Les leucémies aigües se caractérisent par une prolifération incontrôlée et par l'augmentation accrue de cellules hématopoïétiques immatures dans la circulation sanguine conduisant à l'infiltration de nombreux organes. Un certain nombre de mécanismes tels que la protéolyse matricielle, l'adhérence cellulaire et l'angiogénèse participent à ce processus d'infiltration extramédullaire et favorisent l'apparition de rechute suite au traitement chimio-thérapeutique. Notre projet s'intéresse à l'éthoxyfagaronine, une benzo(c)phénantridine dérivée de la fagaronine. Au cours de notre étude, nous avons mis en évidence la capacité de l'Etxfag à réduire le potentiel invasif des cellules L1210 impliquant une diminution de l'expression de la MT-MMP à la membrane plasmique ainsi qu'une inhibition du système activateur du plasminogène. Nous mettons également en évidence la capacité de l'Etxfag à diminuer l'adhérence des cellules L1210 au peptide de fibronectine WQPPRARI. Cette diminution implique une déstructuration des radeaux lipidiques empêchant le clustering des intégrines beta1 et leur interaction avec le peptide de fibronectine. Nous montrons également la diminution de l'activation des voies de signalisation dépendantes des intégrines telles que FAK, PYK2 et la PI3-kinase. Notre étude a également porté sur les effets anti-angiogéniques de l'Extfag. Nous montrons la capacité de l'Extfag à réduire l'angiogénèse par l'utilisation de modèle in vitro, ex vivo et in vivo. Cet effet anti-angiogénique semble être lié à une altération des propriétés migratoires des cellules endothéliales. L'ensemble de ces résultats souligne le potentiel anti-leucémique de l'Extfag qui pourrait représenter un nouvel agent chimio-thérapeutique capable de prévenir la dissémination des cellules leucémiques. / Acute leukemias are characterized by uncontrolled proliferation and increased immature hematopoietic cells in the bloodstream leading to the infiltration of many organs. A number of mechanisms such as matrix proteolysis, cell adhesion and angiogenesis are involved in extramedullary infiltration process and promote the appearance of relapse after chemotherapeutic treatment. Our project focuses on the ethoxyfagaronine (Extfag), a benzo(c)phenanthridine derivative of fagaronine. In our study, we demonstrated the ability of the Extfag to reduce the invasive potential of L1210 cells by decreasing MT1-MMP expression to the plasma membrane and by inhibiting the plasminogen activator system. We also demonstrated the ability of Extfag to reduce the adhesion of L1210 cells to fibronectin peptide WQPPRARI. This reduction implies a disorganization of lipid rafts preventing clustering of beta1 integrins and their interaction with fibronectin peptide. We also have shown a decrease of integrin-dependent signaling pathways activation such as FAK, PYK2 and PI3-kinase. We have also studied the anti-angiogenic effects of Extfag. We have shown the ability of the Extfag to reduce angiogenesis by using in vitro, ex vivo and in vivo model. This antiangiogenic effect seems to be related to altered migratory properties of endothelial cells. Taken together, these results highlight the anti-leukemic potential of Extfag which could represent a new chemotherapeutic agent capable of preventing leukemic cells dissemination.

Depuis 2011, des mutations hétérozygotes germinales du gène GATA2 ont été identifiées chez des patients et familles, associées à des maladies hématologiques (myélodysplasie (MDS), leucémie aiguë myéloblastique (LAM)), immunologiques (déficit en cellules B, NK et monocytes (DMLC syndrome)) et vasculaires (syndrome d'Emberger, associant MDS et lymphœdème) 1-3. Le gène GATA2 code pour un facteur de transcription comportant 2 doigts de zinc, essentiel dans la régulation de la prolifération et de la différenciation des cellules progénitrices et des cellules souches hématopoïétiques (CSH). De nombreuses mutations différentes du gène GATA2 ont été identifiées (mutations ponctuelles non-sens ou faux sens, larges délétions, délétions focales d'un enhancer dans l'intron 4) sans claire corrélation entre le génotype et le phénotype. Nous avons d'abord retrouvé, par séquençage des phases codantes (exome) au sein d'une famille de 4 patients suivis à Toulouse, une mutation GATA2 R396Q. Dans un second temps, l'analyse d'une cohorte nationale a permis d'identifier des patients porteurs de mutations GATA2 présentant des phénotypes cliniques de type DMLC, LAM et/ou MDS 4. Actuellement, plus de 80 patients ont été identifiés au niveau national. Au niveau fonctionnel, nous avons initié l'analyse de 2 mutations ayant des conséquences clairement distinctes : la mutation R204X qui conduit à un codon stop dans le domaine précédant le premier doigt de zinc et la mutation ponctuelle R396Q, faux sens, située à la fin du deuxième doigt de zinc. Les modèles de