A mastite um dos grandes problemas relacionados com criação de ovinos de leite devido às perdas econômicas decorrentes da redução na produção, gastos com medicamento e perdas de animais. A Contagem de Células Somáticas (CCS) e o isolamento bacteriano são ferramentas diagnósticas indicativas da saúde da glândula mamária que pode ser determinada através de método automatizado e por método manual, através de contagem celular em microscópio, sobre o qual existem discussões quanto à coloração adequada ao leite de ovelhas devido a celularidade diferenciada nesta espécie. Esta tese compreende três estudos que visam realizar o diagnóstico de mastite subclínica em ovelhas leiteiras do Estado Rio Grande do Sul – Brasil em um total de 315 amostras de leite oriundos de casos desta enfermidade em ovelhas de leite. [Capítulo 2] Foram utilizadas 116 amostras com o objetivo de identificar e validar uma metodologia de CCS microscópica adequada à espécie ovina. Assim foram confeccionadas lâminas de esfregaços de 10 μL de leite em 1 cm2, onde foram testados os fixadores de xilol e solução de Carnoy e as colorações de May-Grünwald (MG), Broadhurst- Paley (BP), Wrigth (W) e Panótico (P). Elegeu-se a solução de Carnoy, pois esta permitiu uma melhor fixação do filme lácteo às lâminas de microscopia, e o corante BP, pois permitiu uma boa coloração e visualização das células, bem como a diferenciação dos corpúsculos citoplasmáticos. Os valores de CCS variaram de 2,6x104 a 4,4x106 células.mL-1 e de 1,9x104 a 8,1x106 células.mL-1, respectivamente, pelos métodos automático e microscópico. [Capítulo 3] O objetivo do presente capítulo foi determinar a ocorrência de mastite subclínica em rebanho ovino leiteiro, através do isolamento bacteriano e da CCS. Determinou-se, ainda, a composição (gordura, lactose, proteína e sólidos totais) do leite e a relação entre estes parâmetros e a presença de mastite. Para tanto, coletaram-se 315 amostras de leite, individualizadas por teto, das quais 85 (27%) foram identificadas como mastite subclínica, sendo Staphylococcus coagulase negativos o agente prevalente (64,7%), seguido por Staphylococcus coagulase positivas (19,1%). A CCS variou de 2,5x103 a 9,3x106. Verificou-se CCS significativamente maior (p<0,0001) nas amostras com isolamento bacteriano. Entretanto, o mesmo não foi observado entre os parâmetros de composição. Não foi determinada correlação entre os parâmetros de composição e a CCS. [Capítulo 4] Este capítulo teve como objetivos identificar as espécies de SCN em 32 isolados de casos de mastite subclínica em ovinos, através da técnica de PCR-RFLP e sequenciamento do gene gap, e determinar a suscetibilidade dos isolados frente a nove agentes antimicrobianos, pela técnica de disco difusão em ágar. Foram obtidos quatro perfis no sequenciamento, sendo observada a presença de três espécies de SCN: Staphylococcus epidermidis (59,4%), Staphylococcus chromogenes (34,4%) e Staphylococcus devriesei (6,2%), pela primeira vez descrita na região Sul do país em casos de mastite ovina. Todos os isolados foram suscetíveis a cefalotina, ceftiofur e penicilina+novobiocina. Vinte e um isolados (65,6%) apresentaram resistência a pelo menos um agente antimicrobiano e onze isolados (34,4%) mostraram-se suscetíveis a todos os agentes testados. Quatro isolados (12,5%) apresentaram multirresistência e, entre estes, um isolado da espécie S. epidermidis apresentou resistência à oxacilina, confirmada através da amplificação do gene mecA por PCR. Os estudos permitem concluir que os SCN são os agentes etiológicos mais prevalentes relacionados com mastite subclínica em ovelhas leiteiras e sua presença tem correlação com CCS elevada. A determinação da CCS através de método manual demonstra que esta é uma ferramenta aplicável à espécie ovina. Além de se constituir em problema de sanidade animal, a mastite ovina, tem como consequência perdas econômicas ao produtor, SCN possuem potencial zoonótico, destacando a importância destes micro-organismos na saúde pública, tornando primordial a identificação destes agentes, através de ferramentas genotípicas seguras e confiáveis. / The mastitis is one of the major problems related to breeding of milk sheep due to the economic losses arising from the