Reproduction de : Thèse de doctorat : Génie des procédés et de l'environnement : Toulouse, INPT : 2008. Reproduction de : Thèse de doctorat : Chimie : Beyrouth, Université Saint-Joseph : 2008. / Thèse soutenue en co-tutelle. Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 205 réf.

Thèse de doctorat : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie. Biologie moléculaire et cellulaire, génétique et virologie : Strasbourg 1 : 2007. Thèse doctorat : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie. Biologie moléculaire et cellulaire, génétique et virologie : Prague : 2007. / Thèse soutenue en co-tutelle. Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. f. 99-115.

Th.--Sci. phys.--Nancy--I.N.P.L., 1985.

Th.--Génie biochim.--Toulouse--I.N.P., 1984. N°: 80.

La mitose est une étape clé du cycle cellulaire, très préservée chez toutes les cellules eucaryotes, durant laquelle le matériel génétique de la cellule (les chromosomes) réparti de manière égale dans les deux cellules filles. Cette équipartition du matériel génétique est cruciale pour le maintien de la stabilité génétique. Durant ce processus, les chromosomes, composés des chromatides soeurs, établissent une plaque métaphasique au centre du fuseau mitotique. Chaque chromatide est attachée à un pôle du fuseau mitotique respectif (on parle d'attachement bipolaire) vers lequel elle se dirigera durant l'anaphase. Les chromatides sont l'unité indivisible du matériel génétique durant la mitose, à l'image des atomes dans une molécule. Initialement, une fois la chromatine condensée en chromosomes, chacun de ces " objets " est détaché et réparti suivant une position précise appellée territoires chromosomiques. Toute la complexité de la mitose est de capturer chacune des chromatides et de les positionner sur la plaque métaphasique avant leur séparation et migration vers leur pôle respectif durant l'anaphase. Cette étape de la division cellulaire requiert donc non seulement un réseau complexe d'interaction et de signalisation biochimique comme dans beaucoup d'autres processus biologiques mais aussi un fin contrôle spatio-temporel du mouvement et du positionnement de ces objets de grande taille à l'échelle de la cellule. Il semblerait que l'origine du mouvement des chromosomes provienne pour une grande part de la dynamique des microtubules. Ce qui est moins certain est la part relative accordée aux différents processus régulant cette dynamique; que ce soit la dynamique intrinsèque (appelée instabilité dynamique des microtubules) ou l'effet de différentes protéines sur les microtubules comme les MAPs (Microtubule Associated Proteins) et les kinésines (protéines motrices). On notera par ailleurs que le mécanisme de transfert d'énergie entre la dynamique des microtubules et le mouvement des chromosomes est encore très largement hypothétique. La dynamique des chromosomes durant la mitose est aussi largement contrôlée par un grand nombre d'acteurs autres que les microtubules. Certains d'entre eux étant responsables de l'attachement MTs-kinétochore comme les complexes NDC80 et DAM1, tandis que d'autres sont impliqués dans la régulation de la dynamique des microtubules comme la kinésine-8 et la kinésine-13. Durant mon travail de thèse, j'ai étudié la dynamique des chromosomes en mitose chez la levure à fission, modèle celulaire dont les mécanismes primordiaux qui contrôlent la mitose sont conservés avec les eucaryotes supérieurs. En effet, j'ai caractérisé deux de ces mécanismes conservés au cours de l'évolution: l'alignement des chromosomes durant la métaphase ainsi qu'un mouvement de va et vient plus ou moins régulier le long du fuseau aussi appelé oscillation des chromosomes. J'ai montré, en analysant les trajectoires des chromosomes que ces deux processus sont pour une large part indépendants [@Mary2015]. De plus, le processus d'alignement des chromosomes, encore mal compris, est en partie contrôlé par la kinésine-8 via une activité dépendante de la longueur des microtubules. Il semblerait donc que cette kinésine soit capable de fournir une information spatiale le long du fuseau mitotique afin de positionner correctement les chromosomes. Enfin, j'ai utilisé un modèle mathématique de la ségrégation des chromosomes précédemment développé