différenciation in vitro en milieu semi-solide à partir de progéniteurs hématopoïétiques transduits par un vecteur rétroviral ont montré que les cellules transduites avec le mutant R396Q restent bloquées à un stade précoce de différenciation granulo-monocytaire, confirmé par l'analyse cytologique (aspect de myéloblastes). Le mutant R204X ne montre aucun effet différentiel en comparaison des cellules transduites par GATA2 sauvage. Le mutant R396Q, à la différence du mutant R204X, peut induire une transformation leucémique des cellules in vitro lors de réensemencements sériels des progéniteurs transduits. Ces cellules peuvent être cultivées indéfiniment en milieu liquide sans cytokines, initiant une lignée leucémique. La localisation cellulaire de ces 2 protéines mutantes est distincte, nucléaire pour le mutant R396Q (identique à la protéine normale) et cytoplasmique pour le mutant R204X par perte probable du signal de localisation nucléaire. L'analyse transcriptomique a retrouvé un ensemble de gènes différentiellement exprimés entre le mutant R396Q et le gène sauvage. Différents modèles animaux sont développés. Deux modèles murins, un de reconstitution hématopoïétique après transduction et un modèle knock-in inductible, sont en cours. La première expérience de reconstitution hématopoïétique n'a pas permis de mettre en évidence de phénotype leucémique après 6 mois de suivi, par probable rétention intramédullaire et différenciation terminale des cellules transduites. Nous avons également initié une collaboration permettant d'analyser l'effet des mutations de GATA2 ou équivalents ontogéniques (serpent, pannier) dans la drosophile. Les protéines GATA sont ainsi très conservées au cours de l'évolution et dans la drosophile, les protéines de la famille GATA ont un rôle essentiel dans la différenciation du système hématopoïétique de cet animal. / Since 2011, heterozygous germline GATA2 mutations have been identified in patients and families associated with hematological (myelodysplasia (MDS), acute myelogenous leukemia (AML)), immunological (B cells, NK cells and monocytes deficiency (DMLC syndrome)) and vascular diseases (Emberger syndrome, combining MDS and lymphedema) 1-3. The GATA2 gene encodes a transcription factor containing two zinc fingers critical for the regulation of the proliferation and differentiation of progenitor and hematopoietic stem cells (HSCs). Many different GATA2 mutations were identified (nonsense or missense point mutations, large deletions, focal deletions of an enhancer in intron 4) without clear correlation between genotype and phenotype. We first identified a R396Q mutation of GATA2 by sequencing the coding frames (exome) of cells in a family of 4 patients followed in Toulouse. Then the analysis of a national cohort identified additional patients carrying GATA2 mutations with various clinical phenotypes such as DMLC, AML and/or MDS 4. Currently, over 80 patients have been identified at the national level. Functionally, we initiated the analysis of 2 specific mutations with very distinct consequences: R204X a mutation leading to a stop codon before the first zinc finger and the R396Q a missense mutation located at the end of the second zinc finger. In vitro differentiation in semi-solid medium of hematopoietic progenitors transduced with a retroviral vector have shown that the cells transduced with the mutant R396Q remain blocked at an early stage of granulo-monocytic differentiation confirmed by cytological analysis (myeloblasts). The R204X mutant shows no differential effect compared to cells transduced with wild type GATA2. The R396Q mutant, unlike the R204X, can induce leukemic transformation of cells in vitro after serial re-seeding of transduced progenitors. These cells may be grown in liquid media without cytokines indefinitely, initiating a leukemia cell line. The cellular localization of these two mutant proteins is distinct, nuclear for the R396Q mutant (identical to the wild type protein) and cytoplasmic for the R204X mutant by probable loss of the nuclear localization signal. Transcriptomic analyses have shown differential gene expression between R396Q mutant and the normal gene. Various animal models are developed. Two mice models, one of hematopoietic reconstitution after retroviral transduction and one inducible knock-in model, are ongoing. The first hematopoietic reconstitution experiment failed to demonstrate leukemic phenotype after 6 months of follow-up, likely by intramedullary retention and terminal differentiation of transduced cells. We have also initiated collaboration to analyze the effect of mutations of GATA2 or equivalent ontogenetic genes (serpent, pannier) in Drosophila. GATA proteins are very well conserved during evolution and in Drosophila, the GATA family proteins have a critical role in the differentiation of the hematopoietic system.