reduction in production, expenditure on medication and loss of animals. The Somatic Cell Count (SCC) and bacterial isolation are diagnostic tools indicative of mammary gland’s health that can be determined by automated method and manual method, through the counting of cell under a microscope, whereupon there are discussions concerning the appropriated staining to the ewe’s milk due to different cellularity in this species. This thesis comprises three studies that aim to make the diagnosis of subclinical mastitis in dairy sheep in Rio Grande do Sul - Brazil in a total of 315 milk samples originated from cases of this disease in dairy sheep. [Chapter 2] It were used 116 samples to identify and validate a method for microscopic SCC suitable for ovine specie. Therefore, were made glass slides for smear of 10 μL of milk in 1 cm2, where were tested xylol fixers and Carnoy solution and May-Grünwald (MG), Broadhurst- Paley (BP), Wright (W) and Panotic (P) dyes. Carnoy solution was elected, because this one allowed a better fixation of the milk film to the microscope slides, and BP staining as it allowed a good staining and visualization of cells and the differentiation of cytoplasmic corpuscles. The SCC values ranged from 2,6x104 to 4,4x106 cells.mL-1 and 1,9x104 to 8,1x106 cells.mL-1, respectively by automatic and microscopic methods. [Chapter 3] The purpose of this chapter was to determine the occurrence of subclinical mastitis in dairy sheep flock, by bacterial isolation and SCC. It was determined also the composition (fat, lactose, protein and total solids) of milk and the relationship between these parameters and the presence of mastitis. In order to do that, were collected 315 milk samples, individualized by teat, of which 85 (27%) were identified as subclinical mastitis and Staphylococcus coagulase negative (SCN) was the prevalent agent (64.7%), followed by Staphylococcus coagulase positive (SCP) (19. 1%). The SCC ranged from 2,5x103 to 9,3x106. There was significant higher SCC (p <0.0001) in samples with bacterial isolation. However, the same was not observed between the composition parameters. There was no correlation between the composition parameters and SCC. [Chapter 4] This chapter aims to identify the species of CNS in 32 isolated from cases of subclinical mastitis in sheep by PCR-RFLP and sequencing of the gap gene and determine the susceptibility of isolates face to nine antimicrobials, by disk agar diffusion technique. Four profiles were obtained in sequencing, revealing the presence of three species of SCN: Staphylococcus epidermidis (59.4%), Staphylococcus chromogenes (34.4%) and Staphylococcus devriesei (6.2%), first described in the south region of the country in cases of sheep mastitis. All isolates were susceptible to cephalothin, ceftiofur and penicillin + novobiocin. Twenty-one isolates (65.6%) showed resistance to at least one antimicrobial agent and eleven isolates (34.4%) were susceptible to all tested agents. Four isolates (12.5%) had multidrug resistance and, among these, an isolated of S. epidermidis was resistant to oxacillin, confirmed by amplifying the mecA gene by PCR. The studies support the conclusion that the SCN are the most prevalent etiologic agents related to subclinical mastitis in dairy sheep and their presence correlates with high SCC. The determination of SCC through manual method demonstrates that this tool is applicable to the ovine species. Besides being an animal health problem, the sheep mastitis results in a economic losses to producers, SCN have zoonotic potential, highlighting the importance of these microorganisms in public health, making it crucial to identify these agents through secure and reliable genotypic tools.

