge. Using the techniques qPCR, HRM and multiplex PCR with oligonucleotide engineer to the target gene hsp70, propose an alternative to the currently used assays for Leishmania identification and Leishmania and Viannia subgenus differentiation in parasite promastigote culture. The identification of Leishmania subgenus obtained in our results with parasite promastigote culture of reference strains samples and isolates in patients with suspected tegumentary leishmaniasis attended at the Institute of Infectious Diseases Emilio Ribas, corresponded to that obtained by PCR-RFLP directed to the target kDNA with HaeIII restriction enzyme carried out in a previous study. However, this review allowed the identification of the subgenus in just one step, contributing to the reduction of time, cost and handling of samples. Given these results, we suggest the validation of this technique in DNA of amastigote samples from tegumentary lesions of patients diagnosed with this disease

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Belo Horizonte, MG, Brasil / A comunidade indígena Xakriabá, localizada no município de São João das Missões, norte de Minas Gerais/Brasil, tem registrado casos de leishmaniose tegumentar americana (LTA) desde 2001. O presente estudo teve como objetivo descrever os casos identificados desde Junho de 2008 a setembro de 2010 , bem como acompanhar a evolução a evolução clínica dos casos até 12 meses após o fim do tratamento. Os casos suspeitos foram identificados em um levantamento da população e pelos agentes de saúde indígenas. Após a assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, os pacientes foram entrevistados e avaliados clinicamente, e as informações foram registradas em questionários estruturados e pré-codificados. O diagnóstico foi confirmado por testes intradérmicos de reação (IDR), exames parasitológicos ( exame direto, fragmento de biópsia ou aspirado cultura e técnicas moleculares ( PCR- RFLP). Os diagnósticos confirmados foram aqueles que testou positivo para pelo menos um dos testes. Hematológica , testes bioquímicos e eletrocardiograma (ECG) foram realizados antes, durante e no final do tratamento com antimónio pentavalente meglumina. Doses de 15 mg/kg/dia durante 20 dias (leishmaniose cutânea) e 20 mg/kg/dia durante 30 dias ( leishmaniose mucosa) foram utilizados . Entre os 94 pacientes com lesões cutâneas avaliadas, 89 foram confirmados como LTA e 60 tratados e monitorados. os casos vieram de cinco áreas existentes, com maior ocorrência nas áreas conhecidas como "Brejo Mata Fome" (47,5% casos) e "Itapicuru" ( 43,8% dos casos). A distribuição dos casos foi semelhante entre os homens (51,7%) e mulheres (48,3%) . Idade dos pacientes variou de 1 a 72 anos, com a mediana de 18 anos. Os casos ocorreram predominantemente entre os trabalhadores rurais que ganham menos de um salário mínimo. Maioria dos pacientes apresentava lesões atípicas (70,1%) e uma única lesão (60,7%). O tempo entre o início da lesão eo diagnóstico variou de menos de um mês até 72 meses. Não houve contra-indicações para o uso de antimônio pentavalente. Sessenta pacientes foram tratados e, após o 20 º dia, 24 (40,0%) apresentavam lesões que foram completamente epitelizadas enquanto outros apresentaram os parcialmente cicatrizadas. Esses dois grupos foram comparados por características demográficas, co-infecções, número, tamanho, aparência e localização das lesões, tempo de início dos sintomas, infecções bacterianas, uso de medicamentos caseiros ou comerciais, tamanho de endurecimento, a descontinuidade do tratamento , resultados de testes de diagnóstico e genótipos de Leishmania braziliensis. Após 20 dias de tratamento, epitelização completa esteve associada a lesões parcialmente epitelizadas no primeiro exame clínico (OR = 6,5, IC 95 % = 2,0-21,7) e infecção bacteriana (OR = 0,1, IC 95 % = 0,0-0,7) . Uma avaliação realizada 90 dias após o final do tratamento indicou que 44 pacientes (73,3%) apresentaram lesões completamente epitelizadas. Quando estes pacientes foram