Les syndromes myélodysplasiques (SMD) sont un ensemble d’hémopathies clonales de la cellule souche. Ils touchent les sujets âgés et se caractérisent par une hématopoïèse inefficace, une différenciation anormale et une transformation fréquente en leucémie aiguë myéloblastique (LAM). La prise en charge thérapeutique a considérablement évolué ces dix dernières années, principalement avec l’arrivée de la 5-azacytidine (Aza) dans les SMD de haut risque. Malheureusement, il existe fréquemment un échec ou une perte de réponse rapide au traitement responsable d’une survie médiane globale de seulement quelques mois. La compréhension des mécanismes d’action des agents hypométhylants, la mise en évidence des facteurs biologiques impliqués dans la résistance à l’Aza ou encore l’identification de nouvelles associations de molécules constitue donc un enjeu majeur. Plusieurs équipes, dont la nôtre, ont démontré que l’erlotinib (Erlo) (inhibiteur de l’activité kinase de l’EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor)) possède des effets antinéoplasiques dans les SMD/LAM. Compte tenu de sa toxicité modérée, cet inhibiteur de tyrosine kinase est actuellement en essai clinique en France et aux États-Unis dans les SMD en échec d’Aza. Dans ce travail, nous avons tenté de comprendre les mécanismes d’action impliqués dans l’activité de l’Aza et de l’Erlo seuls ou en association. Nous avons observé que l’Aza et la décitabine (un autre agent hypométhylant) induisent la déphosphorylation et la translocation dans le noyau du facteur de transcription FOXO3A où il réactive l’expression de gènes cibles tels que les facteurs pro apoptotiques PUMA et BIM. Cet effet observé rapidement, suggère un effet « off target » non lié à une reprogrammation épigénétique. La phosphorylation constitutive de FOXO3A étant considérée comme un facteur de mauvais pronostic dans les LAM, cette observation soulève l’intérêt potentiel des agents hypométhylants dans cette pathologie. Nous avons également identifié deux nouvelles cibles de l’Erlo : les SRC-kinases et la voie mTOR/p70S6K dont l’inhibition par des inhibiteurs biochimiques induit un arrêt du cycle cellulaire en G0/G1 sans apoptose ni différenciation confirmant l’hypothèse d’une action « multikinase » de l’Erlo. Par ailleurs, nous avons mis en évidence une activité synergique sur l’apoptose de l’association Aza et Erlo sur des lignées cellulaires de SMD/LAM et sur des cellules de patients. Cet effet n’a pas été retrouvé avec la décitabine ni les autres inhibiteurs de tyrosine kinase testés. La potentialisation de l’apoptose semble liée à plusieurs mécanismes associant l’augmentation de la concentration intracellulaire d’Aza via l’inhibition des transporteurs ABC, un arrêt de la prolifération, une activation des voies apoptotiques caspases-dépendantes et indépendantes et une activation des dommages à l’ADN. En conclusion, ce travail a permis l’identification de nouvelles cibles de l’Erlo et de l’AZA et a révélé un effet synergique entre ces deux molécules. Ces résultats précliniques encourageants suggèrent que cette association pourrait apporter un potentiel bénéfice chez les patients atteints de SMD/LAM, notamment ceux devenus réfractaires à l’Aza. / Myelodysplasic syndromes (MDS) constitute a diverse group of malignant clonal disorders that typically occur in elderly people. MDS are characterized by ineffective hematopoiesis, refractory cytopenias, morphologic dysplasia and increased potential to transform into acute myeloid leukemia (AML). Treatment of MDS has progressed considerably in recent years with the emergence of new approval agents such as azacytidine (aza)(a hypomethylating agent (HMA)) in higher-risk MDS. However, there are still a significant proportion of patients who do not respond to therapy with aza. Therefore, understanding the mechanisms of action of HMAs, identifying predictive factors for aza resistance and combining HMAs with other active compounds in MDS represent a challenging area to improve MDS/AML treatment. Previous works showed that erlotinib (an inhibitor of the epidermal growth factor receptor (EGFR)) exhibits antineoplastic effects in MDS/AML. Due to its limited toxicity profile, this tyrosine kinase inhibitor is currently being evaluated after failure of aza in two clinical trials. In this project, we aimed at understanding the molecular mechanisms involved in the activity of aza and erlo alone or in combination. We observed that aza and decitabine (another HMA related to aza) induces dephosphorylation and translocation to nucleus of the transcriptional regulator FOXO3A promoting the upregulation of the pro-apoptotic factors PUMA and BIM. This effect could be an “off target” effect and could contribute the bebenfical role of HMA in AML as constitutive phosphorylation of FOXO3A has been shown to be an adverse prognostic factor. We discovered new target for erlo, Src-kinase kinases and mTOR that are implicated in the cell-cycle arrest but not in the induction of apoptosis or differentiation confirming the “multikinase” activity of erlo. We found that the combination of aza and erlo demonstrated synergistic induction of apoptosis in MDS/AML cell lines and in some patient cells. This effect was not observed with decitabine or other tyrosine kinase inhibitors frequently used in onco-hematology. We demonstrated that potentiation of cell death is associated with different mechanisms such as intracellular accumulation of aza (via inhibition of ABC transporters), cell cycle arrest with inhibition of leukemic cells growth, caspase-dependent and -independent induction of apoptosis and DNA damage level. In conclusion, this work identified new targets of aza and erlo and revealed a synergistic induction of apoptosis upon co-treatment suggesting that this drug combination might be promising for SMD/AML treatment SMD/AML, especially the resistant patients.