A mastite um dos grandes problemas relacionados com criação de ovinos de leite devido às perdas econômicas decorrentes da redução na produção, gastos com medicamento e perdas de animais. A Contagem de Células Somáticas (CCS) e o isolamento bacteriano são ferramentas diagnósticas indicativas da saúde da glândula mamária que pode ser determinada através de método automatizado e por método manual, através de contagem celular em microscópio, sobre o qual existem discussões quanto à coloração adequada ao leite de ovelhas devido a celularidade diferenciada nesta espécie. Esta tese compreende três estudos que visam realizar o diagnóstico de mastite subclínica em ovelhas leiteiras do Estado Rio Grande do Sul – Brasil em um total de 315 amostras de leite oriundos de casos desta enfermidade em ovelhas de leite. [Capítulo 2] Foram utilizadas 116 amostras com o objetivo de identificar e validar uma metodologia de CCS microscópica adequada à espécie ovina. Assim foram confeccionadas lâminas de esfregaços de 10 μL de leite em 1 cm2, onde foram testados os fixadores de xilol e solução de Carnoy e as colorações de May-Grünwald (MG), Broadhurst- Paley (BP), Wrigth (W) e Panótico (P). Elegeu-se a solução de Carnoy, pois esta permitiu uma melhor fixação do filme lácteo às lâminas de microscopia, e o corante BP, pois permitiu uma boa coloração e visualização das células, bem como a diferenciação dos corpúsculos citoplasmáticos. Os valores de CCS variaram de 2,6x104 a 4,4x106 células.mL-1 e de 1,9x104 a 8,1x106 células.mL-1, respectivamente, pelos métodos automático e microscópico. [Capítulo 3] O objetivo do presente capítulo foi determinar a ocorrência de mastite subclínica em rebanho ovino leiteiro, através do isolamento bacteriano e da CCS. Determinou-se, ainda, a composição (gordura, lactose, proteína e sólidos totais) do leite e a relação entre estes parâmetros e a presença de mastite. Para tanto, coletaram-se 315 amostras de leite, individualizadas por teto, das quais 85 (27%) foram identificadas como mastite subclínica, sendo Staphylococcus coagulase negativos o agente prevalente (64,7%), seguido por Staphylococcus coagulase positivas (19,1%). A CCS variou de 2,5x103 a 9,3x106. Verificou-se CCS significativamente maior (p<0,0001) nas amostras com isolamento bacteriano. Entretanto, o mesmo não foi observado entre os parâmetros de composição. Não foi determinada correlação entre os parâmetros de composição e a CCS. [Capítulo 4] Este capítulo teve como objetivos identificar as espécies de SCN em 32 isolados de casos de mastite subclínica em ovinos, através da técnica de PCR-RFLP e sequenciamento do gene gap, e determinar a suscetibilidade dos isolados frente a nove agentes antimicrobianos, pela técnica de disco difusão em ágar. Foram obtidos quatro perfis no sequenciamento, sendo observada a presença de três espécies de SCN: Staphylococcus epidermidis (59,4%), Staphylococcus chromogenes (34,4%) e Staphylococcus devriesei (6,2%), pela primeira vez descrita na região Sul do país em casos de mastite ovina. Todos os isolados foram suscetíveis a cefalotina, ceftiofur e penicilina+novobiocina. Vinte e um isolados (65,6%) apresentaram resistência a pelo menos um agente antimicrobiano e onze isolados (34,4%) mostraram-se suscetíveis a todos os agentes testados. Quatro isolados (12,5%) apresentaram multirresistência e, entre estes, um isolado da espécie S. epidermidis apresentou resistência à oxacilina, confirmada através da amplificação do gene mecA por PCR. Os estudos permitem concluir que os SCN são os agentes etiológicos mais prevalentes relacionados com mastite subclínica em ovelhas leiteiras e sua presença tem correlação com CCS elevada. A determinação da CCS através de método manual demonstra que esta é uma ferramenta aplicável à espécie ovina. Além de se constituir em problema de sanidade animal, a mastite ovina, tem como consequência perdas econômicas ao produtor, SCN possuem potencial zoonótico, destacando a importância destes micro-organismos na saúde pública, tornando primordial a identificação destes agentes, através de ferramentas genotípicas seguras e confiáveis. / The mastitis is one of the major problems related to breeding of milk sheep due to the economic losses arising from the reduction in production, expenditure on medication and loss of animals. The Somatic Cell Count (SCC) and bacterial isolation are diagnostic tools indicative of mammary gland’s health that can be determined by automated method and manual method, through the counting of cell under a microscope, whereupon there are discussions concerning the appropriated staining to the ewe’s milk due to different cellularity in this species. This thesis comprises three studies that aim to make the diagnosis of subclinical mastitis