dans l'équipe afin de tester de manière quantitative les hypothèses de mécanisme du centrage des chromosomes par la kinésine-8. L'ensemble de mon travail porte donc sur le contrôle du mouvement, de l'attachement et du positionnement des chromosomes durant la mitose afin de mieux comprendre les processus biophysiques associés à la mitose. / Mitosis is a highly preserved process in all eukaryotic cells during which the genetic material (chromosomes) is divided in two parts which spread in both daughter cells. This equipartition is crucial for maintaining genetic stability. During this process, chromosomes form a metaphasic plate at the center of the mitotic spindle. Each chromatid is attached to its respective spindle pole (called bipolar attachment) toward which it will move during anaphase. Chromatids are the indivisible units of genetic material during mitosis just like atoms in a molecule. Originally each of these "\ objects\ " are detached and organized in chromosomes territories. All the complexity of mitosis resides in the capture of each chromatid by the spindle pole to exert forces to position them on the metaphase plate before their separation and migration towards their respective poles in anaphase. This step of cell division not only requires complex interaction networks and metabolic signaling pathways just like many other biological processes but also a fine spatio-temporal control of movement and positioning of these big objects relative to cell size. It is usually accepted that the origin of chromosome movement arises from microtubule dynamics. However, what is less clear is the relative importance of each of these processes regulating chromosome movement: the intrinsic dynamic instability of microtubules or the effect of their associated proteins such as MAPs and kinesins. It is also important to note that the mechanism controlling the transfer of energy between microtubule dynamics and chromosome movement is still largely hypothetical. Moreover, chromosome dynamics during mitosis is regulated by a large number of actors apart from microtubules. Some of them being responsible for MT-kinetochore attachment such as NDC80 and DAM1 complex. While others are involved in the regulation of MT dynamics such as Kinesin-8 and Kinesin-13. During my PhD, I studied fission yest chromosome dynamic during mitosis. This cellular model has the advantage of sharing many fundamental mechanisms of symmetrically dividing higher eukaryotic cells. I characterized two of these conserved mechanisms: chromosome alignment during metaphase and back and forth movement along the spindle, called chromosome oscillation. By analyzing chromosome trajectories, I showed that both processes are performed through independent mechanisms [@Mary2015]. Moreover, chromosome alignment process, which is still poorly understood, is regulated by Kinesin-8 via a length dependent activity on microtubules. This suggests that Kinesin-8 is able to provide spatial information along the mitotic spindle to properly position chromosomes. Finally, I used a mathematical model of chromosome segregation in order to test quantitatively different hypotheses of chromosome centering process. This work is thus deciphering the control of movement, attachment and positioning of chromosomes during mitosis and seeks to better understand the biophysical processes controlling mitosis.

Le pétrissage et la fermentation des pâtes constituent deux étapes clé de la panification. Lors du pétrissage, l'oxygène incorporé à la pâte alimente en substrat oxydant les réactions d'oxydation, pour la plupart enzymatiques, conduisant au développement des réseaux de gluten et d'arabinoxylanes donnant à la pâte ses propriétés viscoélastiques et son aptitude à la rétention gazeuse. Lors de la fermentation, la production de dioxyde de carbone par la levure conditionne la levée du pâton. Un pétrin-fermenteur étanche, le sitoxygraphe, a été utilisé pour quantifier, à tout instant au cours du pétrissage et de la fermentation, la consommation d'oxygène et la production de dioxyde de carbone en distinguant la part de CO2 qui est retenue par la pâte de celle qui apparaît dans la phase gazeuse. Une modification de la formulation de la pâte de farine de blé – par l'ajout, seul