Orientadores: Irene Lorand-Metze, Fernando Ferreira Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-18T22:11:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mello_MarianaRezendeBandeirade_D.pdf: 5178635 bytes, checksum: 8ac6a3134a752be699d5f1d5d6d8ba71 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A classificação atual da OMS para LMA reconhece a importância da pesquisa de anormalidades genéticas para diagnóstico e manejo adequado do paciente. A textura da cromatina dos núcleos está relacionada com fenômenos epigenéticos como a metilação. Nosso estudo teve como objetivos estudar o status de metilação dos genes CDKN2B (p15), CDKN2A (p16), CDKN1C (p57), TP73 (p73), ESR1 (ER) e ABCB1 (MDR1), verificar a freqüência das mutações nos genes FLT3 e NPM1 e analisar parâmetros da morfometria e textura da cromatina. Verificamos também a associação entre o perfil imunofenotípico, textura nuclear e características moleculares. Além disso, analisamos a relação destas variáveis com a sobrevida global. Foram estudados 106 pacientes com LMA de novo (19 com LMA M3 e 87 com outros subtipos de LMA) diagnosticados no nosso Serviço. Nas LMAs M3 foi encontrado 15,8% de pacientes com FLT3-TKD e 10,5% FLT3-ITD. Os pacientes com LMA M3 foram mais jovens, apresentaram menor número de leucócitos e plaquetas. Tiveram também maior expressão de CD45 e MPO do que os outros subtipos de LMA. Os pacientes com LMA M3 tiveram melhor sobrevida que os outros subtipos. Dentre esses pacientes as LMA M3 FLT3-ITD+ apresentaram pior sobrevida. O desvio padrão do nível de cinza foi um fator independente de prognóstico. Em relação aos casos de LMA não M3 foi encontrado 23,3% dos pacientes com presença da mutação FLT3-ITD, 8,1% FLT3- TKD e 29,1% da mutação no gene NPM1. As mutações nos genes NPM1 e FLT3 foram mais frequente em pacientes com cariótipo normal. Dos pacientes com outros subtipos de LMA, 3,4% apresentaram metilação no gene ESR1, 26,4% no gene CDKN2B, 11,5% no gene CDKN2A, 1,1% no CDKN1C e 23,0% no gene TP73. Os pacientes que apresentaram o gene CDKN2B metilado tiveram menor dosagem de hemoglobina e expressão do CD13. Os pacientes com metilação no gene TP73 apresentaram menor contagem de leucócitos, expressão de CD45, CD13, CD33 e MPO. Os pacientes com LMA sem maturação apresentaram menor R245. Na análise de sobrevida dos pacientes com LMA, excluindo M3, os casos com NPM1+ FLT3-ITD- tiveram melhor sobrevida. O R245, a entropia e a mutação FLT3-ITD foram fatores independentes de prognóstico. A frequência das mutações e de metilação encontrada foram semelhantes a outros estudos. O R245 pode ser uma variável nova para avaliação da textura da cromatina / Abstract: The WHO classification for acute myeloid leukemia (AML) has emphacized the cytogenetic and molecular aspects for diagnosis and proper management of the patients. The nuclear chromatin texture is related to epigenetic phenomena such as methylation. In our study we examined the frequency of mutations in FLT3 and NPM1 genes, the methylation status of genes CDKN2B (p15), CDKN2A (p16), CDKN1C (p57), TP73 (p73), ESR1 (ER) and ABCB1 (MDR1) and analyzed features of nuclear morphometry and chromatin texture. We studied the association between the immunophenotypic profile, nuclear texture and molecular features. In addition, we analyzed the relationship between these variables and overall survival of the patients. We studied 106 patients with de novo AML: 19 with promyelocytic leukemia (APL) and 87 with other subtypes of AML diagnosed in our Service. Patients with APL were younger, had lower peripheral leukocyte counts and platelets. They also showed a higher expression of CD45 and MPO than other subtypes of AML. Among them, 15.8% presented FLT3-TKD and 10.5% showed FLT3- ITD. CDKN2B was methylated in 21.0%, CDKN2A in 21.0% and TP73 in 10.5% of the patients. Methylation in CDKN1C, ER and MDR1 were not found. Patients with APL had better survival than other subtypes. The standard deviation of gray level was an independent factor of prognosis. Among the other cases of AML, we found the FLT3-ITD mutation in 23.3%, the FLT3-TKD mutation in 8.1%, and 29.1% of the patients had mutation of the NPM1 gene. Mutations in NPM1 and FLT3 were more frequent in patients with a normal karyotype. Among these patients, 3.4% had methylation of the ESR1 gene, 26.4% in CDKN2B, 11.5% in CDKN2A, 1.1% in the