Peptídeos bioativos são foco de pesquisas devido ao interesse relacionado a suas propriedades antioxidantes, anti-hipertensivas, entre outras. Enzimas proteolíticas microbianas aparecem como potentes biocatalisadores para a obtenção de hidrolisados protéicos e peptídeos bioativos em escala industrial/comercial. Neste estudo, hidrolisados de caseinato ovino e soro de queijo ovino foram produzidos utilizando enzimas proteolíticas de Bacillus sp. P7, e as atividades antioxidantes (sequestro de radicais, atividade quelante de ferro e poder redutor), antimicrobiana e anti-hipertensiva (inibição da enzima conversora de angiotensina-I (ECA)) dos hidrolisados foram avaliadas. A atividade antioxidante dos hidrolisados de caseinato ovino, quando avaliada pelo método da captura do radical ácido 2,2’-azinobis-(3-etil-benzotiasolina-6- ácido sulfônico) aumentou com o tempo de hidrólise em até 2 h, mantendo-se estável durante 4 h. Os hidrolisados mostraram baixa capacidade em capturar o radical 2,2-difenil-1-picrilidrazila (DPPH), apresentando maior atividade (31%) após 1 h de hidrólise. A capacidade de quelação de Fe2+ foi máxima em 0,5 h de hidrólise (83,3%), decrescendo em seguida, e o maior poder redutor foi observado após 1h de hidrólise. A inibição da atividade da ECA aumentou até 2h de hidrólise (94% de inibição), diminuindo após esse tempo. Hidrolisados após 3h mostraram inibir a multiplicação de Bacillus cereus, Corynebacterium fimi, Aspergillus fumigatus, e Penicillium expansum. Nos hidrolisados de soro de queijo ovino a proteína solúvel e aminoácidos livres tenderam a aumentar durante o tempo de hidrólise por até 4h. A atividade antioxidante dos hidrolisados avaliados pelo método da captura do radical ácido 2,2’-azinobis-(3- etil-benzotiasolina-6-ácido sulfônico), aumentou de 0h (15,9%) para 6h (51,3%). A máxima quelação de Fe2+ foi observada em hidrolisados após 3h, e o pico do poder redutor em 1h de hidrólise, representando aumentos de 6,2 e 2,1 vezes, respectivamente, quando comparado com o soro de queijo não hidrolisado. A inibição da ECA pelo soro de queijo ovino (12%) aumentou através da hidrólise, alcançando valor máximo (55% inibição) em 4h de hidrólise; no entanto, uma inibição de 42% foi observada após 1h de hidrólise. / Bioactive peptides are a focus of research due to the interest related to their antioxidant and antihypertensive properties, among others. Microbial proteolytic enzymes appear as potent biocatalysts to obtain protein hydrolysates and bioactive peptides on an industrial/commercial scale. In this study, ovine cheese whey and ovine caseinate were produced using proteolytic enzymes from Bacillus sp. P7, and the antioxidant (scavenging of the radical, iron-chelating activity, and reducing power), antimicrobial, and antihypertensive (inhibition of the angiotensin-I converting enzyme(ACE)) activities of the hydrolysates were evaluated. Antioxidant activity measured by the 2,2_-azino-bis-(3- ethylbenzothiazoline)-6-sulfonic acid method increased with hydrolysis time up to 2 h, remaining stable for up to 4 h. Hydrolysates showed low 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl radical scavenging abilities, with higher activity (31%) reached after 1 h of hydrolysis. Fe2+-chelating ability was maximum for 0.5 h hydrolysates (83.3%), decreasing thereafter; and the higher reducing powerwas observed after 1h of hydrolysis. ACE-inhibitory activity was observed to increase up to 2 h of hydrolysis (94% of inhibition), declining afterwards. 3 h hydrolysates were shown to inhibit the growth of Bacillus cereus, Corynebacterium fimi, Aspergillus fumigatus, and Penicillium expansum. Soluble protein and free amino acids tended to increase during hydrolysis of SCW for up to 4 h. Antioxidant activity of hydrolysates, evaluated by the 2,2’azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline)-6-sulfonic acid radical scavenging method, increased 3.2-fold from 0 h (15.9%) to 6 h of hydrolysis (51.3%). Maximum Fe2+ chelation was reached in 3-h hydrolysates, and the reducing power peaked at 1 h of hydrolysis, representing 6.2- and 2.1-fold increments, respectively, when compared to that of non-hydrolyzed SCW. ACE inhibition by SCW (12%) was improved through hydrolysis, reaching maximal values (55% inhibition) in 4-h hydrolysates; however, a 42% inhibition was already observed after 1 h of hydrolysis.