ou en mélange, de levure, d'oses oxydases, de farine de fève ou de soja, de lipases – augmente sa consommation d'oxygène, et affecte sa teneur en acides gras polyinsaturés, son état d'agrégation des protéines et ses propriétés rhéologiques. Il existe, par exemple, une compétition pour l'utilisation de l'oxygène entre la levure, qui respire durant le pétrissage, et les oxydoréductases endogènes ou exogènes. Elle se traduit par une diminution des effets biochimiques et rhéologiques des oxydoréductases exogènes. L'utilisation d'atmosphères enrichies en oxygène en début de pétrissage devrait permettre de limiter ces compétitions et donc d'amplifier l'activité des oxydoréductases exogènes. / Kneading and fermentation of dough are two key steps in bread making. During kneading, incorporated oxygen into dough supplies in oxidizing substrate oxidation reactions, most of them are enzymatic, leading to the development of gluten and arabinoxylans networks giving dough viscoelastic properties and its ability to gas retention. During fermentation, the production of carbon dioxide by yeast determines the volume increase of the dough. An airtight knerder-fermenter, the sitoxygraphe, has been used to quantify, at any moment during of kneading and fermentation, oxygen consumption and carbon dioxide production by distinguishing the part of CO2 that is retained by dough from that which appears in the gas phase. A modification of dough formulation prepared with wheat flour - by adding one or a mix of, yeast, oses oxidases, horse bean or soybean flour, lipases - increases oxygen consumption and affects its content of polyunsaturated fatty acids, its protein aggregation and its rheological properties. For example, there is a competition for the use of oxygen between the yeast, which breathes during kneading and endogenous or exogenous oxidoreductases. It results in a decrease of rheological and biochemical effects of exogenous oxidoreductases. The use of atmospheres enriched with oxygen at the beginning of kneading should allow limiting these competitions and amplifying exogenous oxidoreductases activity.

La TriméthylGuanosine Synthase 1 de levure (Tgs1) à été identifiée à la suite d’un criblage double hybride en utilisant l’extrémité basique carboxy-terminale de la protéine SmB, cœur des snRNP, comme appât. Il a été également montré que Tgs1 interagit spécifiquement avec le domaine carboxyl-terminal basique KKD/E des protéines Nop58p et Cbf5p, deux composants protéiques du coeur des snoRNP. Le gène TGS1 n’est pas essentiel mais sa délétion confère un phénotype de cryo-sensibilité associé à un léger défaut d’épissage à basse température, associé à la rétention de U1 dans le nucléole. La recherche de substrats pour cette protéine a montré que Tgs1p est capable de méthyler la coiffe monométhylée des snARN et des snoARN transcrits par l’ARN polymérase II. La grande majorité des snoARN joue un rôle dans la sélection des sites de modifications de plusieurs classes d’ARN. Certains, par contre, sont impliqués dans la voie de synthèse des ribosomes, un processus comprenant de multiples étapes de clivages endo- et exoribonucléotidiques et ayant lieu dans le nucléole où les facteurs impliqués dans ces réactions se concentrent en plusieurs domaines distincts. Le point de départ de ce travail de thèse a été de tester un possible rôle de Tgs1p et/ou de la triméthylation dans la biosynthèse du ribosome. Dans un premier temps, l’analyse du processing des ARN ribosomiques dans la souche délétée pour TGS1 nous a permis de mettre en évidence l’implication de Tgs1 dans la formation de l’ARNr de la petite sous-unité, l’ARNr 18S. Des mutants catalytiques de Tgs1, incapables de reconnaître et de modifier les coiffes m7G, ont été crées. L’analyse de la voie de biogenèse des ribosomes dans ces souches ne présente pas les défauts constatés dans la souche délétée, révélant que c’est la protéine et non sa fonction catalytique qui est requise. De plus, ces mutants sont autant défectueux dans l’épissage des ARN messagers, excluant toute implication du défaut d’épissage dans le ralentissement de la voie de biogenèse des ribosomes observé dans la souche délétée. L’ultrastructure des souches délétées pour TGS1 observée en microscopie