CDKN1C and 23.0% in TP73. Patients with methylated CDKN2B showed lower hemoglobin levels and a lower expression of CD13. Patients with methylation in the TP73 gene had lower peripheral leukocyte counts and lower expression of CD45, CD13, CD33 and MPO. Patients with AML without maturation had lower R245. In the survival analysis of patients with AML, except APL, the cases with NPM1+ FLT3 ITD- had better survival. The R245, entropy and FLT3-ITD mutation were independent predictors of prognosis. The frequency of mutations and methylation found were similar with other studies. The R245 can be a new variable for evaluation of chromatin texture / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

Orientador: Valdemiro Carlos Sgarbieri / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-16T14:32:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ziegler_FabianeLaFlor_D.pdf: 4176640 bytes, checksum: fccef651838684499cf4cf698073b39e (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O objetivo geral da presente pesquisa foi avaliar o efeito de um concentrado de proteínas do soro do leite bovino (WPC) enriquecido com o fator de crescimento e transformação beta (TGF-?) e lactoferrina, em pacientes pediátricos com Leucemia Mieloide Aguda - LMA (Capítulo 2); desenvolver um modelo de mucosite gastrointestinal induzida por quimioterápicos, em ratos Wistar, para posterior avaliação da eficácia das proteínas lácteas na proteção da mucosa (Capítulo 3); avaliar os efeitos pelo WPC e por uma caseína comercial, in vivo e in vitro sobre células leucêmicas humanas transplantadas em camundongos imunodeficientes (NOD/SCID) e em cultura de células (Capítulo 4). Para todos os estudos foi utilizado WPC enriquecido com TGF-??e lactoferrina doado pela empresa Hilmar Cheese Company (Cal, USA). No capítulo 2 realizou-se estudo de intervenção nutricional, prospectivo, duplo cego com placebo controlado, onde foram avaliados 21 pacientes, entre 0 a 19 anos, virgens de terapia, admitidos no Centro Infantil Boldrini, Campinas - SP. Foram avaliados quanto à adequação da ingestão alimentar, estado nutricional (EN), dosagem de glutationa (GSH) eritrocitária, hemograma, produção de citocinas no plasma e em cultura de células, imunoglobulina A salivar e evolução da mucosite. Foram comparados os resultados bioquímicos dos pacientes com um grupo controle de indivíduos saudáveis da mesma faixa etária. Utilizou-se o software SPSS para as análises estatísticas (p<0,05). O protocolo de pesquisa foi aprovado pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP) com registro 14097. Tomados em conjunto os resultados indicaram que o WPC apresentou efeito positivo sobre o EN dos pacientes, porém não influenciou na composição corporal. A distribuição % dos macronutrientes estava adequada em todos os tempos para os grupos WPC e maltodextrina (placebo), mas o % de adequação dos micronutrientes não atendia às recomendações em sua maioria. As análises bioquímicas não evidenciaram superioridade do WPC em relação ao placebo. Não houve diferença significativa entre os grupos sobre a avaliação clínica da mucosite oral. Na comparação dos pacientes com LMA e indivíduos saudáveis (controle) pode-se constatar níveis estatisticamente superiores do controle nos parâmetros bioquímicos de albumina, pré-albumina, eritrócitos, hematócrito, hemoglobina, plaquetas, produção de fator de necrose tumoral alfa (TNF-?), interleucina 6 (IL-6), interleucina 10 (IL-10) e interferon gama (IFN-?) quando estimuladas pela vacina BCG liofilizada e produção de IL-6 quando estimulada por fitohemaglutinina (PHA). No entanto, para a concentração de GSH eritrocitária e produção espontânea das citocinas TNF-??e IFN-??verificou-se que os pacientes com LMA apresentaram níveis estatisticamente superiores em relação ao controle saudável. No capítulo 3 foi elaborado um protocolo de indução de mucosite em ratos Wistar testando-se os quimioterápicos 5-Fluoruracila (5-FU) e sulfato de vincristina (SV), em administrações de diferentes concentrações e número de doses. Através desse experimento concluiu-se que o SV não foi um bom agente indutor de mucosite, ao contrário do 5-FU. A partir desses resultados foram realizados experimentos com 5-FU visando ajuste das condições dos experimentos inclusive do número, periodicidade e concentração das doses do quimioterápico. O melhor modelo de indução de