Les leucémies aiguës lymphoblastiques T (LAL-T) sont caractérisées par la prolifération maligneincontrôlée de précurseurs lymphoïdes T bloqués dans la différenciation. Les stades d’arrêt dematuration observés dans les LAL-T reproduisent fidèlement les différentes étapes de la maturationthymique humaine. Ainsi nous avons montré que le facteur de transcription myéloïde CEBPA, expriméuniquement dans les précurseurs thymiques les plus immatures (ETP), est réprimé par un mécanismed’hyperméthylation dans les LAL-T à l’exception des formes les plus immatures. Il est aujourd’huicommunément admis que les LAL-T constituent une pathologie dite « multi-hits » où les oncogènesde type A affectent la différenciation tandis les oncogènes de type B sont impliqués dans la régulationdu cycle cellulaire, l’auto-renouvellement et/ou l’engagement dans la lignée T. La voie de signalisationde NOTCH, cruciale pour le développement lymphoïde T, est constitutivement activée par la survenuede mutations des gènes NOTCH1 et/ou FBXW7 (N/F) dans environ 60% des LAL-T. La valeurpronostique de ces mutations est controversée. Dans notre travail, nous avons montré que lesmutations de N/F sont plus fréquentes dans les LAL-T arrêtées à un stade de maturation cortical etconfèrent un bon pronostic qui semble toutefois dépendre de la chimiothérapie administrée. Grâce àl’étude de cette large cohorte de LAL-T nous avons pu également établir la fréquence de l’anomalieoncogénique CALM-AF10. Cette dernière est très fréquente dans les LAL-T qui se développent àpartir des ETP dites de mauvais pronostic. Nous avons montré que c’est la présence de l’anomalieCALM-AF10 qui confère le pronostic défavorable à ce sous-type de LAL-T. Contrairement à lalittérature nous n’avons pas retrouvé de valeur pronostique liée à la surexpression des gènes ERG etBAALC. L’étude des anomalies génétiques des LAL-T permet de mieux comprendre l’oncogénèse etd’identifier les anomalies avec une valeur pronostique. L’intérêt de ces travaux est d’apporter une aideaux cliniciens pour une stratification thérapeutique adaptée afin de donner les meilleures chances desurvie aux patients. / T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) are lymphoid neoplasms characterized by theproliferation of malignant T lymphoblasts arrested at early stages of maturation. Maturation arrest in TALLmirrors normal lymphopoiesis. Thus we have shown that the myeloid transcription factor CEBPA,expressed only in the most immature thymic precursors (ETP), is commonly repressed byhypermethylation in T-ALL with the exception of the most immature subset. It is now widely acceptedthat T-ALL is a “multi-hits” disease where the type A oncogenes affect the differentiation while type Boncogenes are involved in cell cycle regulation, self-renewal and T-cell commitment. The Notchsignaling pathway, crucial for T cell development, is constitutively activated by the occurrence ofmutations in NOTCH1 and /or FBXW7 (N / F) genes in approximately 60% of T-ALL. The prognosticvalue of these mutations is controversial. In our study, we showed that N/F mutations are morefrequently observed in T-ALL arrested at a cortical stage of maturation and confer a good prognosiswhich seems to be influenced by the therapeutic regimen. In this large cohort of T-ALL we could alsodetermine the frequency of the CALM-AF10 oncogenic abnormality. The latter is very common in TALLdeveloped from ETP wich are of very poor prognosis. We have shown that this is the presence ofCALM-AF10 which confers the poor prognosis in this subtype of T-ALL. Contrary to the litterature wedid not find any prognostic value associated with the overexpression of ERG and BAALC genes. Thestudy of genetic abnormalities in T-ALL provides a better understanding of oncogenesis and identifyabnormalities with prognostic value. The interest of this work is to assist clinicians for an efficienttherapeutic stratification to overcome the poor outcome of T-ALL patients.