électronique nous a permis de mettre en évidence un effet de l’absence de Tgs1 sur la morphologie nucléolaire. En effet, le nucléole dans ces souches ne présente plus de nucléole structuré, bi-compartimenté. Les analyses en microscopie à fluorescence ont confirmé la disparition de la ségrégation des deux compartiments nucléolaires, suggérant que le défaut dans la biogenèse des ribosomes puisse être une conséquence de la perte de cohérence du nucléole. La caractérisation de l’environnement physique et fonctionnel de Tgs1 a été entreprise afin de mettre à jour des fonctions additionnelles de la protéine. Diverses approches ont été envisagées: la recherche de partenaires physiques par l’emploi d’un allèle de TGS1 étiquetté TAP permettant la purification puis l’analyse de partenaires physiques ainsi que la recherche de partenaires fonctionnels par la méthode du crible synthétique létal. La recherche de partenaires physiques a permis de révéler l’existence d’un grand nombre d’ARN non codants coprécipités avec Tgs1. Certains sont des substrats connus de la protéine mais un grand nombre d’ARN ne possédant pas de coiffes monométhylées. La recherche de partenaires fonctionnels a permis la découverte de candidats synthétiques létaux appartenant à deux groupes, un groupe lié à l’épissage des ARN messagers et un autre groupe constitué de membres du complexe SWR1, complexe impliqué dans la régulation transcriptionnelle par modification de la chromatine. Lors de ce crible de candidats synthétiques létaux, il est apparu que la délétion de TGS1 restaure partiellement le défaut de croissance à chaud induit par la délétion du gène RRP47, dont le produit est impliqué dans la maturation de l’extrémité 3’ de plusieurs types d’ARN non codants. Les travaux préliminaires effectués ne permettent pas encore d’expliquer un tel phénotype. Au cours de ce travail de thèse, nous avons pu répondre à un certain nombre de questions sur la fonction et le rôle de Tgs1 dans la cellule. La fonction catalytique de Tgs1 dans la méthylation des coiffes m7G est clairement nécessaire à l’efficacité de l’épissage des ARN messagers mais le rôle de la triméthylation de la coiffe des snoARN n’est pas élucidé à ce jour. Le fait que la fonction catalytique de Tgs1 n’est pas impliquée dans le défaut dans la biogenèse des ribosomes et la découverte du rôle de la protéine dans la morphologie nucléolaire, laisse entrevoir l’existence de fonctions additionnelles de Tgs1 dans la cellule. La caractérisation de son environnement physique et fonctionnel abonde justement dans ce sens, mettant à jour plusieurs interactions probablement liées à sa fonction catalytique, notamment dans l’épissage des ARN messagers mais également un grand nombre d’interactions impliquant la participation de Tgs1 dans d’autres voies métaboliques.

Le fer est un cofacteur enzymatique indispensable à la survie de tous les eucaryotes. La biodisponibilité du fer est à ce point critique que des mécanismes homéostatiques sont enclenchés afin d'en réduire la consommation en période de carence. Cette stratégie a pour but d'économiser le fer et de le conserver pour des processus cellulaires fer-dépendants essentiels à la survie cellulaire. Chez la majorité des eucaryotes, la nature de ces mécanismes est toujours inconnue. Mes travaux de doctorat ont donc porté sur l'élucidation du mécanisme par lequel la levure modèle Schizosaccharomyces pombe parvient à limiter l'utilisation de son fer lorsque celui-ci se raréfie. Lors de mes travaux, j'ai identifié trois gènes codant pour des composantes fer-dépendantes chez S. pombe qui subissent une répression lors d'une carence en fer : pcl1[indice supérieur +], sdh4[indice supérieur +] et isa1[indice supérieur +]. Il a été déterminé que des éléments en cis de type CCAAT sont au centre de leur expression différentielle. Des évidences génétiques et biochimiques ont montré qu'un hétérocomplexe protéique formé des sous-unités Php2/3/4/5 est impliqué dans la régulation fer-dépendante de la transcription de pcl1[indice supérieur +], sdh4[indice supérieur +] et isa1[indice supérieur +]. Plus précisément, c'est la sous-unité Php4 qui est responsable de la répression de leur expression en carence de fer. Il s'avère aussi que la transcription du gène codant