La création de nouvelles enzymes pour l’hydrolyse de la biomasse est une stratégie clé pour ledéveloppement du bioraffinage. Dans ce contexte, les xylanases de la famille GH11 sont déjàdéployées dans de nombreux procédés industriels et donc bien positionnées pour jouer un rôleimportant dans ces procédés. La cible de cette étude, la xylanase GH11 (Tx-Xyl) de la bactérieThermobacillus xylanilyticus, est une enzyme thermostable et donc une bonne candidate pour destravaux d’ingénierie visant l’amélioration de son activité sur des substrats ligno-cellulosiques.Dans cette étude, deux stratégies d’ingénierie des enzymes ont été employées afin d’obtenir denouvelles informations portants sur les relations structure-fonction au sein de Tx-Xyl. La premièrestratégie a consisté en l’utilisation d’une approche de mutagenèse aléatoire, couplée à l’emploi deméthodes de recombinaison in vitro. Ces travaux avaient pour objectif d’améliorer la capacitéhydrolytique de Tx-Xyl sur la paille de blé. La deuxième stratégie mise en oeuvre s’est appuyée surune approche semi-rationnelle visant la création d’une enzyme chimérique, qui bénéficierait d’uneamélioration des interactions enzyme-substrat au niveau du sous-site -3.Le premier résultat majeur de cette thèse concerne le développement d’une méthode de criblagequi permet l’analyse à haut débit de banques de mutants pour la détection de variants quiprésentent une activité hydrolytique accrue directement sur paille de blé. A l’aide de ce crible, nousavons pu analyser plusieurs banques de mutants, représentant un total de six générations demutants, et identifier une série de combinaisons de mutations différentes. D’un côté, un variant,comportant deux mutations silencieuses, permet une meilleure expression de Tx-Xyl, alors qued’autres enzymes mutées présentent des modifications intrinsèques de leurs aptitudes catalytiques.Comparés à l’enzyme parentale Tx-Xyl, certains mutants solubilisent davantage les arabinoxylanes dela paille et, lorsqu’ils sont déployés avec un cocktail de cellulases, participent à une réactionsynergique qui permet un accroissement du rendement des pentoses et du glucose libérés.A l’aide d’une approche semi-rationnelle, une séquence de 17 acides aminés en provenance d’unexylanase GH11 fongique a été ajoutée à l’extrémité N-terminale de Tx-Xyl, afin de créer de nouveauxbrins β. L’enzyme chimérique a pu être exprimée avec succès et caractérisée. Néanmoins, l’analysede ses propriétés catalytiques a révélé que celle-ci ne présente pas davantage d’interactions avec sonsubstrat dans le sous-site -3, mais les résultats obtenus fournissent de nombreux renseignements surles relations structure-fonction au sein de l’enzyme. De plus, ces travaux nous permettent depostuler que Tx-Xyl posséderait un site de fixation secondaire pour les xylanes, un élement jusqu’iciinsoupçonné dans cette enzyme. Par ailleurs, l’analyse de nos résultats nous permet de proposer uneexplication rationnelle pour l’échec de notre stratégie initiale / Engineering new and powerful enzymes for biomass hydrolysis is one area that will facilitate thefuture development of biorefining. In this respect, xylanases from family GH11 are already importantindustrial biocatalysts that can contribute to 2nd generation biorefining. The target of this study, theGH11 xylanase (Tx-Xyl) from Thermobacillus xylanilyticus is thermostable, and is thus an interestingtarget for enzyme engineering, aiming at increasing its specific activity on lignocellulosic biomass,such as wheat straw. Nevertheless, the action of xylanases on complex biomass is not yet wellunderstood, and thus the use of a rational engineering approach is not really feasible.In this doctoral study, to gain new insight into structure-function relationships, two enzymeengineering strategies have been deployed. The first concerns the development of a randommutagenesis and in vitro DNA shuffling approach, which was used in order to improve the hydrolyticpotency of Tx-Xyl on wheat straw, while the second strategy consisted in the creation of a