Ces travaux de thèse ont porté sur le développement de formulations innovantes et nanoparticulaire, destinées à améliorer la prise en charge des patients atteints de leucémie aigüe myéloïdes (LAM). Cette amélioration de la qualité de vie peut passer par le développement d’une formulation orale de décitabine.Trois stratégies de formulations différentes ont été développées : deux formulations de nanocapsules lipides (LNCs) avec encapsulation ou de décitabine, ou d’une prodrogue de décitabine (décitabine(C12)2) . La troisième stratégie a été le développement de particules de type liposomal, dans lesquelles la décitabine a été encapsulée. Après avoir été caractérisée sur des critères physicochimiques, chacune des stratégies basées sur les LNCs a été évaluée par des essais in vitro pour évaluer la perméabilité intestinale de la décitabine lorsqu’elle a été encapsulée. Une des stratégies a permis d’accroitre la perméabilité, in vitro, de la décitabine. L’activité sur la prolifération cellulaire a ensuite été évaluée sur des cellules humaines de LAM. Il a été démontré que l’encapsulation dans les LNCs améliore l’activité de la décitabine et de la décitabine (C12)2. Après l’ensemble de ces essais, en vue d’évaluer le potentiel avantages de ces formulations pour augmenter la demi-vie plasmatique de la décitabine, leurs stabilités dans du plasma humain a été évaluée. La décitabine (C12)2 libre et encapsulée permettent de limiter la dégradation rapide de la décitabine. Finalement, une étude de pharmacocinétique a été mise en place. L’encapsulation de la décitabine, en synthétisant au préalable une prodrogue permet d’augmenter les concentrations maximales atteintes. / The aim of this phD work was to develop nanoparticle formulations to improve patients’quality of life in case of acute myeloid leukemia (AML). These formulations could, for example, allow an oral administration of decitabine. Three different formulations were developed: two were based on lipid nanocapsules (LNCs) with an encapsulation of decitabine or a decitabine prodrug (decitabine(C12)2). The third strategy was aliposomal formulation with a decitabine encapsulation. After being characterized on physico-chemical parameters, in vitro intestinal permeability studies were performed on LNCs strategies. One strategy was able to enhance decitabine permeability. Cell proliferation studies performed on human AMLcell lines showed that encapsulations into LNCs improve decitabine and decitabine(C12)2 activities. In order to evaluate the potential of these formulations to enhance decitabine plasma half-life, their stabilities in human plasma were then assayed. Free decitabine(C12)2 or encapsulated into LNCs has been shown to limit the rapid decitabine degradation. Finally, pharmacokinetic studies were performed. Decitabine encapsulation into LNCs with a previous decitabine prodrug synthesis was able to increase maximal plasma concentrations.

Notre groupe a montré que l’hypoxie sévère (0.1% O2) induit un arrêt du cycle cellulaire en G0 des cellules humaines CD34+ et des cellules murines FDCP mix. Peu d’études ont exploré l’existence de Cellules Initiatrices de Leucémie (CIL) dans les LAL et leur rôle dans les rechutes. Notre projet s’est focalisé sur l’effet de l’hypoxie sévère sur la quiescence des CIL dans les LAL, qui pourrait être responsable d’un pourcentage de rechutes. En effet dans la niche hématopoïétique, ou sont localisées les Cellules souches hématopoïétiques et probablement les CIL, la concentration d’oxygène avoisinerait 0,1%.Nous avons utilisé la lignée de LAL NALM6 pour explorer les effets de l’hypoxie sévère sur leur survie, leur cycle cellulaire et leur chimiorésistance. Nos résultats ont mis en évidence qu’une culture à 0.1% O2 durant 7 jours de la lignée NALM6: - inhibe leur prolifération sans surmortalité, - révèle une population restreinte de CIL quiescentes et chimiorésistantes capables d’induire une leucémie dans des souris. Nous avons recherché les relations entre l’hypoxie sévère et quelques caractéristiques des cellules primaires de patients atteints de LAL : existence et rôle de CIL résistantes à l’hypoxie et aux agents thérapeutiques conventionnels des LAL ; localisation de ces cellules résiduelles dans la moelle osseuse des souris xénogreffées. Nos résultats suggèrent que certaines rechutes de LAL pourraient être dues à la persistance à long terme de « quiescent/dormant » CIL dans les niches hypoxiques de la moelle osseuse. Ce modèle est intéressant pour explorer les mécanismes in vitro et in vivo de chimiorésistance dans les LAL et le rôle de l’environnement dans ce phénomène. / Our group showed that severe hypoxia (0.1% O2) induces G0 cell-cycle-arrest of human CD34+ cells and of murine FDCP-mix Cells. Few studies explored the existence of quiescent Leukemia Initiating Cells (LIC) in ALL and their role in primary chemoresistance and relapses. Our project is focused on the effect of very low O2 concentrations in the maintenance of quiescent LIC in ALL, that could be responsible of a percentage of relapses. Indeed in bone