pour Php4 (php4[indice supérieur +]) est elle-même régulée par le statut en fer. Il a d'ailleurs été démontré que le facteur de transcription de type GATA Fep1 réprime l'expression de php4[indice supérieur +] en présence de fer, et ce, en s'associant à son promoteur de manière fer-dépendante. Une étude à large spectre à l'aide de micropuces à ADN a révélé que, lors d'une carence en fer, Php4 réprime la transcription d'un régulon composé de 86 gènes, dont la majorité codent pour des protéines fer-dépendantes ou des composantes impliquées dans l'homéostasie du fer. Parmi ceux-ci se trouve le gène codant pour le répresseur Fep1 (fep1[indice supérieur +]). Cette découverte a mis au jour une boucle de régulation réciproque entre les facteurs de transcription Fep1 et Php4. La capacité de Php4 à réprimer directement la transcription a été confirmée par des essais de type simple-hybride. Ces essais ont également démontré que la fonction de Php4 est inactivée post-traductionnellement en présence d'ions de fer. Php4 est donc un régulateur transcriptionnel capable de jauger les niveaux de fer intracellulaires. L'étude de la régulation de la fonction de Php4 par le fer a permis de découvrir que le répresseur Php4 se localise au noyau lors d'une déficience en fer, tandis qu'il est exporté vers le cytosol par l'exportine Crm1 en présence de fer. Cet exportation nucléaire fer-dépendante implique la glutarédoxine Grx4. L'action inhibitrice de Grx4 sur la fonction de Php4 ne se limite pas à la régulation de sa localisation cellulaire. J'ai pu démontrer qu'en présence de fer, l'activité transcriptionnelle de Php4 est directement inhibée au noyau par Grx4. Cette régulation de Php4 par Grx4 s'avère directe étant donné l'association de ces deux protéines in vivo chez S. pombe. En conclusion, j'ai découvert que le répresseur Php4 est un élément central de la régulation de l'utilisation du fer chez la levure fissipare S. pombe . La découverte du rôle de Grx4 dans la régulation post-traductionnelle de Php4 pave la voie à l'élucidation d'un sentier signalétique par lequel une cellule eucaryote communique son statut en fer à ses régulateurs homéostatiques. La biodisponibilité du fer étant un facteur de virulence majeur chez les levures pathogènes, l'acquisition de nouvelles connaissances quant à la régulation de l'homéostasie du fer chez les mycètes devient cruciale pour le développement de nouveaux agents antifongiques.

L'objectif de mes travaux de doctorat était d'approfondir les connaissances sur le mode d'action du répresseur transcriptionnel Fep1 et de découvrir les mécanismes posttraductionnels par lesquels son activité serait régulée. Mes travaux ont été entrepris dans un contexte génétique php4[delta], où la régulation Php4-dépendante a été abolie. Ceci a permis d'exprimer Fep1 constitutivement et par conséquent d'étudier les effets directs du fer sur la protéine en la découplant de sa régulation transcriptionnelle par Php4. Dans le but de mieux caractériser la fonction de liaison à l'ADN de Fep1 dans un contexte in vivo, j'ai procédé par une approche d'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP). Grace à une protéine de fusion TAP-Fep1, j'ai démontré que Fep1 s'associe à la chromatine de manière fer-dépendante. En utilisant différentes versions mutantes de la protéine TAP-Fep1, j'ai démontré que la région N-terminale de Fep1 est requise pour la liaison à la chromatine, cette région couvrant les 241 premiers acides aminés. Le rôle de la région C-terminale serait d'assurer la répression transcriptionnelle des gènes cibles étant donné qu'elle s'associe avec les corépresseurs Tup. Au niveau de la région N-terminale de Fep1, plusieurs motifs sont nécessaires pour une liaison optimale de Fep1 à la chromatine, notamment, deux doigts de zinc (ZF1 et ZF2) et une région riche en résidus cystéines (CRD). Lorsque la région 1-241 est fusionnée au domaine VP16 de transactivation, cette nouvelle protéine agit comme un activateur fer-dépendant, ce qui suggère que le domaine de liaison à la chromatine de Fep1 agit de façon modulaire et ce, indépendamment de la région C-terminale de la protéine. Afin d'élucider le mécanisme post-traductionnel impliqué dans l'inactivation de Fep1 en situation de carence de fer, j'ai