Peptídeos bioativos são foco de pesquisas devido ao interesse relacionado a suas propriedades antioxidantes, anti-hipertensivas, entre outras. Enzimas proteolíticas microbianas aparecem como potentes biocatalisadores para a obtenção de hidrolisados protéicos e peptídeos bioativos em escala industrial/comercial. Neste estudo, hidrolisados de caseinato ovino e soro de queijo ovino foram produzidos utilizando enzimas proteolíticas de Bacillus sp. P7, e as atividades antioxidantes (sequestro de radicais, atividade quelante de ferro e poder redutor), antimicrobiana e anti-hipertensiva (inibição da enzima conversora de angiotensina-I (ECA)) dos hidrolisados foram avaliadas. A atividade antioxidante dos hidrolisados de caseinato ovino, quando avaliada pelo método da captura do radical ácido 2,2’-azinobis-(3-etil-benzotiasolina-6- ácido sulfônico) aumentou com o tempo de hidrólise em até 2 h, mantendo-se estável durante 4 h. Os hidrolisados mostraram baixa capacidade em capturar o radical 2,2-difenil-1-picrilidrazila (DPPH), apresentando maior atividade (31%) após 1 h de hidrólise. A capacidade de quelação de Fe2+ foi máxima em 0,5 h de hidrólise (83,3%), decrescendo em seguida, e o maior poder redutor foi observado após 1h de hidrólise. A inibição da atividade da ECA aumentou até 2h de hidrólise (94% de inibição), diminuindo após esse tempo. Hidrolisados após 3h mostraram inibir a multiplicação de Bacillus cereus, Corynebacterium fimi, Aspergillus fumigatus, e Penicillium expansum. Nos hidrolisados de soro de queijo ovino a proteína solúvel e aminoácidos livres tenderam a aumentar durante o tempo de hidrólise por até 4h. A atividade antioxidante dos hidrolisados avaliados pelo método da captura do radical ácido 2,2’-azinobis-(3- etil-benzotiasolina-6-ácido sulfônico), aumentou de 0h (15,9%) para 6h (51,3%). A máxima quelação de Fe2+ foi observada em hidrolisados após 3h, e o pico do poder redutor em 1h de hidrólise, representando aumentos de 6,2 e 2,1 vezes, respectivamente, quando comparado com o soro de queijo não hidrolisado. A inibição da ECA pelo soro de queijo ovino (12%) aumentou através da hidrólise, alcançando valor máximo (55% inibição) em 4h de hidrólise; no entanto, uma inibição de 42% foi observada após 1h de hidrólise. / Bioactive peptides are a focus of research due to the interest related to their antioxidant and antihypertensive properties, among others. Microbial proteolytic enzymes appear as potent biocatalysts to obtain protein hydrolysates and bioactive peptides on an industrial/commercial scale. In this study, ovine cheese whey and ovine caseinate were produced using proteolytic enzymes from Bacillus sp. P7, and the antioxidant (scavenging of the radical, iron-chelating activity, and reducing power), antimicrobial, and antihypertensive (inhibition of the angiotensin-I converting enzyme(ACE)) activities of the hydrolysates were evaluated. Antioxidant activity measured by the 2,2_-azino-bis-(3- ethylbenzothiazoline)-6-sulfonic acid method increased with hydrolysis time up to 2 h, remaining stable for up to 4 h. Hydrolysates showed low 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl radical scavenging abilities, with higher activity (31%) reached after 1 h of hydrolysis. Fe2+-chelating ability was maximum for 0.5 h hydrolysates (83.3%), decreasing thereafter; and the higher reducing powerwas observed after 1h of hydrolysis. ACE-inhibitory activity was observed to increase up to 2 h of hydrolysis (94% of inhibition), declining afterwards. 3 h hydrolysates were shown to inhibit the growth of Bacillus cereus, Corynebacterium fimi, Aspergillus fumigatus, and Penicillium expansum. Soluble protein and free amino acids tended to increase during hydrolysis of SCW for up to 4 h. Antioxidant activity of hydrolysates, evaluated by the 2,2’azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline)-6-sulfonic acid radical scavenging method, increased 3.2-fold from 0 h (15.9%) to 6 h of hydrolysis (51.3%). Maximum Fe2+ chelation was reached in 3-h hydrolysates, and the reducing power peaked at 1 h of hydrolysis, representing 6.2- and 2.1-fold increments, respectively, when compared to that of non-hydrolyzed SCW. ACE inhibition by SCW (12%) was improved through hydrolysis, reaching maximal values (55% inhibition) in 4-h hydrolysates; however, a 42% inhibition was already observed after 1 h of hydrolysis.

Peptídeos bioativos são foco de pesquisas devido ao interesse relacionado a suas propriedades antioxidantes, anti-hipertensivas, entre outras. Enzimas proteolíticas microbianas aparecem como potentes biocatalisadores para a obtenção de hidrolisados protéicos e peptídeos bioativos em escala industrial/comercial. Neste estudo, hidrolisados de caseinato ovino e soro de queijo ovino foram produzidos utilizando enzimas proteolíticas de Bacillus sp. P7, e as atividades antioxidantes (sequestro de radicais, atividade quelante de ferro e poder redutor), antimicrobiana e anti-hipertensiva (inibição da enzima conversora de angiotensina-I (ECA)) dos hidrolisados foram avaliadas. A atividade antioxidante dos hidrolisados de caseinato ovino, quando avaliada pelo método da captura do radical ácido 2,2’-azinobis-(3-etil-benzotiasolina-6- ácido sulfônico) aumentou com o tempo de hidrólise em até 2 h, mantendo-se estável durante 4 h. Os hidrolisados mostraram baixa capacidade em capturar o radical 2,2-difenil-1-picrilidrazila (DPPH), apresentando maior atividade (31%) após 1 h de hidrólise. A capacidade de quelação de Fe2+ foi máxima em 0,5 h de hidrólise (83,3%), decrescendo em seguida, e o maior poder redutor foi observado após 1h de hidrólise. A inibição da atividade da ECA aumentou até 2h de hidrólise (94% de inibição), diminuindo após esse tempo. Hidrolisados após 3h mostraram inibir a multiplicação de Bacillus cereus, Corynebacterium fimi, Aspergillus fumigatus, e Penicillium expansum. Nos hidrolisados de soro de queijo ovino a proteína solúvel e aminoácidos livres tenderam a aumentar durante o tempo de hidrólise por até 4h. A atividade antioxidante dos hidrolisados avaliados pelo método da captura do radical ácido 2,2’-azinobis-(3- etil-benzotiasolina-6-ácido sulfônico), aumentou de 0h (15,9%) para 6h (51,3%). A máxima quelação de Fe2+ foi observada em hidrolisados após 3h, e o pico do poder redutor em 1h de hidrólise, representando aumentos de 6,2 e 2,1 vezes, respectivamente, quando comparado com o soro de queijo não hidrolisado. A inibição da ECA pelo soro de queijo ovino (12%) aumentou através da hidrólise, alcançando valor máximo (55% inibição) em 4h de hidrólise; no entanto, uma inibição de 42% foi observada após 1h de hidrólise. / Bioactive peptides are a focus of research due to the interest related to their antioxidant and antihypertensive properties, among others. Microbial proteolytic enzymes appear as potent biocatalysts to obtain protein hydrolysates and bioactive peptides on an industrial/commercial scale. In this study, ovine cheese whey and ovine caseinate were produced using proteolytic enzymes from Bacillus sp. P7, and the antioxidant (scavenging of the radical, iron-chelating activity, and reducing power), antimicrobial, and antihypertensive (inhibition of the angiotensin-I converting enzyme(ACE)) activities of the hydrolysates were evaluated. Antioxidant activity measured by the 2,2_-azino-bis-(3- ethylbenzothiazoline)-6-sulfonic acid method increased with hydrolysis time up to 2 h, remaining stable for up to 4 h. Hydrolysates showed low 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl radical scavenging abilities, with higher activity (31%) reached after 1 h of hydrolysis. Fe2+-chelating ability was maximum for 0.5 h hydrolysates (83.3%), decreasing thereafter; and the higher reducing powerwas observed after 1h of hydrolysis. ACE-inhibitory activity was observed to increase up to 2 h of hydrolysis (94% of inhibition), declining afterwards. 3 h hydrolysates were shown to inhibit the growth of Bacillus cereus, Corynebacterium fimi, Aspergillus fumigatus, and Penicillium expansum. Soluble protein and free amino acids tended to increase during hydrolysis of SCW for up to 4 h. Antioxidant activity of hydrolysates, evaluated by the 2,2’azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline)-6-sulfonic acid radical scavenging method, increased 3.2-fold from 0 h (15.9%) to 6 h of hydrolysis (51.3%). Maximum Fe2+ chelation was reached in 3-h hydrolysates, and the reducing power peaked at 1 h of hydrolysis, representing 6.2- and 2.1-fold increments, respectively, when compared to that of non-hydrolyzed SCW. ACE inhibition by SCW (12%) was improved through hydrolysis, reaching maximal values (55% inhibition) in 4-h hydrolysates; however, a 42% inhibition was already observed after 1 h of hydrolysis.