chimericenzyme, with the aim of probing and improving -3 subsite binding, and ultimately improvinghydrolytic activity.The first key results that has been obtained is the development of a novel high-throughputscreening method, which was devised in order to reliably pinpoint mutants that can better hydrolyzewheat straw. Using this screening method, several generations of mutant libraries have beenanalyzed and a series of improved enzyme variants have been identified. One mutant, bearing silentmutations, actually leads to higher gene expression, while others have intrinsically altered catalyticproperties. Testing of mutants has shown that some of the enzyme variants can improve thesolubilization of wheat straw arabinoxylans and can work in synergy with cellulose cocktails torelease both pentose sugars and glucose.Using a semi-rational approach, 17 amino acids have been added to the N-terminal of Tx-Xyl, withthe aim of adding two extra β-strands coming from a GH11 fungal xylanase. A chimeric enzyme hasbeen successfully expressed and purified and its catalytic properties have been investigated.Although this approach has failed to create increased -3 subsite binding, the data presented revealsimportant information on structure-function relationships and suggest that Tx-Xyl may possess ahitherto unknown secondary substrate binding site. Moreover, a rational explanation for the failureof the original strategy is proposed.

La conversion de la biomasse lignocellulosique en biocarburants et molécules biosourcées produit des matrices liquides complexes thermosensibles qui couvrent une large gamme de polarités et de masses moléculaires. Les outils analytiques développés dans la littérature donnent une description partielle de ces matrices oxygénées. Pour en comprendre la réactivité et mieux guider le développement des procédés de conversion, une meilleure caractérisation est nécessaire. L’objectif de cette thèse est de démontrer l’apport d’une dimension de fractionnement pertinente en amont de techniques séparatives pour accéder à la caractérisation à l’échelle moléculaire d’échantillons ex-biomasse. Une déformulation complète et structurée par familles chimiques est visée, sans perte ni modification des composés. Deux voies de fractionnement ont été investiguées : (1) fractionnement par solubilité à l’aide de l’extraction liquide-liquide (LLE) et de la chromatographie de partage centrifuge (CPC) et (2) fractionnement par taille avec la chromatographie d’exclusion stérique (SEC). Ces techniques se veulent complémentaires à une analyse par chromatographie liquide à polarité de phase inversée avec détection par spectroscopie ultraviolet-visible et spectrométrie de masse haute résolution (RPLC-UV/HRMS). Des méthodes de fractionnement LLE, CPC et SEC ont été développées sur molécules modèles afin d’identifier les mécanismes et la sélectivité chimique mis en jeu. Des cartographies 2D inédites ont ainsi été obtenues, assurant un gain important en pouvoir résolutif et une structuration nouvelle des chromatogrammes en comparaison à l’approche RPLC-UV/HRMS. Dans un second temps, le potentiel des couplages SECxRPLC-UV/HRMS et CPCxRPLC-UV/HRMS pour la description de matrices complexes a été illustré via l’étude de deux échantillons issus d’expérimentations en unités pilotes et de compositions chimiques très différentes, représentant deux voies possibles de transformation (biochimique et thermochimique) de biomasse lignocellulosique. La complémentarité entre les approches de séparation mises au point a ainsi permis de doubler le nombre de pics détectés tout en bénéficiant de l’organisation chimique des composés. Cette aide précieuse à l’identification a été renforcée par les informations structurales délivrées via les différents modes de détection, en particulier l’HRMS. La compréhension de la structuration des cartographies 2D a été présentée et discutée afin de proposer la stratégie la plus adaptée pour déformuler complètement un échantillon en s’appuyant sur la mesure de descripteurs pertinents. Enfin, l’une des