in dairy sheep in Rio Grande do Sul - Brazil in a total of 315 milk samples originated from cases of this disease in dairy sheep. [Chapter 2] It were used 116 samples to identify and validate a method for microscopic SCC suitable for ovine specie. Therefore, were made glass slides for smear of 10 μL of milk in 1 cm2, where were tested xylol fixers and Carnoy solution and May-Grünwald (MG), Broadhurst- Paley (BP), Wright (W) and Panotic (P) dyes. Carnoy solution was elected, because this one allowed a better fixation of the milk film to the microscope slides, and BP staining as it allowed a good staining and visualization of cells and the differentiation of cytoplasmic corpuscles. The SCC values ranged from 2,6x104 to 4,4x106 cells.mL-1 and 1,9x104 to 8,1x106 cells.mL-1, respectively by automatic and microscopic methods. [Chapter 3] The purpose of this chapter was to determine the occurrence of subclinical mastitis in dairy sheep flock, by bacterial isolation and SCC. It was determined also the composition (fat, lactose, protein and total solids) of milk and the relationship between these parameters and the presence of mastitis. In order to do that, were collected 315 milk samples, individualized by teat, of which 85 (27%) were identified as subclinical mastitis and Staphylococcus coagulase negative (SCN) was the prevalent agent (64.7%), followed by Staphylococcus coagulase positive (SCP) (19. 1%). The SCC ranged from 2,5x103 to 9,3x106. There was significant higher SCC (p <0.0001) in samples with bacterial isolation. However, the same was not observed between the composition parameters. There was no correlation between the composition parameters and SCC. [Chapter 4] This chapter aims to identify the species of CNS in 32 isolated from cases of subclinical mastitis in sheep by PCR-RFLP and sequencing of the gap gene and determine the susceptibility of isolates face to nine antimicrobials, by disk agar diffusion technique. Four profiles were obtained in sequencing, revealing the presence of three species of SCN: Staphylococcus epidermidis (59.4%), Staphylococcus chromogenes (34.4%) and Staphylococcus devriesei (6.2%), first described in the south region of the country in cases of sheep mastitis. All isolates were susceptible to cephalothin, ceftiofur and penicillin + novobiocin. Twenty-one isolates (65.6%) showed resistance to at least one antimicrobial agent and eleven isolates (34.4%) were susceptible to all tested agents. Four isolates (12.5%) had multidrug resistance and, among these, an isolated of S. epidermidis was resistant to oxacillin, confirmed by amplifying the mecA gene by PCR. The studies support the conclusion that the SCN are the most prevalent etiologic agents related to subclinical mastitis in dairy sheep and their presence correlates with high SCC. The determination of SCC through manual method demonstrates that this tool is applicable to the ovine species. Besides being an animal health problem, the sheep mastitis results in a economic losses to producers, SCN have zoonotic potential, highlighting the importance of these microorganisms in public health, making it crucial to identify these agents through secure and reliable genotypic tools.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-09-19T15:05:40Z No. of bitstreams: 1 cosmeantonioazarias.pdf: 2379047 bytes, checksum: ea869d40cac287eeaed5fee2c7eb993a (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-09-22T15:04:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 cosmeantonioazarias.pdf: 2379047 bytes, checksum: ea869d40cac287eeaed5fee2c7eb993a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-22T15:04:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 cosmeantonioazarias.pdf: 2379047 bytes, checksum: ea869d40cac287eeaed5fee2c7eb993a (MD5) Previous issue date: 2017-06-08 / O presente trabalho teve como objetivo principal a utilização da Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR) e Reflectância Total Atenuada (ATR) como uma ferramenta para avaliação rápida e acompanhamento do índice de maturação de queijos Pecorino, Maturado e Gouda, produzidos com leite de ovelha. Foram avaliados os tempos de maturação de 2, 3, 4, 5 e 11 meses (Pecorino), 1, 3, 6, 7, 8 e 12 meses (Maturado) e 