Bactérias lácticas probióticas e peptídeos bioativos são importantes componentes de alimentos funcionais. Neste trabalho, bactérias lácticas isoladas de leite ovino cru e de queijo de ovelha foram identificadas por 16S rDNA como pertencentes ao gênero Lactobacillus e avaliadas quanto ao potencial probiótico. Todas as linhagens demonstraram adequada tolerância ao pH 3,0 e a sais biliares em concentrações de até 0,5%. A linhagem LCN 56, quando exposta ao tratamento de pH 2,0 e pepsina, adicionado de leite desnatado, não teve sua viabilidade reduzida durante 4 horas em função do efeito protetor do alimento. Adicionalmente, propriedades de autoagregação e hidrofobicidade, atividades antioxidante e antibacteriana, e ainda, produção da enzima β-galactosidase foram avaliadas em 12 Lactobacillus e em 2 linhagens de referência. Estas características foram bastante variáveis entre as linhagens, mesmo entre aquelas pertencentes à mesma espécie. Nenhuma das bactérias exibiu todas as propriedades desejáveis, porém dois isolados apresentaram conjuntamente o maior número de atributos funcionais, L. brevis SM-B e L. plantarum SM-I. Com relação aos peptídeos com atividade biológica, extratos aquosos de queijos de ovelha maturados foram avaliados e apresentaram propriedades antioxidantes de sequestro do cátion radical 2,2 azino-bis (3-etilbenzotiazolino-6-ácido sulfônico) (ABTS) e atividade quelante de ferro bastante variáveis, enquanto as análises de poder redutor e substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) apresentaram similaridade para a maioria dos queijos. A atividade inibitória da enzima conversora de angiotensina foi elevada, em contraste à atividade antibacteriana que não foi encontrada em nenhuma das amostras. Os resultados encontrados podem ser atribuídos a possíveis peptídeos bioativos presentes. O perfil proteico do extrato aquoso correspondente ao queijo Roquefort foi visualizado por SDS-PAGE, por ter sido a amostra com a melhor intensidade das bioatividades. Portanto, os resultados refletem a potencial funcionalidade dos produtos lácteos ovinos. / Probiotic lactic bacteria and bioactive peptides are important components of functional foods. In this work, lactic bacteria isolated from raw ovine milk and cheese were identified by 16S rDNA as belonging to Lactobacillus genus and evaluated for probiotic potential. All strains demonstrated appropriate tolerance to pH 3.0 and bile salts until 0.5% of concentration. The strain LCN 56, when exposed to the treatment of pH 2.0 and pepsin added with skim milk, did not reduce viability during 4 hours due to protective effect of the food. Additionaly, autoaggregation and hydrophobicity properties, antioxidant and antibacterial activities and also β-galactosidase production were evaluated for 12 lactobacilli and for 2 reference strains. These characteristics were quite variable among strains, even among strains belonging to the same species. None of them exhibited all the desired properties, but two strains showed the greatest number of functional attributes together, L. brevis SM-B and L. plantarum SM-I. In relation to peptides with biological activity, water soluble extracts of ewe´s ripened cheeses were evaluated and presented antioxidant properties of scavenging of the cation radical 2,2‘-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) and iron chelating activity quite variable, whereas power reduction and thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) analysis presented similarity for the major of the cheeses. Inhibition of the angiotensin-converting enzyme (ACE) was elevated, in contrast to antibacterial activity that was not found for any sample. The results found can be attributed for the possible presence of bioactive peptides. The protein pattern of water soluble extract corresponding to Roquefort was visualized by SDS-PAGE for being the sample that displayed the best bioativities. Therefore, the results reflect potential functionality of dairy sheep.