comparados aos com lesões não-cicatrizadas houve uma associação entre a falha do tratamento e LTA anterior no passado (OR = 8,2, IC 95% = 1,5-46,3), uso de medicação caseira (OR = 7,10 , IC 95 % = 1,6-71,9) e tempo de início dos sintomas superior a 8 meses (OR = 6,3, IC95% = 1,1-36,7). Seis ( 10%) recidivas foram observados casos. Entre os 60 pacientes tratados, 35 não havia completado um ano de monitoramento, no momento da análise de dados. Esperamos que com este estudo possa ampliar o conhecimento a respeito de LTA e contribuir para a melhoria do diagnóstico e tratamento da a doença na comunidade indígena Xakriabá. / The Xakriabá indigenous community located in the municipality of São João das Missões, north of Minas Gerais has recorded, since 2001, cases of American cutaneous leishmaniasis (ACL). This study aimed to describe the cases identified from June 2008 to September 2010, as well as treat and monitor their clinical course for 12 months after the end of treatment. Suspected cases were identified in a population survey and by indigenous health agents. After signing the Informed Consent Form, patients were interviewed and clinically evaluated, and the information was recorded in structured and pre-coded questionnaires. The diagnosis was confirmed by intradermal reaction assays (IDR), parasitological exams (direct examination, fragment from biopsy or aspirate culture and molecular techniques (PCR-RFLP). The confirmed diagnoses were those which tested positive for at least one of the tests. Hematological, biochemical and electrocardiographic (ECG) tests were performed before, during and at the end of treatment with pentavalent antimony Meglumine. Doses of 15 mg / kg / day for 20 days (cutaneous leishmaniasis) and 20 mg / kg / day for 30 days (mucosal leishmaniasis) were used. Among the 94 patients with skin lesions evaluated, 89 were confirmed as LTA and 60 treated and monitored. The cases came from five existing areas, with higher occurrence in the areas known as “Brejo Mata Fome" (47.5% cases) and "Itapicuru "(43.8% cases). The distribution of cases was similar among men (51.7%) and women (48.3%). Patients’ ages ranged from 1 to 72 years old, with the median of 18. The cases occurred predominantly among rural workers earning less than the minimum wage. Most of the patients presented atypical lesions (70.1%) and a single lesion (60.7%). The time between the onset of injury and diagnosis ranged from less than one month to 72 months. There were no contraindications for using pentavalent antimony. Sixty patients were treated, and after the 20th day, 24 (40.0%) presented lesions which were completely epithelialized while others presented partially healed ones. These two groups were compared for demographic characteristics, co-infections, number, size, appearance and location of lesions, time of onset of symptoms, bacterial infections, use of homemade or commercial medications, size of induration, discontinuation of treatment, results of diagnostic tests and Leishmania braziliensis genotypes. After 20 days of treatment, complete epithelialization was associated with lesions partially epithelialized in the first clinical examination (OR = 6.5, CI 95% = 2.0-21.7) and bacterial infection (OR = 0.1, CI 95% = 0.0-0.7). An evaluation carried out 90 days after the end of the treatment indicated that 44 patients (73.3%) presented completely epithelialized lesions. When these patients were compared to the nonhealed ones, there was an association between treatment failure and previous LTA in the past (OR = 8.2, IC 95% = 1.5-46.3), use of homemade medication (OR = 7.10, CI 95% = 1.6-71.9) and time of onset of symptoms greater than 8 months (OR = 6.3, CI95%= 1.1-36.7). Six (10%) relapses cases were observed. Among the 60 patients treated, 35 had not completed one year of monitoring at the time of data analysis. The objective of this study is to expand knowledge regarding LTA and to contribute to improving the diagnosis and treatment of the disease in the Xakriabá indigenous community.