approches développée dans cette thèse a été mise en œuvre pour l’isolement sélectif et l’élucidation structurale de molécules clefs au sein d’une matrice complexe à l’aide d’expériences en fragmentation MS et spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) / The conversion of lignocellulosic biomass into biofuels and biosourced molecules produces complex thermosensitive liquid matrices which cover a wide range of polarity and molecular weight. Analytical tools developed in the literature only give a partial description of these oxygenated matrices. To understand the reactivity of these samples and optimize the development of conversion processes, a better characterization is required. The objective of this thesis is to demonstrate the interest of a relevant fractionation step prior to separation techniques to help the molecular characterization of biomass samples. The reverse engineering proposed for the sample is desired complete and chemically controlled (without loss or sample modification). Two fractionation pathways were investigated: (1) solubility fractionation with liquid-liquid extraction (LLE) and centrifugal partition chromatography (CPC) and (2) size fractionation with size exclusion chromatography (SEC). These techniques intend to be complementary to reversed-phase liquid chromatography hyphenated to ultraviolet-visible spectroscopy detection and high resolution mass spectrometry (RPLC-UV/HRMS). LLE, CPC and SEC methods were developed on model molecules to understand mechanisms involved and control the chemical selectivity. 2D contour plots were obtained, improving the resolving power and structuring chromatograms in comparison with RPLC-UV/HRMS. Then, SECxRPLC-UV/MS and CPCxRPLC-UV/MS hyphenations were applied to describe two complex samples from different substrates produced on experimental pilot units from two possible conversion pathways of lignocellulosic biomass (biochemical and thermochemical). The complementarity of separation modes allows to double the number of peaks detected, benefiting from the chemical organization of compounds. This constitute a support to identification also enhanced by multi-detection which provide additional structural information on compound detected, especially HRMS. Chemical organization in 2D contour plots were presented and discussed to propose the most adapted strategy to fully fractionate a sample based on the measurement of relevant descriptors. Finally, one of the fractionation approach developed in this thesis was used to isolate and structurally elucidate key molecules of a complex sample through MS fragmentation experiments and nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR)

L'objectif de la thèse est d'étudier la transformation de la fraction cellulosique de la biomasse en acide lévulinique. Cet acide est une molécule plateforme permettant un accès à de multiples produits, tels que des solvants, des monomères ou encore des molécules à plus forte valeur ajoutée.Nous proposons d'étudier la transformation de la cellulose en acide lévulinique catalysée par des solutions aqueuses concentrées en acides de Brønsted. La forte acidité de ces milieux et leur capacité à rompre les liaisons hydrogène de la cellulose rendent possible des réactions à température modérée (80°C), ce qui laisse espérer la production sélective d'acide lévulinique.L'état de l'art concernant la production d'acide lévulinique à partir de glucose ou de cellulose est d’abord présenté, ainsi qu’une étude bibliographique sur les techniques permettant la mesure d’acidité de milieux concentrés.La caractérisation de l’acidité des milieux semblant être un point clé pour contrôler la réaction, la seconde partie concernera les mesures d’acidité des milieux concentrés utilisés. La méthodologie expérimentale pour identifier et quantifier les produits de réaction de la cellulose ainsi que les paramètres critiques qui la régissent sont ensuite détaillés.Enfin l’étude s’achèvera par deux chapitres traitant de la transformation du glucose ou la cellulose en acide lévulinique