Bactérias lácticas probióticas e peptídeos bioativos são importantes componentes de alimentos funcionais. Neste trabalho, bactérias lácticas isoladas de leite ovino cru e de queijo de ovelha foram identificadas por 16S rDNA como pertencentes ao gênero Lactobacillus e avaliadas quanto ao potencial probiótico. Todas as linhagens demonstraram adequada tolerância ao pH 3,0 e a sais biliares em concentrações de até 0,5%. A linhagem LCN 56, quando exposta ao tratamento de pH 2,0 e pepsina, adicionado de leite desnatado, não teve sua viabilidade reduzida durante 4 horas em função do efeito protetor do alimento. Adicionalmente, propriedades de autoagregação e hidrofobicidade, atividades antioxidante e antibacteriana, e ainda, produção da enzima β-galactosidase foram avaliadas em 12 Lactobacillus e em 2 linhagens de referência. Estas características foram bastante variáveis entre as linhagens, mesmo entre aquelas pertencentes à mesma espécie. Nenhuma das bactérias exibiu todas as propriedades desejáveis, porém dois isolados apresentaram conjuntamente o maior número de atributos funcionais, L. brevis SM-B e L. plantarum SM-I. Com relação aos peptídeos com atividade biológica, extratos aquosos de queijos de ovelha maturados foram avaliados e apresentaram propriedades antioxidantes de sequestro do cátion radical 2,2 azino-bis (3-etilbenzotiazolino-6-ácido sulfônico) (ABTS) e atividade quelante de ferro bastante variáveis, enquanto as análises de poder redutor e substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) apresentaram similaridade para a maioria dos queijos. A atividade inibitória da enzima conversora de angiotensina foi elevada, em contraste à atividade antibacteriana que não foi encontrada em nenhuma das amostras. Os resultados encontrados podem ser atribuídos a possíveis peptídeos bioativos presentes. O perfil proteico do extrato aquoso correspondente ao queijo Roquefort foi visualizado por SDS-PAGE, por ter sido a amostra com a melhor intensidade das bioatividades. Portanto, os resultados refletem a potencial funcionalidade dos produtos lácteos ovinos. / Probiotic lactic bacteria and bioactive peptides are important components of functional foods. In this work, lactic bacteria isolated from raw ovine milk and cheese were identified by 16S rDNA as belonging to Lactobacillus genus and evaluated for probiotic potential. All strains demonstrated appropriate tolerance to pH 3.0 and bile salts until 0.5% of concentration. The strain LCN 56, when exposed to the treatment of pH 2.0 and pepsin added with skim milk, did not reduce viability during 4 hours due to protective effect of the food. Additionaly, autoaggregation and hydrophobicity properties, antioxidant and antibacterial activities and also β-galactosidase production were evaluated for 12 lactobacilli and for 2 reference strains. These characteristics were quite variable among strains, even among strains belonging to the same species. None of them exhibited all the desired properties, but two strains showed the greatest number of functional attributes together, L. brevis SM-B and L. plantarum SM-I. In relation to peptides with biological activity, water soluble extracts of ewe´s ripened cheeses were evaluated and presented antioxidant properties of scavenging of the cation radical 2,2‘-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) and iron chelating activity quite variable, whereas power reduction and thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) analysis presented similarity for the major of the cheeses. Inhibition of the angiotensin-converting enzyme (ACE) was elevated, in contrast to antibacterial activity that was not found for any sample. The results found can be attributed for the possible presence of bioactive peptides. The protein pattern of water soluble extract corresponding to Roquefort was visualized by SDS-PAGE for being the sample that displayed the best bioativities. Therefore, the results reflect potential functionality of dairy sheep.

Bactérias lácticas probióticas e peptídeos bioativos são importantes componentes de alimentos funcionais. Neste trabalho, bactérias lácticas isoladas de leite ovino cru e de queijo de ovelha foram identificadas por 16S rDNA como pertencentes ao gênero Lactobacillus e avaliadas quanto ao potencial probiótico. Todas as linhagens demonstraram adequada tolerância ao pH 3,0 e a sais biliares em concentrações de até 0,5%. A linhagem LCN 56, quando exposta ao tratamento de pH 2,0 e pepsina, adicionado de leite desnatado, não teve sua viabilidade reduzida durante 4 horas em função do efeito protetor do alimento. Adicionalmente, propriedades de autoagregação e hidrofobicidade, atividades antioxidante e antibacteriana, e ainda, produção da enzima β-galactosidase foram avaliadas em 12 Lactobacillus e em 2 linhagens de referência. Estas características foram bastante variáveis entre as linhagens, mesmo entre aquelas pertencentes à mesma espécie. Nenhuma das bactérias exibiu todas as propriedades desejáveis, porém dois isolados apresentaram conjuntamente o maior número de atributos funcionais, L. brevis SM-B e L. plantarum SM-I. Com relação aos peptídeos com atividade biológica, extratos aquosos de queijos de ovelha maturados foram avaliados e apresentaram propriedades antioxidantes de sequestro do cátion radical 2,2 azino-bis (3-etilbenzotiazolino-6-ácido sulfônico) (ABTS) e atividade quelante de ferro bastante variáveis, enquanto as análises de poder redutor e substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) apresentaram similaridade para a maioria dos queijos. A atividade inibitória da enzima conversora de angiotensina foi elevada, em contraste à atividade antibacteriana que não foi encontrada em nenhuma das amostras. Os resultados encontrados podem ser atribuídos a possíveis peptídeos bioativos presentes. O perfil proteico do extrato aquoso correspondente ao queijo Roquefort foi visualizado por SDS-PAGE, por ter sido a amostra com a melhor intensidade das bioatividades. Portanto, os resultados refletem a potencial funcionalidade dos produtos lácteos ovinos. / Probiotic lactic bacteria and bioactive peptides are important components of functional foods. In this work, lactic bacteria isolated from raw ovine milk and cheese were identified by 16S rDNA as belonging to Lactobacillus genus and evaluated for probiotic potential. All strains demonstrated appropriate tolerance to pH 3.0 and bile salts until 0.5% of concentration. The strain LCN 56, when exposed to the treatment of pH 2.0 and pepsin added with skim milk, did not reduce viability during 4 hours due to protective effect of the food. Additionaly, autoaggregation and hydrophobicity properties, antioxidant and antibacterial activities and also β-galactosidase production were evaluated for 12 lactobacilli and for 2 reference strains. These characteristics were quite variable among strains, even among strains belonging to the same species. None of them exhibited all the desired properties, but two strains showed the greatest number of functional attributes together, L. brevis SM-B and L. plantarum SM-I. In relation to peptides with biological activity, water soluble extracts of ewe´s ripened cheeses were evaluated and presented antioxidant properties of scavenging of the cation radical 2,2‘-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) and iron chelating activity quite variable, whereas power reduction and thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) analysis presented similarity for the major of the cheeses. Inhibition of the angiotensin-converting enzyme (ACE) was elevated, in contrast to antibacterial activity that was not found for any sample. The results found can be attributed for the possible presence of bioactive peptides. The protein pattern of water soluble extract corresponding to Roquefort was visualized by SDS-PAGE for being the sample that displayed the best bioativities. Therefore, the results reflect potential functionality of dairy sheep.