Made available in DSpace on 2016-07-01T12:20:41Z (GMT). No. of bitstreams: 2 906.pdf: 1335777 bytes, checksum: 47b1473cd090edd0a2c8273edb76d8b6 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2000 / Made available in DSpace on 2016-07-05T22:00:02Z (GMT). No. of bitstreams: 3 906.pdf.txt: 117789 bytes, checksum: 173535bf38187be37f57fe698f585adb (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 906.pdf: 1335777 bytes, checksum: 47b1473cd090edd0a2c8273edb76d8b6 (MD5) Previous issue date: 2000 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / O controle da leishmaniose depende da disponibilidade de métodos acurados e sensíveis para detecção das espécies de Leishmania. Duas abordagens moleculares foram avaliadas para o diagnóstico de leishmaniose tegumentar americana (LTA) em pacientes provenientes de zonas endêmicas de Pernambuco. Uma delas era gênero específica, enquanto que a outra era específica para o subgênero Viannia. Os limiares de detecção de DNA foram determinados e a sensibilidade e especificidade calculadas, sendo subsequentemente comparadas com outros testes diagnósticos mais convencionais. O limiar de detecção de DNA da PCR específica para o subgênero Viannia foi de 10 fg de DNA total, enquanto que o limiar de detecção para a PCR gênero específica foi de 1 pg de DNA total. Para a definição de caso de LTA adotou-se a presença de critérios clínico-epidemiológicos, associados à positividade em pelo menos um dos seguintes testes: pesquisa direta, exame histopatológico e isolamento por cultura. Dessa forma dos 98 pacientes inicialmente diagnosticados com base puramente clínico-epidemiológica, 87 foram considerados casos de LTA, e utilizados para o cálculo da sensibilidade. Trinta e um pacientes com lesões cutâneas de outras etiologias foram incluídos como controles para o cálculo da especificidade. A PCR gênero específica foi positiva em 60/67 das biópsias de LTA, resultando em uma sensibilidade de 89,6 por cento, enquanto que a PCR específica para o subgênero Viannia foi positiva em biópsias de 82/87 casos de LTA, resultando em uma sensibilidade de 94,3 por cento. Contudo, essas diferenças não foram significantes. Esse dado associado a outros, sugere que apenas o subgênero Viannia tem participação como agente etiológico de LTA em Pernambuco Ambas as PCRs demonstraram 100 por cento de especificidade. O diagnóstico através da pesquisa direta apresentou um percentual de positividade dentre os casos de LTA de 68,2 por cento, o exame histopatológico 89,9 porcento, o isolamento através de cultura 44,0 por cento e a imunofluorescência indireta 81,3 por cento. Visando a utilização em regiões endêmicas com poucos recursos foram realizados alguns experimentos preliminares bem sucedidos com PCR/hibridização com sondas não radioativas. Em conclusão, as abordagens moleculares avaliadas mostraram alta sensibilidade e especificidade, permitindo uma delas o diagnóstico ao nível do subgênero Vianna.

Made available in DSpace on 2011-05-04T12:36:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009 / Embora seja benigna, a leishmaniose tegumentar pode levar a quadros clínicos mais graves quando não tratada, com o acometimento das mucosas naso-buco-faríngeas e conseqüências psicológicas, sociais e econômicas sérias para esses indivíduos e suas famílias. Ressalta-se a necessidade de se buscar conhecer os fatores que levam pessoas a abandonarem o tratamento disponibilizado gratuitamente pelo Ministério da Saúde, assim como questionar sobre os possíveis fatores associados aos óbitos atribuídos a LT. Objetivo geral: analisar os fatores associados aos desfechos desfavoráveis do tratamento (abandono e óbito) por leishmaniose tegumentar na Região Sudeste, no período de 2002 a 2006. Material e método: O presente estudo é analítico de abordagem quantitativa, utilizou como fonte de dados as bases contendo os casos de leishmaniose tegumentar do Sistema de Informação de Agravos Notificáveis (SINAN).Foram incluídas as variáveis com um mínimo de 70 por cento de preenchimento. O processo de análise seguiu os seguintes passos: consolidação dos dados, descrição das variáveis, análise dos fatores associados aos desfechos desfavoráveis utilizando a regressão logística múltipla e as redes neurais artificiais e por fim a comparação entre essas duas ferramentas de análise. Resultados: Utilizando a regressão logística múltipla, foram associadas ao abandono do tratamento da leishmaniose tegumentar de acordo com a forma clínica: cutânea - deslocamento, raça negra e recidiva; mucosa - deslocamento do paciente em busca de tratamento e pacientes que moram em cidades com grandes populações, tendo sido identificada uma interação entre essas duas variáveis. Quanto aos óbitos atribuídos a LT, o