2, 3, 5 e 11 meses (Gouda). Determinações de umidade, gordura e proteína foram realizadas nas amostras mais novas de cada queijo para classificá-los segundo a legislação. Em relação aos lipídios, todas as variedades foram classificadas como queijos Gordos. Em relação ao teor de água, as variedades Maturado e Gouda classificaram-se como de média umidade e o Pecorino como baixa umidade. Para cada queijo foram retiradas duas amostras da parte central e feitas medições espectrais em espectrômetro MIR (Mid-Infrared Spectroscopy) no intervalo de 400 a 4000 cm-1. Os espectros foram obtidos em quadruplicata e se caracterizaram por apresentar bandas de absorção na região de 3700 a 1000 cm-1. Para avaliação e acompanhamento do processo de maturação dos queijos foram estudados os picos característicos de grupamento amida (1640 e 1550 cm-1) e picos referentes à presença de lipídeos (2922, 2852 e 1161 cm-1), sendo que, de uma maneira geral, os valores das absorbâncias diminuíram com o passar do tempo de maturação dos queijos. Bandas de energia ao redor dos picos foram processadas utilizando a ferramenta quimiométrica PCA (Principal Component Analysis), sendo possível separar os diferentes tempos de maturação e avaliar uma linha temporal em decorrência dos processos de proteólise e lipólise. Pelo comportamento e evolução dos picos obtidos nos espectros pode-se dizer que a tecnologia da espectroscopia infravermelha por transformada de Fourier (FTIR) foi capaz de verificar indicativos da ocorrência dos fenômenos de proteólise e lipólise durante o processo de maturação dos queijos, podendo, portanto, ser considerada uma ferramenta de análise aplicável para detectar alterações moleculares advindas do processo de maturação. / The objective of this work was to explore the utility of Attenuated Total Reflectance and Fourier Transform Infrared Spectroscopy (ATR-FTIR) techniques as tools for rapid evaluation and monitoring of the maturation index of Pecorino, Ripe and Gouda cheeses produced with ewes’ milk. Maturation times of 2, 3, 4, 5 and 11 months (Pecorino), 1, 3, 6, 7, 8 and 12 months (Ripe) and 2, 3, 5 e 11 months (Gouda) have been used. Humidity and fat content analysis were carried out on the newest samples of each cheese to classify them according to the current Brazilian legislation. In relation to lipids, all varieties were classified as fatty cheeses. The water content revealed Ripe and Gouda varieties as “medium moisture” while Pecorino as “low moisture”. Protein content was also estimated. Two samples of the central part of each cheese were subjected to spectral evaluations using a MIR spectrometer (Mid-Infrared Spectroscopy) in the range of 400 to 4000 cm-1. The spectra were obtained in quadruplicate and revealed absorption bands in the region of 3700 to 1000 cm-1. In order to evaluate the ripening process of the cheeses, typical bands arising from amide (1640 and 1550 cm-1) and lipid (2922, 2852 and 1161 cm-1) groups, were studied. In general, the absorption values decreased with the development of ripening process. The whole bands of the main peaks were processed using the Principal Component Analysis (PCA). It was possible to differentiate the ripening times and to evaluate a timeline among the cheeses. The timeline was related with the IR spectral interpretations, where it could be verified the occurrence of the proteolysis and lipolysis phenomena during ripening process of cheese. Therefore, FTIR/ATR technique is a useful tool to detect molecular changes related to the ripening process.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Sheep milk is produced in Brazil mainly in the South and Southeast regions and, because it has a higher content of solids than cow milk, it is usually processed into dairy products, especially cheese and yogurt. In this sense, the reduced number of studies in the area, associated to the lack of scientific information related to dairy products from ovine culture, stimulated the creation of the present study that aims to evaluate the physicochemical composition and to determine and analyze the content of mineral elements and the profile of fatty acids of sheep milk, related to the period of lactation. Two treatments were used: treatment 