O leite é considerado um bom substrato para o desenvolvimento de diversos microrganismos, dentre os quais, uma variada gama de leveduras com distintas características biológicas. Em geral, as leveduras são consideradas saprotróficas, fazendo parte da microbiota residente, entretanto, em alguns casos, elas podem provocar infecções na glândula mamária. A contaminação do leite por microrganismos patogênicos, pode representar um risco para o consumidor, quando o produto é ingerido na forma in natura ou até mesmo beneficiada. Deve-se considerar, também, os reflexos negativos na produção de subprodutos, pois alterações nas características físicas e organolépticas podem afetar a qualidade e a vida-de-prateleira dos derivados lácteos. O objetivo desse estudo foi avaliar a ocorrência de fungos e bactérias presentes no leite de ovelhas normais e daquelas com mastite clínica. Foram obtidas 588 amostras de leite de ovelha sendo 106 oriundas de animais com mastite clínica e 482 de animais normais. Alíquotas de 0,1 mL de leite foram semeadas pela técnica de espelhamento em superfície em ágar acidificado Yeast Medium. A identificação das leveduras foi realizada através de testes rotineiramente utilizados na metodologia padrão, além da utilização do meio Hicrome Candida Differential Agar Base (HIMEDIA®) e do sistema API 20 C (Biomérieux®). Foram realizados exames bacteriológicos, a fim de obter uma correta avaliação do possível agente etiológico envolvido. Do total das amostras analisadas, 53 (27,04%) foram positivas no exame micológico, 134 (68,36%) positivas no exame bacteriológico e 9 (4,59%) apresentaram crescimento de Candida spp. e Staphylococcus coagulase-negativa. No cultivo micológico foram obtidos 60 isolados pertencentes aos seguintes gêneros: Candida spp. (70,00%), Rhodotorula spp (11,70%), Trichosporon spp. (6,70%), Geotrichum spp. (5,00%), Pichia spp. (5,00%) e Cryptococcus sp. (1,70%). Dentre o total de bactérias, foram isoladas: 110 (82,00%) Staphylococci coagulase-negativa, 14 (10,44%) bactérias Gram-negativas, 6 (4,48%) Staphylococcus aureus e 4 (3,00%) Streptococcus spp. Algumas bactérias Gram-negativas foram identificadas como Pasteurella spp., Rhodococcus spp. e Acinetobacter spp. O resultado microbiológico ressalta a importância da realização concomitante de exames micológicos e bacteriológicos para o correto diagnóstico e monitoramento dos casos de mastite em ovinos. Em relação à saúde pública, o consumo de leite de ovelhas e derivados lácteos contaminados com microrganismos potencialmente patogênicos, constitui um risco para indivíduos imunossuprimidos. No que concerne à produção de derivados lácteos feitos com leite de ovelha, principalmente queijos, a contaminação microbiológica pode afetar a qualidade e a vida-de-prateleira do produto final, causando considerável prejuízo econômico. / The milk is considered a good substrate for the development of various microorganisms, among them, a wide range of yeast strains with different biological characteristics. In general, yeasts are considered to be saprotrophic, part of the normal microflora, however, in some cases, they can cause infections in the mammary gland. Milk contamination by yeasts and yeast-like fungi may represent a risk to the consumer when the product is either consumed in natura or its derivatives. The negative impact on the production of milk derivatives should also be considered as the changes in physical and organoleptic characteristics can affect the quality and shelf-life of dairy products. The aim of this study was to evaluate the diversity of yeasts and bacteria in milk from healthy sheep and those with clinical mastitis. A total of 588 samples were obtained: 106 from animals with clinical mastitis and 482 from healthy animals. Aliquots of 0,1 mL from milk samples were spread in triplicate on acidified Yeast Medium agar. The identification of yeasts was carried out through tests routinely used in the standard methodology along with means Hicrome Candida Differential Agar Base (HIMEDIA®) and API 20 system (Biomerieux ®). Bacteriological studies were performed in order to obtain a correct evaluation of the possible etiological agent. Out of the samples analyzed, 53 (27,04%) showed a positive result in the mycological examination, 134 (68,36%) were positive in the bacteriological examination and 9 (4,59%) presented Candida spp. and coagulase-negative Staphylococcus growing. The mycological analysis showed the presence of 60 isolates belonging to the following genera were cultivated: Candida spp. (70%), Rhodotorula spp. (11.7%), Trichosporon spp. (6.7%), Geotrichum spp. (5%), Pichia spp. (5%) and Cryptococcus spp. (1.7%). The bacteriological analysis showed the presence of 110 (82.00%) coagulase-negative Staphylococci, 14 (10.44%) Gram-negative bacteria, 6 (4.48%) Staphylococcus aureus and 4 (3.00%) Streptococcus spp. Some Gram-negative bacteria were identified as Pasteurella spp., Rhodococcus spp. and Acinetobacter spp. The microbiological results emphasize the importance of the concomitant use of bacteriological and mycological examination for the diagnosis and monitoring of cases of mastitis in sheep. In relation to public health, the consumption of sheep milk and dairy products contaminated with potentially pathogenic microorganisms, constitutes a risk to immunosuppressed individuals. Regarding the production of dairy products made from ewe’s milk, especially cheese, microbiological contamination can affect the life quality and shelf-life of product, causing considerable economic loss.