dans des milieux comportant une forte acidité de Brønsted combinée, ou non, avec des sels métalliques. La transformation du glucose conduit à des sélectivités en acide lévulinique de 50 mol% dans l’acide sulfurique 65 % et supérieures à 70 mol% dans l'acide sulfurique 48 % en présence de chlorure d'aluminium hydraté. La transformation de la cellulose conduit à des sélectivités en acide lévulinique d'environ 43 mol% dans les milieux acides de Brønsted concentrés et 60 mol% lorsque des sels métalliques sont ajoutés. De telles sélectivités en acide lévulinique n'ont jamais été décrites dans les milieux concentrés. / The thesis presented in this document aims at converting lignocellulosic biomass into levulinic acid. This target is a valuable building block which can lead to various products.This platform intermediate can be obtained by acid-catalyzed conversion of cellulose contained in raw biomass. However, the state of the art concerning this acid-catalyzed reaction revealed that the current conditions (diluted acids in harsh temperature conditions) result in numerous by-products formation. The selectivity issue often deals with process control, in particular with reaction time optimization.Our approach lies in using concentrated Brønsted acids as alternative media to catalyze cellulose conversion. Indeed, the high acidity level allow the interaction with hydrogen bonds in cellulose fibrils and favor cellulose decristallization. This property should promote the transformation of cellulose into levulinic acid at lower temperature thus limiting the formation of by-products. Therefore, acidity measurements in such media have been developed and performed. An extensive study on glucose and Avicel cellulose conversion in concentrated aqueous solutions of sulfuric acid was performed at 80°C. Levulinic acid yields, up to 50 mol%, were determined by HPLC analysis and a special attention was dedicated to the identification and quantification of soluble or insoluble by-products, allowing the characterization of new species never described in aqueous solutions. Referring to the acidity levels previously determined, a comparison between acidity and catalytic results will be setted.Finally, the effect of metallic chloride addition on the transformation of glucose and cellulose in sulphuric acid solutions has been investigated, revealing improvements yielding up to 70 mol% levulinic acid. This range of selectivity is unprecedented at such a low temperature.

Abstract Lignocellulosic biomass is the most abundant renewable raw material on the earth and it is so far the most suitable and promising resource for the production of biofuels to replace long-term use of fossil oil. This research aims to convert lignocellulose-based industrial residuals, fibre sludge (FS) from a pulp mill and pine sawdust (PSD) from a sawmill, into platform sugars by two different bifunctionalised pretreatments of lignocellulosic biomass. The bifunctionalised pretreatment combines the ordinary pretreatment (deconstruction) of lignocellulosic biomass with lignocellulosic polysaccharides saccharification. The outcome from both pretreatments can be further transformed into biofuels and chemicals. PSD and FS were converted into platform sugars by acid-catalysed mechanical depolymerisation in a planetary ball mill in the first part of this research. The efficiency of the conversion was mainly affected by the transferred energy caused by collisions, the total milling time, acid concentration and moisture content in the reaction. Approximately 30 wt% of the sugars was yielded from PSD and FS both in the short milling process with a low acid/substrate (A/S) concentration without any prior treatment. The second part of this research focuses upon the conversion of FS into platform sugars using hydroxyalkylimidazolium hydrogen sulphate ionic liquids (ILs). Around 29 wt% of the sugars was produced from FS using an IL/water mixture. The added water acted as a co-solvent and played a critical role in the utilisation of these ILs. The blended water