modelo não se apresentou bem ajustado aos dados quando a idade acima dos 50 anos foi incluída, com isso foram associados: sexo e população pequena. A idade acima de 50 anos foi a única variável relacionada aos óbitos dos pacientes com LT que apresentaram lesões mucosas, mas o modelo não se mostrou bem ajustado. O modelo final com as Redes Neurais Artificiais adicionou as seguintes variáveis ao modelo de regressão logística: 1- abandono do tratamento da LT para aforma clínica: cutânea - municípios com população grande; mucosa - superdosagem e etnia negra. Quanto aos óbitos atribuídos a LT adicionou-se: forma cutânea - idade acima de 50 anos; forma mucosa - superdosagem, etnias indígenas e negra e escolaridade. Comparando os modelos, ambos mostram bom desempenho para praticamente todos os desfechos. Discussão e considerações finais: Os fatores encontrados para o abandono do tratamento e dos óbitos mostram nitidamente a presença das questões socioeconômicas, outras variáveis que não foram incluídas por falta de preenchimento adequado (como exemplo a ocupação dos pacientes) podem corroborar essa conclusão. Os modelos finais da regressão logística e das redes neurais mostraram bom desempenho (percentual de acerto acima de 90 por cento), variando a inclusão de algumas variáveis / indicadores. Este estudo indica a confecção de um programa (software) simples que possa ser utilizado pelas vigilâncias epidemiológicas para predizer os pacientes com maiores chances de abandonar o tratamento da LT. Os modelos para os óbitos precisam ser revistos, com a inclusão de novas variáveis na ficha de investigação e a melhoria do preenchimento. / Although usually not severe, cutaneous leishmaniasis (LT) can lead to more serious clinical pictures when it is not treated. The most common complications are mucocutaneous lesions in noses, mouth and pharynx causing serious psychological, social and economic consequences for the individuals and their families. It is necessary to study the factors that lead people to abandon the treatment, given for free Ministry of Health, as well as question about possible factors related to deaths due to LT. General Objective: analyze factors related to treatment unfavorable outcomes (abandonment and death) by cutaneous leishmaniasis on Southeast Region, from 2002 through 2006. Material and Method: The current study is a quantitative analytic approach, using data bases of cutaneous leishmaniasis from SINAN (Sistema de Informação de Agravos Notifiáveis) as data source. Cases with consistent filling of the selected variables were included. The process of analysis followed the given steps: data consolidation, variables description, analysis of the factors related to unfavorable outcomes using multiple logistic regression and artificial neural networks and finally comparison of both analytical tools. Results: Using multiple logistic regression, the clinical form was related to abandonment of cutaneous leishmaniasis treatment: cutaneous – displacement, black race and recurrence; mucosal – patient displacement searching treatment and patients living in huge population cities, with interaction been indentified between these two variables. As for the deaths assigned to LT, the model did not appear well adjusted to the data when the age above 50 years was included, therefore, were associated: gender and small population. Age was the only variable related to deaths of patients with LT that showed mucosal lesions, but the model was not significant. The final model with the Artificial Neural Networks added the following variables to the logistic regression model: 1 - abandonment of the treatment of LT for clinical forms: cutaneous - cities with large populations; mucosal - overdose and black ethnicity. As for deaths attributed to LT, added: cutaneous form - age over 50 years; mucosal form - overdose, black and indigenous ethnicity and education. Comparing the models, both show good performance for almost all outcomes. Discussion and final considerations: The factors found for the abandonment of treatment and deaths show the presence of socioeconomic issues. Other variables that were not included for lack adequate filling (for example the occupation of the patients) could corroborate for this conclusion. The final logistic regression models and neural networks showed good performance (percentage of accuracy above 90%), varying the inclusion of some variables / indicators. This study shows the preparation of a simple program (software) that can be used by the epidemiological surveillance to predict patients more likely to leave the treatment of LT. The models for the deaths need to be reviewed, with the inclusion of new variables in the research form and improvement of fulfillment.