mucosite gastrointestinal foi obtido através da administração de 3 doses de 5-FU com intervalo de 3 dias entre cada dose, nas concentrações entre 50 e 70 mg/Kg/dose. Os índices bioquímicos não foram influenciados pelo efeito da peletização da dieta e, de modo geral não houve diferença significativa entre os grupos tratados com WPC e com caseína. Independente da natureza da proteína (WPC ou caseína) observou-se maior proteção contra o 5-FU quando os animais receberam as dietas previamente à administração do quimioterápico. Ao contrário do esperado, o estímulo imunológico com hemáceas de carneiro não promoveu aumento nos níveis de GSH nos eritrócitos. As proteínas do soro do leite protegeram a mucosa, em termos de promover menor intensidade de mucosite, nos períodos mais críticos (72h após a 2ª e a 3ª dose de 5-FU) nas regiões de maior prevalência, duodeno e jejuno, quando se comparou com os resultados obtidos para os grupos tratados com caseína. Para os experimentos in vivo, do capítulo 4, utilizaram-se células de leucemia linfóide aguda (LLA) pediátrica humana, isoladas de pacientes do Centro Infantil Boldrini, as quais foram inoculadas em camundongos NOD/SCID. Nesses experimentos, utilizou-se dieta AIN-93G com WPC ou caseína e dieta comercial e o quimioterápico SV. Avaliou- se: peso corporal, consumo de dieta, razão entre peso dos órgãos (rim, baço e fígado) e peso corporal, evolução da leucemia, tempo de sobrevida, hemograma e níveis de glutationa em eritrócitos do sangue periférico. Nos experimentos in vitro foram usadas 6 linhagens celulares: K562 (Leucemia Mieloide Crônica), Nalm-6 (Leucemia Linfóide Aguda do tipo B), Jurkat (Leucemia Linfóide Aguda do tipo T), CEM (Leucemia Linfóide Aguda do tipo T), RAMOS (Linfoma Burkitt) e HL-60 (Leucemia Mieloide Aguda). Foram testadas a citotoxicidade (IC50) do WPC, a viabilidade celular e os níveis de glutationa total nas células leucêmicas estudadas em 4 tempos (0, 24, 48 e 72h) e 4 condições diferenciadas (células; células + WPC; células + WPC + ARAC-C; células + ARA-C). Todos os resultados, tanto do capítulo 3 como do 4, foram analisados através do software ¿Statística: Basic Statistics and Tables¿. Não houve diferença entre o WPC e a caseína em relação aos parâmetros avaliados nos experimentos in vivo, exceto na análise de Doença Residual Mínima (DRM), na qual a caseína se mostrou mais efetiva que o WPC. Constatou-se superioridade do WPC sobre os resultados de peso corporal, razão dos rins e baço pelo peso e evolução da leucemia em relação aos animais tratados com dieta comercial. Não foi possível verificar um efeito sinergístico entre o WPC e o quimioterápico sulfato de vincristina. No que se refere aos experimentos in vitro, o WPC apresentou IC50 para Nalm-6 de 6,72 mg/mL e para a linhagem CEM de 11,84 mg/mL. Verificou-se que as linhagens K562, Nalm-6 e HL-60 apresentaram perfis semelhantes em relação à viabilidade celular. No entanto, em relação à produção de glutationa total, cada linhagem comportou-se de maneira diferenciada, sendo que a maior produção em todas as condições e tempos estudados, foi para a linhagem HL-60 seguida pela K562 / Abstract: The objective of this research was to evaluate the effect of a bovine milk whey protein concentrate (WPC), enriched with transforming growth factor beta (TGF-ß) and lactoferrin in pediatric patients with Acute Myeloide Leukemia (AML) (Chapter 2); in a chemotherapic-induced gastrointestinal mucositis model in Wistar rats (Chapter 3); evaluate in human leukemic cells in culture or transplanted into immune-deficient mouse NOD/SCID (Chapter 4). WPC enriched with TGF-ß and lactoferrin was donated by Hilmar Cheese Company (Cal, USA). Chapter 2 describes a randomized, double-blind, placebo controlled, prospective clinical trial of nutritional intervention with participation of 21 therapy-naïve patients with AML aged 0-19 years from Centro Infantil Boldrini, Campinas, SP. Food intake, nutritional status, red blood cell glutathione (GSH) concentration, haemogram, cytokine concentration in plasma and cell cultures, salivary immunoglobulin A (IgA) and evolution of mucositis were studied. Health individuals at the same age range were used as a control group. The statistical analysis was done using SPSS software (p < 0.05). The research protocol was approved by the National Committee of Ethics in Research (CONEP), resgistered by