Orientador: Jose Vassallo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-13T20:55:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moreira_LucianaRegina_D.pdf: 5414614 bytes, checksum: f35e45f7f891a1120abd69e0862a2875 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Contexto: A angiogênese e linfangiogênese são processos em que as células endoteliais se dividem e migram para a formação de novos capilares, dando suporte para a progressão tumoral. A mensuração destes processos pode discriminar diferentes extratos prognósticos no câncer. O valor prognóstico da determinação da angiogênese e linfangiogênese no carcinoma colorretal (CRC) é assunto controverso na literatura. Isto pode ser devido a variações na forma de análise, como local de quantificação dentro da amostra tumoral, escolha do marcador imunoistoquímico e o método de quantificação. No presente trabalho, a angiogênese e linfangiogênese são estudadas através de programas de análise de imagem, comparando métodos de quantificação (densidade microvascular - MVD versus estimativa da área vascular total - TVA), diferentes marcadores imunoistoquímicos (pan-endoteliais versus vasos neoformados) e áreas de análise (campo central da lesão versus periferia versus campo de invasão mais profunda no carcinoma). Objetivos: Comparar esses parâmetros entre adenomas de pacientes sem e com carcinoma na mucosa adjacente; compará-los nos tecidos colorretais não neoplásicos, em adenomas e carcinomas, além de encontrar um meio de quantificação de angiogênese e linfangiogênese que fosse mais fidedigno como fator prognóstico no CRC. Métodos: 60 CRC esporádicos, 30 adenomas e 10 tecidos colorretais não neoplásicos foram submetidos a estudo imunoistoquímico para a detecção dos antígenos CD31, CD34, CD105, VEGF-A, VEGF-C e D2-40. Imagens dos preparados imunoistoquímicos foram capturadas para avaliar a MVD e a TVA em um programa de análise de imagem. Também foram analisadas a porcentagem e a intensidade de expressão protéica de VEGF-A e VEGF-C nas células carcinomatosas. Resultados: A imunocoloração da maioria dos marcadores, bem como a expressão de VEGF-A e VEGF-C, mostraram aumento estatisticamente significante nos adenomas e carcinomas quando comparados com tecido não neoplásico para MVD e TVA nos diversos campos da lesão. Os adenomas de pacientes com carcinoma apresentaram aumento estatisticamente significante na TVA determinada pelo CD105 (p= 0,019) e na MVD determinada pelo D2-40 (p= 0,041), quando comparadas com os adenomas de pacientes sem carcinoma. Dentre os carcinomas, apenas a MVD determinada pelo marcador CD34 no campo central da lesão diferencia-se estatisticamente com a recorrência/metástase (p= 0,04) e a sobrevida (p= 0,02). Conclusões: Os achados apóiam o fato da angiogênese e o aumento da vascularização linfática ocorrer precocemente, ainda nos adenomas. Também corroboram o fato de que angiogênese e aumento da contagem de vasos linfáticos ocorram mais em adenomas de pacientes com carcinomas na mucosa adjacente, possivelmente influenciados por fatores produzidos pelo tumor. A MVD na área central do carcinoma determinada pelo marcador imunoistoquímico CD34 adiciona critério prognóstico, associando-se com recidiva/metástase e sobrevida, enquanto os outros meios de quantificação vascular e de expressão de fatores de crescimento não apresentaram resultados estatisticamente significantes. Este método é um fator prognóstico independente e adicional no CCR / Abstract: Background: Angiogenesis and lymphangiogenesis play an important role in the progression of solid tumors, and its quantification may be associated with prognostic stratification. However, the prognostic value of the assessment of angiogenesis and lymphangiogenesis in colorectal cancer (CRC) is still controversial. This may be due to variations in the methods of analysis, as the precise location of assessment within a tumor sample, the choice of immunohistochemical markers and the quantification system. In the present study, angiogenesis and lymphangiogenesis were assessed using image analysis software, comparing two methods of quantification (microvessel density - MVD versus estimation of the total vascular area - TVA), different immunohistochemical markers (pan-endothelial versus neovessel) and areas of analysis (periphery versus inner portions of the lesion versus the deepest invasion area of carcinoma). Objectives: To compare angiogenic and lymphangiogenic patterns in adenomatous polyps from patients without and with sporadic CRC; to compare angiogenesis and lymphangiogenesis in non neoplasic colorectal tissue, adenomas and cancer, and to search for a reliable approach to quantify angiogenesis and lymphangiogenesis, which could be of clinical value as prognostic factor in CRC. Methods: 60 sporadic CRC, 30 colorectal adenomas and 10 non neoplasic colorectal tissues were submitted to immunohistochemical analysis for CD31, CD34, CD105, VEGF-A, VEGF-C and D2-40. MVD and TVA were determined by digitalizing the immunohistochemical reactions and examining them by computer image analysis. Immunostaining for VEGF-A and VEGF-C was evaluated using a parameter based on the percentage of tumor area stained and staining intensity. Results: Staining for most markers, as well as for VEGF-A and VEGF-C, exhibited significant increase in adenomas and carcinomas, when assessment of MVD and TVA in different tumor fields was compared with non neoplastic colorectal tissues. Adenomas from patients with carcinoma showed significantly higher values of TVA determined by immunostaining for CD105 (p = 0.019) and of lymphatic MVD determined by D2-40 (p = 0.041) when compared with adenomas from patients without cancer. Among patients with CRC, only MVD determined by immunostaining for CD34 in the central areas of the tumor was significantly correlated with recurrence/metastasis (p=0.04) and survival rates (p=0.02). Conclusions: Our results support that angiogenesis and lymphatic vascularization, plays a role in early tumor development at the stage of adenoma formation. The findings further support the notion that neoangiogenesis and elevated lymphatic vessel counts occur in colorectal adenomas from patients with CRC when compared to those without carcinoma, possible under the influence of factors produced by the carcinoma. Our results suggest that MVD determined with staining for CD34 in the inner part of the tumor is more closely related with relapse/metastasis and survival than other means of vascular quantification. The method is an additional prognostic factor in CCR / Doutorado / Anatomia Patologica / Doutor em Ciências Médicas