procédé par une approche génétique. Grâce à une délétion du gène qui code pour la monothiolglutarédoxine Grx4, j'ai pu démontrer son rôle dans l'inactivation de Fep1 en réponse à la carence en fer. En effet, dans une souche grx4A, Fep1 agit comme un répresseur transcriptionnel constitutif. J'ai pu démontrer que la présence de Grx4 est nécessaire pour assurer le relargage de Fep1 de la chromatine en réponse à la carence en fer. La monothiolglutarédoxine, Grx4, est caractérisée par la présence de deux domaines fonctionnels: un domaine en N-terminal appelé thiorédoxine (TRX) et un domaine C-terminal appelé glutarédoxine (GRX). L'étude d'interaction de Fep1 avec Grx4 a révélé que le domaine TRX interagit avec la région C-terminale de Fep1 et ce, de manière constitutive. Par contre, le domaine GRX de Grx4 s'associe avec la région N-terminale de Fep1 et ce, d'une manière fer-dépendante. De plus, dans une souche grx4[delta], le domaine GRX s'est révélé être nécessaire à la fonction d'inhibition de Fep1 en réponse à la carence en fer. Le régulateur Fep1 possède plusieurs homologues fonctionnels potentiels chez les levures filamenteuses pathogènes, notamment Sfu1 chez Candida albicans. Grâce à l'expression de la protéine Sfu1 dans une souche fep1[delta], nous avons révélé le haut degré de conservation entre ces deux facteurs de transcription. En effet, l'expression hétérologue de Sfu1 dans S. pombe restaure tous les phénotypes observés suite à l'inactivation du gène fep1[indice supérieur +]. En conclusion, durant mes travaux de doctorat, j'ai caractérisé des déterminants moléculaires qui dictent la fonction du répresseur transcriptionnel Fep1. Ainsi, j'ai déterminé des régions nécessaires de Fep1 qui assurent sa liaison à la chromatine. J'ai aussi identifié un nouveau mécanisme de régulation post-traductionnelle de Fep1 faisant intervenir la monothiolglutarédoxine Grx4. De plus, j'ai démontré le potentiel qu'offre la compréhension des mécanismes de régulation de l'homéostasie du fer chez la levure à fission, puisque ce modèle peut être transposé jusqu'à un certain degré aux autres levures pathogènes, notamment, C. albicans. Enfin, étant donné l'importance de l'assimilation du fer pour le pouvoir infectieux de plusieurs levures pathogènes, il devient évident que les modes de régulation de l'acquisition du fer doivent être élucidés afin de contrer les levures pathogènes"--Résumé abrégé par UMI

Les améliorations des technologies de séquençage offrent aujourd’hui la possibilité d’explorer la variabilité intraspécifique au sein d’une espèce à travers le séquençage complet du génome d’un grand nombre d’individus. Dans ce contexte, mes travaux de thèse se sont basés sur l’étude et la comparaison de la variabilité génomique à travers des études de génomique des populations au sein de plusieurs espèces de levures. Dans un premier temps, j’ai réalisé une étude systématique de la variabilité intraspécifique au sein de 6 espèces de levures, me donnant notamment la possibilité d’étudier la variabilité du contenu en gènes entre les espèces. Dans un second temps, je me suis focalisé sur l’utilisation des dernières technologies de séquençage dans l’objectif de produire une séquence de référence de Dekkera bruxellensis, dont l’absence pour un grand nombre d’espèces limite l’établissement d’étude de génomique des populations. Cette séquence a été utilisée dans un dernier temps afin d’étudier l’évolution de l’espèce. Dans l’ensemble, ces travaux apportent de solides fondations dans l’exploration de la diversité génétique au sein d’espèces non-modèles. / Advent of high throughput technologies as well as the reduction of their price open the way to the exploration of the intraspecific genetic variation at the species level by sequencing the complete genome of a wide range of individuals. Doing so, I first produced populations genomics studies of 6 yeast species based on the same framework, allowing the exploration and comparison of the genes repository of each species. I then used new sequencing technologies to produce a reference sequence for the yeast species Dekkera bruxellensis. Using this sequence, I was then able to produce for the first time a population genomic study at the genome wide scale for this species.