A caracterização de sequências codificadoras presentes nas vizinhanças do gene META 1 permitiu a identificação de alguns genes expressos preferencialmente em estágios infectivos de L. (L.) amazonensis. Um dos genes presentes é regulado de forma distinta, observando-se maior abundância do RNA em formas amastigotas. Este gene foi denominado LaLRR17 por codificar uma proteína contendo em sua região central 6 repetições ricas em leucina (LRR). As LRR são motivos presentes em diversas famílias de proteínas e são responsáveis pela formação de uma estrutura capaz de estabelecer interações protéicas. A região central da proteína LRR17 apresentou similaridade com a porção carboxi-terminal da proteína NOD 3 humana. A proteína LRR17 foi localizada no citosol de macrófagos infectados com L. (L.) amazonensis. Para caracterizar a função da proteína LRR17 foram obtidas linhagens de L. (L.) amazonensis expressoras do gene LmjLRR17. Essas linhagens mutantes foram mais infectivas em macrófagos in vitro quando comparadas com a linhagem selvagem. Avaliamos também o papel das proteínas NOD 1 e NOD 2 na infecção por L. (L.) amazonensis e L. (L.) major para estabelecer a possível relação da proteína LRR17 na interação com essas vias de defesa celular do macrófago. / The characterization of coding sequences in the vicinity of the META 1 gene allowed the identification of some genes preferentially expressed in L. (L.) amazonensis infective stages. One of the identified transcripts presents a distinct pattern of expression with higher levels of mRNA in amastigotes. This gene was named LaLRR17 since it encodes a 72 kDa protein with 6 leucine-rich repeats (LRR) in its central region. Leucine-rich repeats (LRR) are present in several families of proteins and are responsible for the formation of a structure capable of establishing protein interactions. The central region of the LRR17 protein showed similarity with the carboxyl-terminal portion of the NOD 3 human protein. The LaLRR17 protein is secreted to the cytoplasm of L. (L.) amazonensis-infected macrophages. To characterize the function of the LRR17 protein we obtained strains of L. (L.) amazonensis expressing the LmjLRR17 gene. These mutant strains were more infective to macrophages in vitro when compared with the wild type strain. We also evaluated the role of NOD 1 and NOD 2 proteins in infections with L. (L.) amazonensis and L. (L.) major to investigate a possible role of the LRR17 protein in the interaction with these defense pathways in macrophages.

Made available in DSpace on 2012-09-06T01:12:03Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 157.pdf: 1283280 bytes, checksum: 5a67dedd4e379d7321d874f0d661ce18 (MD5) Previous issue date: 1998 / Durante os anos 50, houve uma epidemia de peste bubônica no Brasil. Em busca do reservatório, cerca de 60.000 roedores foram coletados, examinados e taxidermizados. Todos os animais foram arquivados no Museu Nacional do Rio de Janeiro. Como muitos roedores eram de áreas onde a leishmaniose e a peste eram concomitantes, decidimos investigar se esses animais poderiam ser reservatório de Leishmania. Examinamos um total de 20 animais de Baturité, Ceará, e 19 da Ilha Grande, Rio de Janeiro. Essas duas áreas foram escolhidas por terem história de leishmaniose epidemiologicamente bem estudada. Fragmentos de pele de 1mm3 foram coletados de orelha, cauda e pés de cada animal. Fragmentos de lesao cutânea, presente em três roedores, também foram coletados. O DNA genômico foi isolado, usando-se um kit para isolamento de DNA tecidual. Oligonucleotídeos que se associam à origem de replicaçao das duas fitas das moléculas de minicírculo foram usados em hot start PCR, amplificando a regiao conservada do minicírculo de kDNA. Os produtos amplificados foram analisados pela eletroforese em gel de agarose corado pelo brometo de etídio e visualizados sob luz UV. Todos os produtos foram aplicados em membrana de nylon usando-se aparelho de dot blot e hibridizados com sonda de L. Braziliensis M2903 e L.amazonensis L575. Pela PCR, Leishmania amazonensis foi encontrada L575. Pela PCR, Leismania amazonensis foi encontrada na orelha de dois animais, um Oryzomys subflavus e um Thrichomys apereoides. A hibridaçao com sonda de L. braziliensis foi negativa em todos os casos. Ambos os roedores positivos eram de Baturité. A infecçao por L. amazonenesis é, primariamente, uma zoonose, e pode ser encontrada em grande variedade de hospedeiros entre animais silvestres, inclusive roedores, marsupiais e raposas. Indica a viabilidade de reconstruir a história das leishmanioses