reduced the viscosity of the ILs and enhanced the mass transfer between solvent and solute. In addition, the anions of the ILs provided their acidic property in an aqueous solution and offered an acidic environment for hydrolysis simultaneously. / Tiivistelmä Lignosellulossapohjainen biomassa on runsaimmin saatavilla oleva ja yksi lupaavimmista raaka-aineista biopolttoaineiden valmistukseen korvaamaan fossiilisia polttoaineita. Väitöskirjassa tutkitaan teollisuuden lignoselluloosapohjaisten sivutuotteiden, selluteollisuuden kuitulietteen ja sahateollisuuden sahanpurun (mäntypuru), muuntamista sokereiksi kahdella erilaisella ns. bifunktionaalisella esikäsittelyllä, joissa yhdistyvät lignoselluloosabiomassan perinteinen esikäsittely (hajotus) ja polysakkaridien sokeroituminen. Muodostuneet sokerit voidaan edelleen muuntaa biopolttoaineiksi ja -kemikaaleiksi. Tutkimuksen ensimmäisessä vaiheessa sahanpuru ja kuituliete muunnettiin sokereiksi happokatalysoidussa mekaanisessa käsittelyssä, joka tehtiin kuulamyllyssä. Reaktiossa katalyyttisen käsittelyn tehokkuuteen vaikuttivat erityisesti jauhatuksen kineettinen energia, jauhatusaika, happokonsentraatio ja reaktioseoksen kosteus. Tulosten perusteella todettiin, että ilman lähtöaineen esikäsittelyä sekä sahanpurun että kuitulietteen sokerisaanto oli noin 30 massa% lyhyen, matalassa happokonsentraatiossa tehdyn jauhatuksen jälkeen. Tutkimuksen toisessa vaiheessa kuituliete muutettiin sokereiksi käyttämällä ionista liuotinta (IL), hydroksialkyyli-imidatsoliumvetysulfaattia. Sokerisaanto kuitulietteestä oli noin 29 massa% IL-vesiseoksessa. Vesi toimi reaktiossa apuliuottimena ja sen rooli on keskeinen ionisten liuottimien käytössä. Sekoittunut vesi laski ionisen liuottimen viskositeettia sekä edisti aineensiirtoa liuottimen ja liukenevan aineen välillä. IL:n anionit lisäsivät happamuutta vesiliuoksessa ja mahdollistivat happamat olosuhteet samanaikaiselle hydrolyysille. / Abstract Biomasse aus Lignocellulose ist der am häufigsten vorkommende nachwachsende Rohstoff der Erde und wird aktuell als eine der besten Alternativen für die Produktion von Biokraftstoffen gesehen. Diese sollen langfristig die fossilen Öl-basierten Produkte ersetzen. Diese Forschungsarbeit untersucht die Herstellung von Zucker aus Lignocellulose basierten Abfällen. Faserschlamm aus der Zellstoffindustrie und Kiefern-Sägemehl aus der Holzverarbeitung wurden durch zwei unterschiedliche Bifunktionelle Vorbehandlungen aufgespalten. Diese Bifunktionelle Vorbehandlung kombiniert zwei Schritte in einem Prozess; die gewöhnliche Dekonstruktion der Biomasse und die Verzuckerung von Polysacchariden aus der Lignocellulose. Das so erzeugte Produkt dient als Ausgangsstoff für die weitere Herstellung von Biokraftstoffen und Chemikalien. Im ersten Teil dieser Forschungsarbeit wurden Kiefern-Sägemehl und Faserschlamm in einer Planeten-Kugelmühle zermahlen und gleichzeitig durch eine Säure depolymerisiert. Der Wirkungsgrad dieser säurekatalysierten mechanischen Depolymerisation wurde hauptsächlich durch die Übertragung der Reibungsenergie, der Mahldauer der Zerkleinerung, der Konzentration der Säure und der Feuchtegehalt der Proben beeinflusst. Etwa 30 wt% Zucker wurde so durch den kurzen Zermahlungsprozess aus Kiefern-Sägemehl und Faserschlamm gewonnen. Dabei wurden die Proben nicht vorbehandelt und enthielten eine geringe Säure/Probe Konzentration. Der zweite Teil der Forschungsarbeit untersucht die Umwandlung von Faserschlamm in Zucker mittels der Ionischen Flüssigkeit (ILs) Hydroxyalkyl Imidazolium Hydrogensulfat. Aus den Faserschlamm Proben konnte 29 wt% Zucker durch eine Mischung von ILs und Wasser gewonnen werden. Das zugesetzte Wasser spielte als Co-Lösemittel eine wichtige Rolle in der Nutzung der Ionischen Flüssigkeit, dessen Viskosität so reduziert wurde. Dies führte zu einem erhöhten Stoffübergang zwischen dem Lösemittel und dem Solvat. Zusätzlich sorgten die Anionen der Ionischen Flüssigkeit für ein saures Milieu in der wässrigen Lösung und ermöglichten so eine gleichzeitige Hydrolyse.