A mastite um dos grandes problemas relacionados com criação de ovinos de leite devido às perdas econômicas decorrentes da redução na produção, gastos com medicamento e perdas de animais. A Contagem de Células Somáticas (CCS) e o isolamento bacteriano são ferramentas diagnósticas indicativas da saúde da glândula mamária que pode ser determinada através de método automatizado e por método manual, através de contagem celular em microscópio, sobre o qual existem discussões quanto à coloração adequada ao leite de ovelhas devido a celularidade diferenciada nesta espécie. Esta tese compreende três estudos que visam realizar o diagnóstico de mastite subclínica em ovelhas leiteiras do Estado Rio Grande do Sul – Brasil em um total de 315 amostras de leite oriundos de casos desta enfermidade em ovelhas de leite. [Capítulo 2] Foram utilizadas 116 amostras com o objetivo de identificar e validar uma metodologia de CCS microscópica adequada à espécie ovina. Assim foram confeccionadas lâminas de esfregaços de 10 μL de leite em 1 cm2, onde foram testados os fixadores de xilol e solução de Carnoy e as colorações de May-Grünwald (MG), Broadhurst- Paley (BP), Wrigth (W) e Panótico (P). Elegeu-se a solução de Carnoy, pois esta permitiu uma melhor fixação do filme lácteo às lâminas de microscopia, e o corante BP, pois permitiu uma boa coloração e visualização das células, bem como a diferenciação dos corpúsculos citoplasmáticos. Os valores de CCS variaram de 2,6x104 a 4,4x106 células.mL-1 e de 1,9x104 a 8,1x106 células.mL-1, respectivamente, pelos métodos automático e microscópico. [Capítulo 3] O objetivo do presente capítulo foi determinar a ocorrência de mastite subclínica em rebanho ovino leiteiro, através do isolamento bacteriano e da CCS. Determinou-se, ainda, a composição (gordura, lactose, proteína e sólidos totais) do leite e a relação entre estes parâmetros e a presença de mastite. Para tanto, coletaram-se 315 amostras de leite, individualizadas por teto, das quais 85 (27%) foram identificadas como mastite subclínica, sendo Staphylococcus coagulase negativos o agente prevalente (64,7%), seguido por Staphylococcus coagulase positivas (19,1%). A CCS variou de 2,5x103 a 9,3x106. Verificou-se CCS significativamente maior (p<0,0001) nas amostras com isolamento bacteriano. Entretanto, o mesmo não foi observado entre os parâmetros de composição. Não foi determinada correlação entre os parâmetros de composição e a CCS. [Capítulo 4] Este capítulo teve como objetivos identificar as espécies de SCN em 32 isolados de casos de mastite subclínica em ovinos, através da técnica de PCR-RFLP e sequenciamento do gene gap, e determinar a suscetibilidade dos isolados frente a nove agentes antimicrobianos, pela técnica de disco difusão em ágar. Foram obtidos quatro perfis no sequenciamento, sendo observada a presença de três espécies de SCN: Staphylococcus epidermidis (59,4%), Staphylococcus chromogenes (34,4%) e Staphylococcus devriesei (6,2%), pela primeira vez descrita na região Sul do país em casos de mastite ovina. Todos os isolados foram suscetíveis a cefalotina, ceftiofur e penicilina+novobiocina. Vinte e um isolados (65,6%) apresentaram resistência a pelo menos um agente antimicrobiano e onze isolados (34,4%) mostraram-se suscetíveis a todos os agentes testados. Quatro isolados (12,5%) apresentaram multirresistência e, entre estes, um isolado da espécie S. epidermidis apresentou resistência à oxacilina, confirmada através da amplificação do gene mecA por PCR. Os estudos permitem concluir que os SCN são os agentes etiológicos mais prevalentes relacionados com mastite subclínica em ovelhas leiteiras e sua presença tem correlação com CCS elevada. A determinação da CCS através de método manual demonstra que esta é uma ferramenta aplicável à espécie ovina. Além de se constituir em problema de sanidade animal, a mastite ovina, tem como consequência perdas econômicas ao produtor, SCN possuem potencial zoonótico, destacando a importância destes micro-organismos na saúde pública, tornando primordial a identificação destes agentes, através de ferramentas genotípicas seguras e confiáveis. / The mastitis is one of the major problems related to breeding of milk sheep due to the economic losses arising from the reduction in production, expenditure on medication and loss of animals. The Somatic Cell Count (SCC) and bacterial isolation are diagnostic tools indicative of mammary gland’s health that can be determined by automated method and manual method, through the counting of cell under a microscope, whereupon there are discussions concerning the appropriated staining to the ewe’s milk due to different cellularity in this species. This thesis comprises three studies that aim to make the diagnosis of subclinical mastitis in dairy sheep in Rio Grande do Sul - Brazil in a total of 315 milk samples originated from cases of this disease in dairy sheep. [Chapter 2] It were used 116 samples to identify and validate a method for microscopic SCC suitable for ovine specie. Therefore, were made glass slides for smear of 10 μL of milk in 1 cm2, where were tested xylol fixers and Carnoy solution and May-Grünwald (MG), Broadhurst- Paley (BP), Wright (W) and Panotic (P) dyes. Carnoy solution was elected, because this one allowed a better fixation of the milk film to the microscope slides, and BP staining as it allowed a good staining and visualization of cells and the differentiation of cytoplasmic corpuscles. The SCC values ranged from 2,6x104 to 4,4x106 cells.mL-1 and 1,9x104 to 8,1x106 cells.mL-1, respectively by automatic and microscopic methods. [Chapter 3] The purpose of this chapter was to determine the occurrence of subclinical mastitis in dairy sheep flock, by bacterial isolation and SCC. It was determined also the composition (fat, lactose, protein and total solids) of milk and the relationship between these parameters and the presence of mastitis. In order to do that, were collected 315 milk samples, individualized by teat, of which 85 (27%) were identified as subclinical mastitis and Staphylococcus coagulase negative (SCN) was the prevalent agent (64.7%), followed by Staphylococcus coagulase positive (SCP) (19. 1%). The SCC ranged from 2,5x103 to 9,3x106. There was significant higher SCC (p <0.0001) in samples with bacterial isolation. However, the same was not observed between the composition parameters. There was no correlation between the composition parameters and SCC. [Chapter 4] This chapter aims to identify the species of CNS in 32 isolated from cases of subclinical mastitis in sheep by PCR-RFLP and sequencing of the gap gene and determine the susceptibility of isolates face to nine antimicrobials, by disk agar diffusion technique. Four profiles were obtained in sequencing, revealing the presence of three species of SCN: Staphylococcus epidermidis (59.4%), Staphylococcus chromogenes (34.4%) and Staphylococcus devriesei (6.2%), first described in the south region of the country in cases of sheep mastitis. All isolates were susceptible to cephalothin, ceftiofur and penicillin + novobiocin. Twenty-one isolates (65.6%) showed resistance to at least one antimicrobial agent and eleven isolates (34.4%) were susceptible to all tested agents. Four isolates (12.5%) had multidrug resistance and, among these, an isolated of S. epidermidis was resistant to oxacillin, confirmed by amplifying the mecA gene by PCR. The studies support the conclusion that the SCN are the most prevalent etiologic agents related to subclinical mastitis in dairy sheep and their presence correlates with high SCC. The determination of SCC through manual method demonstrates that this tool is applicable to the ovine species. Besides being an animal health problem, the sheep mastitis results in a economic losses to producers, SCN have zoonotic potential, highlighting the importance of these microorganisms in public health, making it crucial to identify these agents through secure and reliable genotypic tools.