Orientador: Edgard Graner / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-21T21:26:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bastos_DeboraCampanella_D.pdf: 2999887 bytes, checksum: 8cc36631bdfe28b13c872fff12fdf00e (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A enzima ácido graxo sintase (FASN) é responsável pela síntese endógena de ácidos graxos e tem alta expressão em diversas neoplasias malignas. Cerulenina e orlistat são inibidores farmacológicos da atividade de FASN e têm sido descritos como potenciais agentes anti-tumorais. O sistema linfático constitui a via primária de metástases de diversas neoplasias malignas, dentre elas o melanoma. Em estudos prévios, realizados no Laboratório de Patologia Bucal da FOP-UNICAMP, a inibição da FASN com orlistat foi capaz de reduzir significantemente as metástases linfonodais em modelo murino de melanoma e no modelo ortotópico de carcinoma espinocelular oral. Além disso, o meio condicionado por células de melanoma humano tratadas com inibidores da FASN inibiu a formação de capilares in vitro em matrigel, efeito este mediado pela isoforma anti-angiogênica VEGF-A165b. A correlação entre a FASN e a linfangiogênese ainda não está descrita na literatura, neste trabalho investigamos os efeitos da inibição farmacológica da FASN sobre os fatores de crescimento endotelial vascular (VEGF-C e -D) em células de melanoma murino (B16-F10) e humano (SK-Mel-25) através de RT-PCR quantitativo e ELISA e verificamos os efeitos do bloqueio de FASN sobre a linfangiogênese por meio de culturas tridimensionais de células endoteliais linfáticas humanas (HDLEC) e culturas primárias de endotélio linfático de camundongo. Avaliamos também, o efeito da exposição de células SK-Mel-25 os inibidores da FASN sobre a proliferação de xviii células HDLEC. O tratamento de células B16-F10 e SK-Mel-25 com cerulenina ou orlistat modulou de forma diferencial a expressão de VEGF-C e -D, inibindo o primeiro ao mesmo tempo em que estimulou o último. Além disto, estas mesmas drogas reduziram em células endoteliais linfáticas a viabilidade, a proliferação, migração e formação de capilares em ensaio ex vivo, além de provocar apoptose. O tratamento com inibidores farmacológicos de FASN em células SK-Mel-25 também induziu um fenótipo anti-linfangiogênico, observado em experimentos com meio condicionado. Em conjunto, nossos resultados sugerem que a inibição farmacológica da FASN inibe a linfangiogênese por atuar ao mesmo tempo nas células dos vasos linfáticos e de melanoma. Esses resultados explicam, pelo menos em parte, a redução do número de metástases linfonodais em modelos animais tratados com orlistat e reforçam a teoria de que o bloqueio da FASN é um alvo terapêutico em potencial para os melanomas / Abstract: Fatty acid synthase (FASN) is responsible for de novo synthesis of long-chain fatty. FASN has emerged as a potential therapeutic target for human cancers since it's over expression is associated with depth of invasion and poor prognosis. Cerulenin and orlistat are pharmacological inhibitors of FASN and have been described as potential anti-tumor agents. Lymphatic vessels are the primary route of metastasis in several malignancies including melanomas. In previous studies performed in our laboratory, we demonstrated that FASN activity is essential for melanoma and oral squamous cell carcinoma progression, as its pharmacological inhibition with orlistat reduces lymphatic metastasis in both experimental intraperitoneal and subcutaneous melanomas and orthotopic tongue carcinomas. We also reported that cell culture medium previously conditioned by human melanoma cells in the presence of orlistat induces an anti-angiogenic phenotype mediated by VEGFA165b. Therefore, in order to understand a possible correlation between FASN and lymphangiogenesis, here we investigate the effects FASN inhibitors on the secretion of vascular endothelial growth factors (VEGF) -C and -D by murine (B16-F10) and human (SK-Mel-25) melanoma cells with the aid of qRT-PCR and ELISA assays. We also analyzed the effect of FASN blockage on tridimensional cultures of human lymphatic endothelial cells (HDLEC) and primary cultures of murine lymphatic endothelium. In addition, we also evaluated an indirect effect of the treatment with cerulenin and orlistat in SK-Mel-25 cells on HDLEC xx proliferation. The incubation of B16-F10 or SK-Mel-25 cells with cerulenin or orlistat modulated VEGF-C and -D expression by significantly inhibiting the former and increasing the latter. In addition, these drugs reduced the viability, proliferation, and migration as well as promoted apoptosis in human lymphatic endothelial cells (HDLEC). These compounds also inhibited lymphatic capillary formation in a murine ex vivo assay. Finally, conditioned media from orlistat-treated human melanoma cells resulted in an anti-lymphangiogenic phenotype. These data suggest that FASN inhibitiors reduce lymphangiogenesis by acting simultaneously in the lymphatic endothelium and melanoma cells. Taken together, the studies here presented explain, at least in part, the anti-metastatic effect of orlistat observed in experimental tumors and further suggest that FASN is a potential therapeutic target for melanomas / Doutorado / Patologia / Doutora em Estomatopatologia