1 with milk of ½ Laucane blood sheep and treatment 2 with milk of Ile de France x Texel crossbred sheep, which were milked from the 1st to the 10th week of lactation. The progress in the lactation period of ½ blood and crossbred sheep showed an increase in fat content, with 7.37 and 6.47% in the first week passing to 7.54 and 7.62% in the last week, respectively. The values of protein were 4.75% for ½ Laucane blood sheep and 4.97% for Ile de France x Texel crossbred sheep in the beginning of the lactation reaching the tenth week with values of 4.67 and 4.61%, respectively. There is a higher concentration of saturated fatty acids for the Ile de France x Texel crossbred sheep with values oscillating between 67.09 and 74.65%. Regarding the concentrations of mono and polyunsaturated fatty acids, a superiority for ½ Laucane blood sheep was observed, with values of monounsaturated fatty acids ranging from 22.50 to 28.50% and polyunsaturated from 4.52 to 5.20%. The mineral elements Ca, S, P, Mg, K and Na present in ovine milk did not show a pattern of variation during the evaluated lactation period for both genetic groups. The Ca content was higher for the milk of ½ Laucane blood sheep, demonstrating a variation between 131.63 and 218.49 mg/100 mL. The amount of P obtained in ovine milk was lower than that of Ca, where ½ Laucane blood sheep showed higher values, presenting the same behavior that the element Ca. The Na and K content was higher in the milk of ½ Laucane blood sheep, not differing significantly in the fourth and fifth weeks for the two genetic groups evaluated, in the same way that K did not differ in the third week of lactation either. Similar to the other minerals, S and Mg content was lower for Ile de France x Texel crossbred sheep. / O leite de ovelha é produzido no Brasil principalmente nas regiões Sul e Sudeste e, por apresentar maior teor de sólidos do que o leite de vaca, geralmente é processado em derivados lácteos, especialmente queijos e iogurtes. Neste sentido, o reduzido número de trabalhos realizados na área, associado à carência de informações científicas relacionadas aos produtos lácteos oriundos da ovinocultura estimularam a realização do presente trabalho com o objetivo de avaliar a composição físico-química e, determinar e analisar o teor dos elementos minerais e o perfil de ácidos graxos do leite de ovelhas, em relação ao período de lactação. Foram utilizados dois tratamentos, leite de ovelhas ½ sangue Lacaune e o leite de ovelhas cruza Ile de France x Texel, sendo estas ordenhadas da 1ª a 10ª semana de lactação. Com avanço no período de lactação, ovelhas ½ sangue e cruza apresentaram aumento no teor de gordura, com 7,37 e 6,47 % na primeira semana passando a 7,54 e 7,62 % na última semana, respectivamente. Os valores encontrados de proteína foram de 4,75 % para as ovelhas ½ sangue Lacaune e 4,97 % para as cruzas Ile de France x Texel no início da lactação chegando a décima semana com valores de 4,67 e 4,61 %, respectivamente. Há maior concentração de ácidos graxos saturados para as ovelhas cruza Ile de France x Texel com valores oscilando entre 67,09 e 74,65 %. Com relação às concentrações de ácidos graxos mono e poliinsaturados observa-se superioridade para ovelhas ½ sangue Lacaune, com valores de ácidos graxos monoinsaturados variando entre 22,50 a 28,59 % e poliinsaturados de 4,57 a 5,20%. Os elementos minerais Ca, S, P, Mg, K e Na presentes no leite ovino, não apresentaram um padrão de variação durante o período de lactação avaliado para ambos grupos genéticos. O teor de cálcio foi superior para o leite das ovelhas ½ sangue Lacaune, demonstrando uma variação entre 131,63 a 218,49 mg/100mL. A quantidade de P obtida no leite ovino foi menor que a de Ca, onde ovelhas ½ sangue Lacaune apresentaram valores superiores, apresentando o mesmo comportamento que o elemento Ca. O teor de Na e K apresentou-se mais elevado no leite das ovelhas ½ sangue Lacaune, não diferindo significativamente na quarta e quinta semana para os dois grupos genéticos avaliados, da mesma forma que o potássio também não diferiu na terceira semana de lactação. De forma semelhante aos demais minerais, os teores de S e Mg foram menores para as ovelhas cruza Ile de France x Texel.