marrow niches, where hematopoietic stem cells and probably LIC are located, the O2 concentrations are below 0.1%.In the present study we used the NALM-6 ALL cell line to explore the effects of culture at 0.1% O2 on their survival, cell cycle and chemoresistance. Our results evidence that a 7 days culture of NALM-6 cells at 0.1% O2: - inhibits their proliferation without major cell death; - reveals a restricted LIC population of quiescent and chemoresistant LIC; - maintains quiescent chemoresistant LIC that induce leukemia when injected in immunodeficient mice. We investigated the relationships between severe hypoxia and some characteristics of ALL primary cells obtained from patients: existence and role of quiescent chemoresistant LICs in ALL relapses; location of these residual cells inside the bone marrow of engrafted mice. Our results suggest that some ALL relapses could be due to the long term persistence of “quiescent / dormant” LIC in hypoxic bone marrow niches. This model is of interest for exploring the in vitro and in vivo (xenograft) mechanisms of chemoresistance in ALL and the role of the bone marrow environment in this phenomenon.

Objectifs. L’objectif principal de cette étude est d’évaluer l’influence du groupe pronostique auquel le patient est attribué au moment du diagnostic et du protocole de traitement sur le développement d’anomalies dentaires et leur sévérité chez les enfants traités pour la leucémie aigüe lymphoblastique (LAL). L’étude comporte un objectif secondaire : confirmer les résultats des études précédentes ayant montré un nombre et une sévérité plus élevée d'anomalies dentaires chez le groupe 0-5 ans. Hypothèse. Chez des enfants ayant été traités pour la LAL, la prévalence et la sévérité des anomalies dentaires seront plus élevées chez ceux ayant fait partie du groupe pronostique de très haut risque, ayant reçu une combinaison de chimiothérapie, de radiothérapie et de greffe de moelle osseuse et ayant eu leur diagnostic avant l’âge de 6 ans. Méthodes. Des patients âgés entre 14 et 25 ans et ayant reçu un diagnostic de LAL avant l’âge de 11 ans ont été recrutés au Centre Hospitalier Universitaire Sainte-Justine. Un examen dentaire et radiologique ont été effectués. Des données concernant le diagnostic, le groupe pronostique et le type de traitement reçu ont été notées à partir du dossier médical des participants. Résultats. Des défauts dentaires ont été observés chez 26 (50,98%) des 51 sujets, la microdontie étant l’anomalie la plus prévalente (39,22%). Les participants des catégories haut risque et très haut risque ayant reçu de la chimiothérapie haute dose étaient significativement plus à risque de présenter une anomalie dentaire comparé à ceux de la catégorie risque standard ayant reçu la chimiothérapie conventionnelle (p=0.046). Un âge ≤ 5 ans au diagnostic augmentait significativement la prévalence et la sévérité des anomalies dentaires (p<0.001). Conclusion. Le traitement de la LAL pédiatrique affecte l’odontogénèse. Le groupe pronostique et le protocole de traitement ont augmenté le risque de développer au moins une anomalie dentaire. L’âge au diagnostic a affecté la prévalence et la sévérité des anomalies dentaires. / Objective. The main objective of this study is to assess the influence of the risk group to which the patient is assigned at diagnosis and the treatment protocol on the development and severity of dental anomalies in children treated for acute lymphoblastic leukemia (ALL). The secondary aim was to confirm the results of previous studies that showed an increased number and severity of dental defects in children aged 0 to 5 years old at diagnosis. Hypothesis. In children treated for ALL, the prevalence and severity of dental anomalies will be the highest in those who were in the very high risk prognostic group, who received a combination of chemotherapy, total body irradiation and hematopoietic stem cell transplantation and who were diagnosed before the age of 6 years old. Methods. Patients aged between 14 and 25 years old who received diagnosis of ALL before the age of 11 years were recruited at the Sainte-Justine Mother and Child University Hospital Center. Dental and radiographic examinations were performed. Data about the diagnosis, risk group and type of treatment received were collected from medical records. Results. Dental anomalies were recorded in 26 (50.98%) out of 51 subjects and microdontia was the most prevalent dental defect (39.22%). Participants in the high risk and very high risk categories receiving high-dose chemotherapy were significantly more likely to show a dental anomaly compared to those in the standard risk group receiving conventional chemotherapy (p=0.046). Age ≤5 years at diagnosis significantly increased the prevalence of dental anomalies and the severity rating (p<0.001). Conclusion. Therapy for childhood ALL affects the developing dentition. Risk group and treatment protocol influenced the odds of developing at least one dental anomaly. Age at diagnosis affected both the prevalence and severity of dental defects.