the number 14097. WPC showed a positive effect in the nutritional status of the patients, but it did not influence their body composition. Percentual distribution of macronutrients was adequate in all times of analyses for both WPC and maltodextrin (placebo) groups, but the percentage of adequacy of the majority of micronutrients did not reach recommendation. Other laboratorial analyses and evolution of mucositis did not show any difference between WPC and placebo groups. Comparison of AML patients with a group of healthy control showed higher concentrations of albumin, prealbumin, haematocrit, hemoglobin, platelets, Bacillus Calmette-Guérin (BCG) vaccine-stimulated tumor necrosis factor alpha (TNF-a), interleukin 6 (IL-6), interleukin 10 (IL-10) and interferon gamma (IFN-?) and phytohemaglutinin (PHA)- stimulated IL-6 in controls. On the other hand, patients with AML had higher red blood cell glutathione concentration and spontaneous TNF-a and IFN-??production in comparison to controls. Chapter 3 describes the experiments envolved in the development of a chemotherapic-induced model of mucosites, in Wistar rats, in which 5-Fluoruracila (5-FU) and Vincristine Sulfate (VS) were used, in various concentrations and number of doses. Through this experiment it was concluded that the VS was not a good promoter of mucositis in rats, unlike 5-FU. From these results, experiments were performed with 5-FU considering conditions of the experiments including the number, frequency and concentration of the doses of chemotherapic. The best model was obtained by the administration of 3 doses of 5-FU, each with a 3-days interval and concentrations in the range of 50 to 70 mg/Kg/dose. Haematological parameters and erythrocyte glutathione (GSH) were not influenced by pelletization of the diet and no difference was found between WPC and casein groups. Independent of the protein type (casein or WPC) the effect of 5-Fluoruracila was less deleterious when the diets were offered prior to the chemotherapic treatment. Contrary to expected, sheep red blood cells did not stimulate higher production of erythrocyte GSH by the WPC. WPC decreased mucosites intensity better than casein protecting the mucosa during the most critical periods (72h after 2nd and 3rd doses of 5-FU) in the intestinal regions of major prevalence of mucositis (duodenum and jejunum). More studies are required to support the WPC benefit in the protection and recovery of the mucosa GIT in experimental animal models, and possibly in humans. In chapter 4, cells originated from patients with Acute Lymphoid Leukemia (ALL) from Centro Infantil Boldrini were inoculated in NOD/SCID mice. The animals were fed with commercial diet or AIN-93G diet with WPC or casein as the only protein source and used the chemotherapic vincristine sulfate. Body weight, diet ingestion, ratio between organs (kidney, spleen and liver) and body weight, leukemia evolution, survival time, haemogram and glutathione levels were evaluated. The cell lineages K562 (Chronic Myeloid Leukemia), Nalm-6 (B cell, ALL), Jurkat (T cell, ALL), CEM (T cell, ALL), RAMOS (Burkitt¿s Lymphoma) and HL-60 (AML) were used for the in vitro assays, in which WPC cytotoxicity (IC50), cell viability and glutathione levels were accessed in four different times (0, 24, 48 and 72h) and conditions (cells; cells + WPC; cells + WPC + ARA-C; cells + ARA-C). Data were submitted to statistic analysis by using the: Basic Statistics and Tables software. There was no differences between WPC and casein in relation to the parameters evaluated in vivo, with the exception of the analysis of Minimal Residual Disease (MRD), in which casein seemed to be more effective than WPC. Results on body weight, ratio between organs and body weight and evalution of leukemia were better for the WPC group when compared with animals fed commercial diet. No synergistic effect between the WPC and vincristine sulfate could be observed. In the in vitro experiments, WPC IC50 was 6,72 mg/mL for Nalm-6 and 11,84 mg/mL for CEM cells. K562, Nalm-6 and HL-60 cell lineages showed similar viability profiles. However, each lineage produced different total glutathione concentration in the culture medium, with a higher production achieved by HL-60 cells, followed by K562 cells / Doutorado / Nutrição Experimental e Aplicada à Tecnologia de Alimentos / Doutor em Alimentos e Nutrição