O leite é considerado um bom substrato para o desenvolvimento de diversos microrganismos, dentre os quais, uma variada gama de leveduras com distintas características biológicas. Em geral, as leveduras são consideradas saprotróficas, fazendo parte da microbiota residente, entretanto, em alguns casos, elas podem provocar infecções na glândula mamária. A contaminação do leite por microrganismos patogênicos, pode representar um risco para o consumidor, quando o produto é ingerido na forma in natura ou até mesmo beneficiada. Deve-se considerar, também, os reflexos negativos na produção de subprodutos, pois alterações nas características físicas e organolépticas podem afetar a qualidade e a vida-de-prateleira dos derivados lácteos. O objetivo desse estudo foi avaliar a ocorrência de fungos e bactérias presentes no leite de ovelhas normais e daquelas com mastite clínica. Foram obtidas 588 amostras de leite de ovelha sendo 106 oriundas de animais com mastite clínica e 482 de animais normais. Alíquotas de 0,1 mL de leite foram semeadas pela técnica de espelhamento em superfície em ágar acidificado Yeast Medium. A identificação das leveduras foi realizada através de testes rotineiramente utilizados na metodologia padrão, além da utilização do meio Hicrome Candida Differential Agar Base (HIMEDIA®) e do sistema API 20 C (Biomérieux®). Foram realizados exames bacteriológicos, a fim de obter uma correta avaliação do possível agente etiológico envolvido. Do total das amostras analisadas, 53 (27,04%) foram positivas no exame micológico, 134 (68,36%) positivas no exame bacteriológico e 9 (4,59%) apresentaram crescimento de Candida spp. e Staphylococcus coagulase-negativa. No cultivo micológico foram obtidos 60 isolados pertencentes aos seguintes gêneros: Candida spp. (70,00%), Rhodotorula spp (11,70%), Trichosporon spp. (6,70%), Geotrichum spp. (5,00%), Pichia spp. (5,00%) e Cryptococcus sp. (1,70%). Dentre o total de bactérias, foram isoladas: 110 (82,00%) Staphylococci coagulase-negativa, 14 (10,44%) bactérias Gram-negativas, 6 (4,48%) Staphylococcus aureus e 4 (3,00%) Streptococcus spp. Algumas bactérias Gram-negativas foram identificadas como Pasteurella spp., Rhodococcus spp. e Acinetobacter spp. O resultado microbiológico ressalta a importância da realização concomitante de exames micológicos e bacteriológicos para o correto diagnóstico e monitoramento dos casos de mastite em ovinos. Em relação à saúde pública, o consumo de leite de ovelhas e derivados lácteos contaminados com microrganismos potencialmente patogênicos, constitui um risco para indivíduos imunossuprimidos. No que concerne à produção de derivados lácteos feitos com leite de ovelha, principalmente queijos, a contaminação microbiológica pode afetar a qualidade e a vida-de-prateleira do produto final, causando considerável prejuízo econômico. / The milk is considered a good substrate for the development of various microorganisms, among them, a wide range of yeast strains with different biological characteristics. In general, yeasts are considered to be saprotrophic, part of the normal microflora, however, in some cases, they can cause infections in the mammary gland. Milk contamination by yeasts and yeast-like fungi may represent a risk to the consumer when the product is either consumed in natura or its derivatives. The negative impact on the production of milk derivatives should also be considered as the changes in physical and organoleptic characteristics can affect the quality and shelf-life of dairy products. The aim of this study was to evaluate the diversity of yeasts and bacteria in milk from healthy sheep and those with clinical mastitis. A total of 588 samples were obtained: 106 from animals with clinical mastitis and 482 from healthy animals. Aliquots of 0,1 mL from milk samples were spread in triplicate on acidified Yeast Medium agar. The identification of yeasts was carried out through tests routinely used in the standard methodology along with means Hicrome Candida Differential Agar Base (HIMEDIA®) and API 20 system (Biomerieux ®). Bacteriological studies were performed in order to obtain a correct evaluation of the possible etiological agent. Out of the samples analyzed, 53 (27,04%) showed a positive result in the mycological examination, 134 (68,36%) were positive in the bacteriological examination and 9 (4,59%) presented Candida spp. and coagulase-negative Staphylococcus growing. The mycological analysis showed the presence of 60 isolates belonging to the following genera were cultivated: Candida spp. (70%), Rhodotorula spp. (11.7%), Trichosporon spp. (6.7%), Geotrichum spp. (5%), Pichia spp. (5%) and Cryptococcus spp. (1.7%). The bacteriological analysis showed the presence of 110 (82.00%) coagulase-negative Staphylococci, 14 (10.44%) Gram-negative bacteria, 6 (4.48%) Staphylococcus aureus and 4 (3.00%) Streptococcus spp. Some Gram-negative bacteria were identified as Pasteurella spp., Rhodococcus spp. and Acinetobacter spp. The microbiological results emphasize the importance of the concomitant use of bacteriological and mycological examination for the diagnosis and monitoring of cases of mastitis in sheep. In relation to public health, the consumption of sheep milk and dairy products contaminated with potentially pathogenic microorganisms, constitutes a risk to immunosuppressed individuals. Regarding the production of dairy products made from ewe’s milk, especially cheese, microbiological contamination can affect the life quality and shelf-life of product, causing considerable economic loss.