Stimuler le système immunitaire est un enjeu majeur dans le traitement des leucémies aigües. Nous avons centré notre étude sur la leucémie aigüe myéloïde (LAM) et la leucémie à cellules dendritiques plasmacytoïdes (LAPDC). Dans une première partie, nous avons étudié les médicaments immunomodulateurs (IMiDs) utilisés dans le traitement du myélome multiple et des syndromes myélodysplasiques à délétion 5q. Les IMiDs présentent des propriétés anti-angiogéniques, anti-prolifératives, pro-apoptotiques, et immunomodulatrices en particulier sur les cellules NK (Natural Killer). Nous avons évalué les effets anti-leucémiques des IMiDs (lenalidomide et pomalidomide) dans le but d’améliorer l’activité cytotoxique des NK dans la LAM. Nous avons mis en évidence une altération de la survie des blastes de LAM par les IMiDs in vitro, et dans un modèle in vivo de greffe dans les souris immunodéficientes NOD/SCID/IL2rg-/- (NSG). Nous avons également montré une sensibilisation par les IMiDs des blastes de LAM à la lyse par les NK allogéniques, indépendamment de la cible moléculaire connue, le cereblon. Le traitement des blastes de LAM par IMiDs stimule les fonctions NK. Enfin, nous avons décrit des modifications phénotypiques induites par les IMiDs sur les récepteurs NK, et une diminution d’expression de HLA-classe I sur les cellules de LAM. Ces résultats encouragent la poursuite du développement des IMiDs dans la LAM, en particulier les associations stimulant les fonctions NK. Dans une seconde partie, nous avons développé un modèle murin de LAPDC dans la souris NSG. Cet outil préclinique est indispensable dans l’élaboration de stratégies d’immunothérapie dans les leucémies aigües. / Boosting the Immune System is a major challenge in the treatment of acute leukemias. We focused our study on acute myeloid leukemia (AML) and plasmacytoid dendritic cell leukemia (BPDCN). In the first part, we studied immunomodulatory drugs (IMiDs) that are currently used in the treatment of patients with myeloma and myelodysplastic syndrome with 5q deletion. IMiDs exhibit anti-angiogenesis, anti-proliferative, pro-apoptotic, and immunomodulatory properties especially on NK cells and T lymphocytes. We investigated the anti-leukemic effects of two IMiDs (lenalidomide and pomalidomide) in order to improve NK cell cytotoxic activity in AML. We have shown that IMiDs impaired survival of AML blasts in vitro, and in vivo in NOD/SCID/IL2rg-/- (NSG) murine model. In addition, IMiDs treatment sensitized AML blasts to allogeneic NK cell mediated lysis, independently of Cereblon, the known molecular target of IMiDs. IMiDs treatment of AML blasts enhanced NK cell functions such as degranulation and cytokine production. Finally, we have described phenotypic changes induced by IMiDs on NK receptors, and a down-regulation of HLA-class I on AML blasts. These results encourage continuing investigation for the use of IMiDs in AML, especially in combination with immunotherapies based on NK cells. In a second part, we have developed a murine model of plasmacytoid dendritic cell leukemia (BPDCN) in NSG mice. Murine model of leukemia are essential preclinical tools in the development of new immunotherapies in acute leukemias.