pela PCR, o que pode favorecer o entendimento dos eventos históricos que influenciaram a leishmaniose tegumentar americana no Brasil. / During the fifities there was an epidemics of plague in Brazil. Seeking for reservoirs, around 60000 rodents were colected, examined and taxidermized. All animals were stored in the archives of the Nacional Museum of Rio de Janeiro, Brazil. Since many of the rodents were from areas where leishmaniasis was concomitant, we decided to investigate if these animals would be a reservoir for Leishmania. We examined 20 animals from Baturité, Ceará, and 19 from Ilha Grande, Rio de Janeiro. These two areas were chosen because there had been a previous epidemiological study of leishmaniasis. Skin fragments of 1 mm3 from the ear, tail and foot from each animal were collected. In addition, a fragment from a cutaneous lesion, present in three of the animals, was also collected. Genomic DNA was isolated by using the QIAmp tissue kit. Oligonucleotides that anneal to the origin of replication of both strands of the minicircle molecules were used in a hot start PCR, amplifying the conserved region of the minicircle kDNA. The amplified products were analysed by agarose gel eletrophoresis, ethidium bromide staining, and were visualized under UV light. All products were applied to a nylon membrane using a dot-blot apparatus and hybridized with a preamplified product of L. braziliensis M2903 strain or L. amazonensis L575 as probe. Leishmania amazonensis was found by PCR in the ear of two animals, one Oryzomys subflavus and one Thrichomys apereoides. Hybridization with the L. braziliensis probe was negative in all cases. Both animals were from Baturité. L amazonensis infection is primarily a zoonosis, found in a wide range of hosts among wild animals, including rodents, marsupials and foxes. The results of this study indicate that it is likely to reconstruct the history of leishmaniasis by PCR and that it might be possible to understand the historical events that have influenced American leishmaniasis in Brazil.

A caracterização de sequências codificadoras presentes nas vizinhanças do gene META 1 permitiu a identificação de alguns genes expressos preferencialmente em estágios infectivos de L. (L.) amazonensis. Um dos genes presentes é regulado de forma distinta, observando-se maior abundância do RNA em formas amastigotas. Este gene foi denominado LaLRR17 por codificar uma proteína contendo em sua região central 6 repetições ricas em leucina (LRR). As LRR são motivos presentes em diversas famílias de proteínas e são responsáveis pela formação de uma estrutura capaz de estabelecer interações protéicas. A região central da proteína LRR17 apresentou similaridade com a porção carboxi-terminal da proteína NOD 3 humana. A proteína LRR17 foi localizada no citosol de macrófagos infectados com L. (L.) amazonensis. Para caracterizar a função da proteína LRR17 foram obtidas linhagens de L. (L.) amazonensis expressoras do gene LmjLRR17. Essas linhagens mutantes foram mais infectivas em macrófagos in vitro quando comparadas com a linhagem selvagem. Avaliamos também o papel das proteínas NOD 1 e NOD 2 na infecção por L. (L.) amazonensis e L. (L.) major para estabelecer a possível relação da proteína LRR17 na interação com essas vias de defesa celular do macrófago. / The characterization of coding sequences in the vicinity of the META 1 gene allowed the identification of some genes preferentially expressed in L. (L.) amazonensis infective stages. One of the identified transcripts presents a distinct pattern of expression with higher levels of mRNA in amastigotes. This gene was named LaLRR17 since it encodes a 72 kDa protein with 6 leucine-rich repeats (LRR) in its central region. Leucine-rich repeats (LRR) are present in several families of proteins and are responsible for the formation of a structure capable of establishing protein interactions. The central region of the LRR17 protein showed similarity with the carboxyl-terminal portion of the NOD 3 human protein. The LaLRR17 protein is secreted to the cytoplasm of L. (L.) amazonensis-infected macrophages. To characterize the function of the LRR17 protein we obtained strains of L. (L.) amazonensis expressing the LmjLRR17 gene. These mutant strains were more infective to macrophages in vitro when compared with the wild type strain. We also evaluated the role of NOD 1 and NOD 2 proteins in infections with L. (L.) amazonensis and L. (L.) major to investigate a possible role of the LRR17 protein in the interaction with these defense pathways in macrophages.