O leite é considerado um bom substrato para o desenvolvimento de diversos microrganismos, dentre os quais, uma variada gama de leveduras com distintas características biológicas. Em geral, as leveduras são consideradas saprotróficas, fazendo parte da microbiota residente, entretanto, em alguns casos, elas podem provocar infecções na glândula mamária. A contaminação do leite por microrganismos patogênicos, pode representar um risco para o consumidor, quando o produto é ingerido na forma in natura ou até mesmo beneficiada. Deve-se considerar, também, os reflexos negativos na produção de subprodutos, pois alterações nas características físicas e organolépticas podem afetar a qualidade e a vida-de-prateleira dos derivados lácteos. O objetivo desse estudo foi avaliar a ocorrência de fungos e bactérias presentes no leite de ovelhas normais e daquelas com mastite clínica. Foram obtidas 588 amostras de leite de ovelha sendo 106 oriundas de animais com mastite clínica e 482 de animais normais. Alíquotas de 0,1 mL de leite foram semeadas pela técnica de espelhamento em superfície em ágar acidificado Yeast Medium. A identificação das leveduras foi realizada através de testes rotineiramente utilizados na metodologia padrão, além da utilização do meio Hicrome Candida Differential Agar Base (HIMEDIA®) e do sistema API 20 C (Biomérieux®). Foram realizados exames bacteriológicos, a fim de obter uma correta avaliação do possível agente etiológico envolvido. Do total das amostras analisadas, 53 (27,04%) foram positivas no exame micológico, 134 (68,36%) positivas no exame bacteriológico e 9 (4,59%) apresentaram crescimento de Candida spp. e Staphylococcus coagulase-negativa. No cultivo micológico foram obtidos 60 isolados pertencentes aos seguintes gêneros: Candida spp. (70,00%), Rhodotorula spp (11,70%), Trichosporon spp. (6,70%), Geotrichum spp. (5,00%), Pichia spp. (5,00%) e Cryptococcus sp. (1,70%). Dentre o total de bactérias, foram isoladas: 110 (82,00%) Staphylococci coagulase-negativa, 14 (10,44%) bactérias Gram-negativas, 6 (4,48%) Staphylococcus aureus e 4 (3,00%) Streptococcus spp. Algumas bactérias Gram-negativas foram identificadas como Pasteurella spp., Rhodococcus spp. e Acinetobacter spp. O resultado microbiológico ressalta a importância da realização concomitante de exames micológicos e bacteriológicos para o correto diagnóstico e monitoramento dos casos de mastite em ovinos. Em relação à saúde pública, o consumo de leite de ovelhas e derivados lácteos contaminados com microrganismos potencialmente patogênicos, constitui um risco para indivíduos imunossuprimidos. No que concerne à produção de derivados lácteos feitos com leite de ovelha, principalmente queijos, a contaminação microbiológica pode afetar a qualidade e a vida-de-prateleira do produto final, causando considerável prejuízo econômico. / The milk is considered a good substrate for the development of various microorganisms, among them, a wide range of yeast strains with different biological characteristics. In general, yeasts are considered to be saprotrophic, part of the normal microflora, however, in some cases, they can cause infections in the mammary gland. Milk contamination by yeasts and yeast-like fungi may represent a risk to the consumer when the product is either consumed in natura or its derivatives. The negative impact on the production of milk derivatives should also be considered as the changes in physical and organoleptic characteristics can affect the quality and shelf-life of dairy products. The aim of this study was to evaluate the diversity of yeasts and bacteria in milk from healthy sheep and those with clinical mastitis. A total of 588 samples were obtained: 106 from animals with clinical mastitis and 482 from healthy animals. Aliquots of 0,1 mL from milk samples were spread in triplicate on acidified Yeast Medium agar. The identification of yeasts was carried out through tests routinely used in the standard methodology along with means Hicrome Candida Differential Agar Base (HIMEDIA®) and API 20 system (Biomerieux ®). Bacteriological studies were performed in order to obtain a correct evaluation of the possible etiological agent. Out of the samples analyzed, 53 (27,04%) showed a positive result in the mycological examination, 134 (68,36%) were positive in the bacteriological examination and 9 (4,59%) presented Candida spp. and coagulase-negative Staphylococcus growing. The mycological analysis showed the presence of 60 isolates belonging to the following genera were cultivated: Candida spp. (70%), Rhodotorula spp. (11.7%), Trichosporon spp. (6.7%), Geotrichum spp. (5%), Pichia spp. (5%) and Cryptococcus spp. (1.7%). The bacteriological analysis showed the presence of 110 (82.00%) coagulase-negative Staphylococci, 14 (10.44%) Gram-negative bacteria, 6 (4.48%) Staphylococcus aureus and 4 (3.00%) Streptococcus spp. Some Gram-negative bacteria were identified as Pasteurella spp., Rhodococcus spp. and Acinetobacter spp. The microbiological results emphasize the importance of the concomitant use of bacteriological and mycological examination for the diagnosis and monitoring of cases of mastitis in sheep. In relation to public health, the consumption of sheep milk and dairy products contaminated with potentially pathogenic microorganisms, constitutes a risk to immunosuppressed individuals. Regarding the production of dairy products made from ewe’s milk, especially cheese, microbiological contamination can affect the life quality and shelf-life of product, causing considerable economic loss.