Les kinases de la famille Pim sont impliquées dans de nombreux cancers hématologiques dont la leucémie aigüe myéloïde (LAM) et le myélome multiple. Contrairement à la plupart des autres protéines kinases dont l’activation nécessite la phosphorylation préalable du domaine catalytique, l’activité des Pim kinases est constitutive. Les mécanismes de régulation de l’expression de Pim2 ainsi que ses mécanismes d’action sont très peu connus. Une partie de mon projet a consisté en l’étude de l’expression et de la stabilité de Pim dans des cellules de LAM et de myélome. J’ai montré que l’expression de Pim2 est régulée au niveau transcriptionnel par STAT5. Les trois isoformes de Pim2 ont une demi-vie très courte. Leur rapide dégradation semble constitutive et indépendante des relais de signalisation intracellulaire. Elle implique la machinerie du protéasome mais ne semble pas nécessiter l’ubiquitination préalable de la protéine. Les formes de Pim2 qui s’accumulent dans les cellules sous l’action des inhibiteurs du protéasome sont constitutivement actives. Ces premières données m’ont conduit à envisager l’intérêt d’inhibiteurs de Pim dans le myélome multiple, où l’inhibition du protéasome comme traitement favorise l’accumulation de cette kinase oncogénique. La seconde partie de mon projet a consisté en l’identification de substrats et de partenaires potentiels de Pim2 dans les LAM. Pour cela, j’ai mis au point une méthode de marquage métabolique couplée à une analyse phosphoprotéomique quantitative globale, ainsi qu’une analyse de l’interactome de Pim2 après avoir produit un anticorps contre cette protéine. Les informations obtenues m’ont permis de montrer l’activation de la voie mTORC1 par Pim2 et d’identifier la Polo-Like Kinase (PLK1) comme un nouveau substrat et partenaire de Pim2. Mes résultats montrent une colocalisation de Pim2 et de PLK1 au cours des différentes phases de la mitose et en particulier au niveau du corps intermédiaire lors de la séparation des cellules filles. / The kinases of Pim family are implicated in many haematological cancers, whose Acute Myeloid Leukemia (AML) and multiple myeloma. Contrary of the most others proteins kinases which needs activation by the preliminary phosphorylation of catalytic domain, the activity of Pim kinases is constitutive. The regulation of Pim2 expression and its mechanisms of action are not well-known. One part of my project consisted in the study of the expression and stability of Pim2 in AML and myeloma cells. I have shown that the expression of Pim2 is regulated at transcriptional level by STAT5. The three isoforms of Pim2 have very short half-lives. Theirs fast degradations seem to be constitutive and independent of intracellular pathway. It involves the proteasome machinery but not seems to need the preliminary ubiquitination of the protein. Forms of Pim2 accumulated in the cells when the proteasome is inhibited are actives. These firsts data drove me to think about the interest of Pim inhibitor in multiple myeloma, where the using of proteasome inhibitor as treatment increase the accumulation of this oncogenic kinase. The second part of my project was to identify the potentials substrates and partners of Pim2 in AML. In this aim, I developed a method of metabolic labelling coupled with a global quantitative phosphoproteomic approach, as well as a specific antibody targeted against this protein to realize an interactome analysis of Pim2. The informations obtained allowed me to show the activation of mTORC1 pathway by Pim2 and to identify the Polo-Like Kinase (PLK1) as a new substrate and partner of Pim2. My results show that Pim2 and PLK1 are colocalized during the differents mitotic phases, particularly at the midbody level during the separation of cell.

Notre groupe a montré que l'hypoxie sévère (0.1% O2) induit un arrêt du cycle cellulaire en G0 des cellules humaines CD34+ et des cellules murines FDCP mix. Peu d'études ont exploré l'existence de Cellules Initiatrices de Leucémie (CIL) dans les LAL et leur rôle dans les rechutes. Notre projet s'est focalisé sur l'effet de l'hypoxie sévère sur la quiescence des CIL dans les LAL, qui pourrait être responsable d'un pourcentage de rechutes. En effet dans la niche hématopoïétique, ou sont localisées les Cellules souches hématopoïétiques et probablement les CIL, la concentration d'oxygène avoisinerait 0,1%. Nous avons utilisé la lignée de LAL NALM6 pour explorer les effets de l'hypoxie sévère sur leur survie, leur cycle cellulaire et leur chimiorésistance. Nos résultats ont mis en évidence qu'une culture à 0.1% O2 durant 7 jours de la lignée NALM6: - inhibe leur prolifération sans surmortalité, - révèle une population restreinte de CIL quiescentes et chimiorésistantes capables d'induire une leucémie dans des souris. Nous avons recherché les relations entre l'hypoxie sévère et quelques caractéristiques des cellules primaires de patients atteints de LAL : existence et rôle de CIL résistantes à l'hypoxie et aux agents thérapeutiques conventionnels des LAL ; localisation de ces cellules résiduelles dans la moelle osseuse des souris xénogreffées. Nos résultats suggèrent que certaines rechutes de LAL pourraient être dues à la persistance à long terme de " quiescent/dormant " CIL dans les niches hypoxiques de la moelle osseuse. Ce modèle est intéressant pour explorer les mécanismes in vitro et in vivo de chimiorésistance dans les LAL et le rôle de l'environnement dans ce phénomène.